Id2基因过表达对C57BL/6小鼠免疫表型的影响

目的:建立分化抑制因子2(ID2)过表达和CD45.1,CD45.2嵌合体小鼠模型,探讨ID2过表达(ID2^(o/o) )对C57BL/6小鼠免疫表型的影响。方法:利用基因编辑技术获得ID2^(o/o) C57BL/6模型小鼠,采用PCR、琼脂糖凝胶电泳和Western blot对小鼠进行基因型鉴定。Western blot检测ID2^(o/o) 和WT小鼠脾脏细胞中各种ID蛋白(ID1~ID4)表达情况。流式细胞术绝对定量方法检测WT和ID2^(o/o) 小鼠脾脏和外周血细胞中各免疫细胞数量。构建骨髓1∶1竞争性嵌合体小鼠模型,以同样方法检测CD45.1^(+)和CD45.2^(+)白细胞及相应免疫细胞数量。结果:PCR和Western blot结果表明ID2^(o/o) 小鼠构建成功。在ID2^(o/o) 小鼠脾细胞中,4种ID蛋白的表达量均显著高于WT小鼠。流式细胞分析结果显示,Id2基因过表达使C57BL/6小鼠脾脏和外周血中的中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞、CD4^(+)T细胞、CD8^(+)T细胞、Treg细胞和NK细胞数量显著增多,该趋势在骨髓嵌合小鼠中也得到进一步验证。结论:Id2基因过表达可增强C57BL/6小鼠体内免疫细胞的分化和发育,提高小鼠各种免疫细胞数量。

Id2在SVZa神经干细胞向神经元分化中的作用

目的研究DNA结合抑制物2(inhibitor of DNA binding2,Id2)在室管膜前下区(anteriorsubventricularzone,SVZa)神经干细胞向神经元分化中的作用。方法体外分离培养P0昆明小鼠SVZa神经干细胞,正义Id2、反义Id2真核表达质粒转染SVZa神经干细胞,采用流式细胞仪检测在Id2作用下SVZa神经干细胞分化为神经元的比例。采用Western blot检测不同浓度的骨形成蛋白2(bonemorphogenenticprotein2,BMP2)诱导下Id2蛋白的表达变化。结果正义Id2真核表达质粒转染组,SVZa神经干细胞分化为神经元的比例小于空白对照组,反义Id2真核表达质粒转染组,SVZa神经干细胞分化为神经元的比例明显高于空白对照组;随着BMP2浓度的增加,Id2的表达增加。结论Id2抑制体外培养的P0SVZa神经干细胞向神经元方向分化,BMP2可以促进SVZa神经干细胞Id2的表达,它们共同参与调控SVZa神经干细胞向神经元分化的过程。

Id2从核迁移到细胞质后通过调节凋亡诱导因子表达促进骨骼肌细胞分化

目的探讨Id2在骨骼肌再生中的作用机制。方法用绿色荧光蛋白(GFP)-Id2-C2表达载体转染C2C12成肌细胞,对转染组和非转染组进行H2 O2处理和2%马血清处理,用RT-PCR法观察两组细胞Id2基因表达的差异;Western blotting观察两组细胞的成肌分化相关蛋白的表达情况;免疫荧光显微镜观察正常组、纤维损伤组以及去神经支配组大鼠的骨骼肌中Id2和凋亡诱导因子(AIF)蛋白的表达情况。结果与非转染组相比,Id2转染组细胞成肌分化明显增强。免疫荧光染色法显示,50μmol/L H2O2能增加核Id2蛋白的表达。在氧化应激条件下,Id2能抑制成肌调节因子(MyoD)而活化肌浆蛋白(myogenin)。2%马血清能引起大多数Id2从细胞核迁移到细胞质,从而抑制活性氧(ROS)诱导的线粒体AIF表达。免疫荧光分析显示,去神经支配组大鼠的骨骼肌中细胞内的Id2和AIF蛋白表达增多。结论 Id2从细胞核迁移到细胞质后能促进骨骼肌细胞分化,其作用与AIF表达水平相关。

Id2和MMP9的表达及其与食管鳞癌的临床病理特征关系研究

目的观察细胞分化/DNA结合抑制因子2(Id2)和基质金属蛋白酶9(MMP9)在食管鳞癌组织中的表达,探讨Id2和MMP9表达的意义及相关性。方法应用免疫组织化学方法检测70例食管鳞癌和30例正常食管上皮中Id2和MMP9的表达水平。结果食管鳞癌中Id2和MMP9的阳性表达率均显著高于正常食管上皮(P<0.01);Id2和MMP9的表达水平均随食管鳞癌的浸润加深、临床TNM分期级别增高而升高,浸润深度在T3+T4组的表达水平高于T1+T2组(P<0.05),临床Ⅱ期和Ⅲ、Ⅳ期的表达水平高于Ⅰ期(P<0.05),但Id2和MMP9的表达均与食管鳞癌的分化程度无显著相关(P>0.05)。淋巴结转移组中MMP9的表达水平高于无淋巴结转移组(P<0.05);而Id2的表达与淋巴结转移无显著相关(P>0.05);食管鳞癌组织中Id2和MMP9的表达水平呈正相关关系(P<0.05)。结论 Id2和MMP9在食管鳞癌的发生和浸润进展中存在协同促进作用,同时检测对于评估食管鳞癌的生物学行为和预后有重要意义。

FHL2通过相互作用抑制Id2的功能活性

分化抑制蛋白2(Id2)通过抑制碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)类转录因子的功能活性调控多种组织细胞的分化发育,并参与人类多种肿瘤的发生与进展.Id2相互作用蛋白可能调控其翻译后的功能活性.本研究以HLH结构域缺失的Id2作为诱饵蛋白,采用酵母双杂交方法对MCF-7 cDNA文库进行筛选,识别了1个新的Id2相互作用蛋白FHL2(属于LIM蛋白家族的一员),哺乳动物双杂交实验系统验证了Id2与FHL2之间的相互作用,同时证实,该作用不依赖于Id2中的HLH结构域;GST-pulldown、免疫共沉淀方法,进一步证实FHL2/Id2之间的相互作用;免疫荧光共定位实验结果证实,FHL2/Id2相互作用主要发生在细胞核内;共转染实验结果发现,FHL2通过相互作用阻抑了Id2对bHLH类转录因子E47的功能抑制活性.总之,本研究识别了1个新的Id2相互作用蛋白FHL2,通过直接的相互作用,FHL2抑制了Id2的功能活性,FHL2可能参与调控Id2介导的细胞分化与发育过程,并可能参与肿瘤的发生与进展.

美国教学设计理论从ID1到ID2的发展

第二代教学设计的发展是人们目前关注的热点。本文概述了美国教育技术专家梅瑞尔 (Merrill)在两篇文章中有关ID2的观点 ,分析、比较了这两代教学设计理论在内容上的差异 ,并探究了从ID1到ID2发展中比较深层次的原因和动力。

不同应激条件下分化抑制因子Id2在成肌细胞C2C12中的表达与分布

目的观察在不同应激条件下成肌细胞C2C12中Id2的表达与细胞分布情况,并探讨其表达与分布变化的机制。方法体外培养C2C12细胞,分别采用不同浓度H2O2氧化应激诱导细胞增殖或凋亡,不同浓度的促炎症信号LPS诱导细胞增殖,以及2%马血清诱导细胞分化。利用RT-PCR比较不同应激条件下Id2 mRNA的表达,同时利用免疫荧光检测Id2蛋白的表达强度和细胞分布。结果25μmol/l和50μmol/l的H_2O_2诱导下,Id2 mRNA表达比对照组分别增高80.5%和55.5%,荧光显著增强,Id2呈现细胞核与细胞质均匀分布。100 ng/ml和500 ng/ml的LPS亦诱导Id2 mRNA表达,较对照组增高21.7%和40.2%,荧光增强,但此时Id2以细胞核分布为主,细胞质少量分布。在2%马血清诱导成肌细胞分化后,Id2 mRNA表达显著降低,荧光显著减弱,并以细胞质分布为主。结论不同应激条件下Id2在成肌细胞中呈现不同的表达和分布,与其对骨骼肌损伤后再生的调控作用密切相关,表明Id2是骨骼肌损伤后再生的重要调控分子。

HLH缺失型Id2在酵母双杂交系统中的表达及自激活检测

目的:构建HLH结构域缺失的DNA结合抑制因子(Id2)诱饵质粒,并检测其在AH109酵母中的表达及表达产物对酵母的有无毒性作用和对报告基因的有无转激活作用。方法:用重叠延伸PCR方法将Id2中的HLH结构域缺失,并插入到pGBKT7载体,构建BD:Id2-DBM-δHLH融合诱饵质粒,将构建成功的诱饵质粒转化AH109感受态酵母菌中,检测其是否具有自激活作用及对酵母的毒性作用,用Western blot方法检测其在酵母中表达的融合蛋白。结果:成功构建Id2的HLH缺失体,Id2的HLH缺失体在酵母中能够正确表达,对AH109酵母无毒性作用,对报告基因无自激活作用。结论:HLH结构域缺失型Id2蛋白适用于采用酵母双杂交系统筛选其相互作用蛋白。

白血病患者白细胞中分化抑制因子Id2 mRNA的表达

目的:探讨分化抑制因子Id2基因在白血病白细胞中的表达状况。方法:应用RT-PCR半定量分析16例急性非淋巴细胞白血病(ANLL),10例慢性粒细胞白血病(CML)白细胞中Id2的mRNA表达水平。结果:Id2基因在急性非淋巴细胞和慢性粒细胞白血病患者外周血白细胞中的表达水平均增高,有统计学意义(P<0.05),但两者间比较无统计学意义。结论:Id2基因在白血病细胞中的表达明显增高,可能与白血病的发病有一定相关性。

Id2在三碘甲状腺氨酸调节大鼠室管膜前下区神经干细胞分化中的作用

目的探讨三碘甲状腺氨酸(triiodothyronine,T3)对大鼠室管膜前下区(anterior subventricular zone,SVZa)神经干细胞(neural stem cells,NSCs)分化为少突胶质细胞的影响及转录因子Id2的表达变化。方法离体培养新生大鼠SVZa来源的NSCs,应用免疫细胞化学技术观察加入T3后对NSCs分化细胞种类、比例的影响,以及不同分化时间Id2表达的变化情况。结果在正常自然培养的未分化NSCs中Id2表达较强,分化2h和12h时表达较弱,随后逐渐增强。加入T3后,细胞分化加速,Id2表达较对照组高(P<0.05),但此时少突胶质细胞数量增多,而星形胶质细胞数量减少。结论T3可能通过增加Id2的表达从而促进体外培养的SVZa NSCs向少突胶质细胞分化,而抑制其向星形胶质细胞分化。

用于双分子荧光互补技术的Olig1/Id2基因真核表达载体的构建和鉴定

目的:构建pBiFC-VN173-Olig1和pBiFC-VC155-Id2真核表达质粒,并进行鉴定。方法:以pEGFP-N3-Olig1真核表达质粒为模板扩增出Olig1基因,与pBiFC-VN173载体连接,构建pBiFC-VN173-Olig1真核表达质粒;利用RT-PCR方法从新生大鼠脊髓中提取Id2基因片段,与pBiFC-VC155载体连接,构建pBiFC-VC155-Id2真核表达质粒。对此2种质粒进行酶切鉴定、测序。结果:通过酶切鉴定、测序,证明pBiFC-VN173-Olig1和pBiFC-VC155-Id2重组质粒序列和编码框均正确构建成功。结论:成功构建了pBiFC-VN173-Olig1和pBiFC-VC155-Id2真核表达质粒,为进一步在活细胞内研究Olig1和Id2的相互作用提供了实验基础。

FHL2调控Id2功能活性的研究

目的:探讨FHL2对Id2蛋白功能的调控效应。方法:将E47、5xE-Box-Luc、pRL-SV40、Id2以及FHL2表达载体分别共转染MCF-7、293T以及SH-SY5Y细胞,双荧光素酶报告基因方法检测不同转染组细胞中的相对荧光素酶活性。结果:三个细胞系中E47均显著上调了报告基因的表达,Id2抑制了E47的转录激活活性,而FHL2通过与Id2相互作用显著消弱了Id2对E47功能的抑制效应。结论:通过相互作用FHL2抑制了Id2蛋白的功能活性,FHL2是一个新的Id2蛋白功能抑制子。

外源性分化抑制因子Id2在C_2C_(12)细胞中的表达

目的:构建大鼠Id2基因真核荧光表达载体,并观察外源性Id2基因C_2C_(12)细胞中的表达。方法:RT-PCR扩增出Id2全长cDNA,T4 DNA连接酶将载体pGEM-T和Id2 cDNA进行连接,构建克隆载体,经限制性内切酶EcoR I酶切pGEM-Id2克隆载体和pEGFP-C2真核表达栽体,构建出重组真核表达载体pEGFP-C2-Id2,经酶切分析、PCR鉴定及DNA测序证实cDNA片段大小和序列的正确性;通过电穿孔转染法将外源性Id2基因导入C_2C_(12)成肌细胞中。分别于转染4、8、12、24、36、72 h后通过荧光倒置显微镜下观察细胞整体情况,并计算转染效率。结果:经酶切分析和序列测定证实pEGFP-C2-Id2含大小正确的正向Id2 cDNA片段,获得高转染率和高表达外源性Id2基因的C_2C_(12)细胞,转染8 h时,转染效率约为(10.5±2.8)%;转染12 h后,转染效率约为(20.9±3.1)%;转染24 h后,转染效率最高,约为(60.8±3.2)%。结论:成功构建了同时携带有G418筛选位点和Id2基因的真核表达载体;并获得高表达外源性Id2基因的C_2C_(12)细胞。

稀有密码子对人源Id2基因表达的影响

目的:通过对人Id2基因的稀有密码子进行突变并构建原核表达重组质粒,在大肠杆菌(escherichia coli,E.coli)中表达Id2蛋白,分析稀有密码子对Id2基因表达的影响。方法:PCR扩增突变Id2基因序列,然后转入E.coli BL21中进行表达,利用镍离子亲和层析、离子交换层析及分子筛纯化。结果:正确构建了Id2基因的基因突变表达质粒,基因突变表达的Id2蛋白在E.coli BL21中为可溶性上清表达,成功纯化了目的蛋白,且分子筛结果显示其在溶液中呈现二聚体状态。结论:稀有密码子对Id2蛋白在E.coli BL21中大量可溶性上清表达有重要影响。

食管鳞状细胞癌组织中Id1和Id2的表达及其意义

目的研究Id1、Id2在食管鳞状细胞癌中的表达及其意义。方法采用免疫组织化学SP法和图像分析技术检测122例食管鳞状细胞癌及90例癌旁正常组织中Id1、Id2的表达情况。结果122例食管鳞状细胞癌中Id1、Id2表达高于癌旁正常组织(P<0.01);Id1、Id2表达强度与患者的性别、年龄、淋巴结转移未见明显相关性(P>0.05);Id1表达高分化与低分化组差异有显著性(P<0.05);Id2的表达与肿瘤的分化程度成负相关(P<0.05),且与肿瘤浸润深度正相关(P<0.05)。结论Id1、Id2的高表达可能是食管鳞状细胞癌一个重要的分子学改变,Id2可作为判断食管鳞状细胞癌生物学行为的潜在指标。

RNA干扰Id2基因表达抑制PC-3前列腺肿瘤干细胞的增殖及侵袭能力

背景:Id基因是碱性螺旋-环-螺旋因子的内源性负性调节因子。该因子参与细胞的增殖、分化和生存,并在不同类型肿瘤的进展和浸润过程中表现出功能的多样性。目的:探讨沉默Id2基因表达对人前列腺肿瘤干细胞增殖和侵袭能力的影响。方法:取对数生长期的PC-3人前列腺癌细胞,采用无血清悬浮培养法分离肿瘤干细胞球,流式细胞仪检测肿瘤干细胞表面标记CD44^+CD24^-表达。构建sh RNA-Id2表达载体,转染至前列腺肿瘤干细胞,以未转染的前列腺肿瘤干细胞为对照。转染后48 h,采用RT-PCR与Western blot实验检测前列腺肿瘤干细胞Id2基因及蛋白的表达;采用MTT法、Transwell小室检测前列腺肿瘤干细胞的增殖和侵袭能力;采用Western blot与RT-PCR检测前列腺肿瘤干细胞上皮标志物E-钙黏蛋白、间质细胞标志物波形蛋白及上皮细胞-间充质转化调控转录因子Twist的表达。结果与结论:(1)采用无血清悬浮培养法成功分离出肿瘤干细胞球,第3代前列腺肿瘤干细胞表面标记CD44^+CD24^-表达率为(85.69±8.96)%,显示培养的肿瘤干细胞球高表达肿瘤干细胞表型;(2)转染后48h,sh RNA-Id2转染组细胞Id2基因及蛋白表达明显低于未转染组(P <0.05),显示成功干扰了前列腺肿瘤干细胞Id2表达;(3)shRNA-Id2转染组前列腺肿瘤干细胞的增殖速度和侵袭能力低于未转染组(P<0.05);(4)sh RNA-Id2转染组前列腺肿瘤干细胞的上皮标志物E-钙黏蛋白表达高于未转染组(P<0.05),间质细胞标志物波形蛋白、上皮细胞-间充质转化调控转录因子Twist表达低于未转染组(P <0.05);(5)结果表明,RNA干扰Id2基因表达可通过调控E-钙黏蛋白、波形蛋白及Twist表达抑制前列腺肿瘤干细胞的增殖及侵袭能力。

Id2在成年大鼠喙侧神经干细胞迁移流通道的表达

目的 明确Id2在成年大鼠脑内室管膜前下区(SVZa)、喙侧迁移流(RMS)、嗅脑(OB) 3个不同区域内的表达模式。方法 用RT PCR和免疫荧光染色的方法观察成年大鼠SVZa、RMS、OB 3个区域Id2的表达情况。结果 成年大鼠脑内SVZa、RMS、OB 3个区域Id2均有不同程度的表达,且在这3个部位中Id2在OB区表达最弱,在SVZa表达较强,在RMS表达最强。结论 确立Id2在成年大鼠SVZa、RMS、OB 3个区域的表达模式,提示Id2可能对成年SVZa神经干细胞的增殖和定向分化起到一定的调节作用。

Id2在小鼠家族性腺瘤性息肉病发生中的作用

目的研究DNA结合抑制物2(inhibitor of DNA binding2,Id2)在ApcΔ716/+小鼠家族性腺瘤性息肉病(familial adenomatous polyposis,FAP)发生中的作用。方法 Id2基因缺失的基因工程小鼠和家族性腺瘤性息肉病模型ApcΔ716/+小鼠杂交后,统计ApcΔ716/+小鼠与ApcΔ716/+Id2-/-杂交小鼠小肠肠道息肉的数目及总负荷,通过Western blot及原位杂交技术测定腺瘤性息肉Id2的表达。结果腺瘤性息肉组织中Id2蛋白及mRNA表达明显升高,相比ApcΔ716/+Id2野生型小鼠,ApcΔ716/+Id2-/-杂交小鼠肠道息肉总数目与不同大小的肠道息肉数目有明显减少(P均<0.05)。结论肠道腺瘤性息肉组织中Id2表达升高,Id2的缺失能抑制ApcΔ716/+小鼠肠道腺瘤性息肉的发生,Id2在人类家族性腺瘤性息肉病中可能发挥着促进肠道息肉形成的作用。

子宫内膜异位症患者子宫内膜组织中ID2、PRELP、SMOC2基因表达和临床意义

目的观察子宫内膜异位症患者子宫内膜组织中ID2、PRELP、SMOC2基因表达并分析其临床意义。方法选取2016年3月至2018年1月于郑州人民医院诊治的子宫内膜异位症患者102例为试验组,另选取同期本院收治的98例子宫肌瘤患者为对照组。qRT-PCR法检测两组子宫内膜组织中ID2、PRELP、SMOC2mRNA表达量,Western blot法检测子宫内膜组织中ID2、PRELP、SMOC2蛋白表达情况,观察患者临床指标并分析其与ID2、PRELP、SMOC2的相关性,制作受试者工作特征曲线(ROC),分析ID2、PRELP、SMOC2在子宫内膜异位症中的诊断效能,Logistic多元回归分析影响子宫内膜异位的相关因素。结果试验组患者子宫内膜组织中ID2、PRELP、SMOC2mRNA表达量及蛋白表达水平均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);试验组患者子宫内膜组织中ID2与VEGF、IL-1β及CA125呈正相关(P<0.05),PRELP与VEGF、TNF-α及CA125呈正相关(P<0.05),SMOC2与IL-1β及CA125呈正相关(P<0.05);ROC曲线分析显示,子宫内膜组织中ID2、PRELP、SMOC2对子宫内膜异位症具有临床诊断价值;Logistic多元回归分析显示,子宫内膜组织中ID2、PRELP及SMOC2均为子宫内膜异位症患者的危险因素。结论子宫内膜异位症患者子宫内膜组织中ID2、PRELP、SMOC2基因表达升高,且与患者临床指标呈正相关,三者均参与病情发生进展过程,可作为临床诊断及监测子宫内膜异位症的重要指标。

bFGF在局灶性脑缺血后内源性神经干细胞增殖过程中对Id2的影响

目的检测DNA结合抑制物2(inhibitor of DNA binding 2,Id2)在大鼠脑缺血再灌注海马组织神经干细胞中的表达及bFGF的干预作用。探讨影响神经干细胞增殖分化的分子调控机制。方法采用大脑中动脉栓塞(MCAO)制作大鼠脑缺血再灌注模型。用免疫组织化学法检测海马神经干细胞BrdU、Id2的表达及bFGF的干预作用。结果随着脑缺血再灌注第3天缺血海马神经元BrdU阳性细胞明显增多,第7天达高峰,Id2反应产物脑缺血再灌注第3天较正常组增多,随缺血再灌注时间的延长逐渐增多,第7天表达最强,以后表达逐渐减少。注射bFGF后BrdU、Id2的表达明显增加。结论 bFGF促进神经干细胞的增殖及缺血脑组织Id2的表达,提示bFGF促进神经干细胞增殖作用可能由Id2信号介导。