草鱼的两种新型免疫球蛋白基因IgZ-2和IgM-IgZ

在草鱼中新发现的两种免疫球蛋白重链的cDNA和基因组序列,其中的一种IgZ命名为IgZ-2,以区别于已报道的IgZ,另一种只有两个恒定区,一个恒定区与IgM相似而另一个与IgZ相似,这一特征与已报道的鲤的IgM-IgZ相似,故同样称为IgM-IgZ。分泌型IgZ-2的cDNA序列包含1889bp,编码539个氨基酸,其3'编码区包含267bp,但缺乏5'非编码区及部分可变区序列。分泌型IgM-IgZ的cDNA全长为1316bp,编码361个氨基酸,其5'非编码区包含3bp,3'非编码区包含227bp。膜结合型IgM-IgZ由两个膜外显子与CH2中的一个剪切位点剪切而成。氨基酸序列比对结果显示IgZ-2和IgM-IgZ的恒定区存在保守的半胱氨酸。系统进化树分析显示,草鱼IgZ-2以较高的支持率与斑马鱼IgZ聚为一枝,再与草鱼IgZ、草鱼IgM-IgZ和鲤IgM-IgZ这一枝聚为一类。用半定量RT-PCR检测IgZ-2和IgM-IgZ在4条草鱼的器官/组织中的表达,发现分泌型IgZ-2、分泌型IgM-IgZ和膜结合型IgM-IgZ在4条鱼中的表达存在个体差异,但主要都在免疫器官中表达。

草鱼IgM、IgD和IgZ的抗体制备与组织表达分析

根据已报道的草鱼免疫球蛋白IgM、IgZ和IgD的序列设计表达引物进行PCR扩增,将扩增片段克隆至表达载体pET-32a,并在大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)中进行诱导表达。利用亲和层析法纯化表达的重组蛋白,然后免疫日本大耳白兔,获得兔抗IgM、IgZ和IgD的抗血清。经免疫印迹检测,表明IgM、IgZ和IgD的表达产物能够被兔多克隆抗体特异性识别。应用兔抗草鱼IgM和IgZ的多克隆抗体,对草鱼多种器官、组织提取的总蛋白进行免疫印迹检测,在肠、头肾、中肾、皮肤、脾脏、脑、鳃和血液中都检测到IgM和IgZ的表达。

斜带石斑鱼IgM、IgZ和IgD重链基因的克隆

应用RACE方法获得斜带石斑鱼膜结合型免疫球蛋白M（membrane-bound immu-noglobulin M,mIgM）,膜结合型免疫球蛋白D（mIgD）,分泌型免疫球蛋白Z（secretory immu-noglobulin Z,sIgZ）的重链基因。斜带石斑鱼膜结合型IgM重链恒定区包含3个恒定区结构域（μ1,μ2,μ3）以及两个跨膜外显子（TM1,TM2）,TM1外显子与μ3结构域末端相连接。氨基酸序列相似性分析结果显示,斜带石斑鱼mIgM各恒定区与牙鲆mIgM恒定区相似性最高,为53%-78%。mIgD的cDNA全长为3 375 bp,开放阅读框包含3 006 bp,其恒定区由1个μ1外显子,7个δ外显子以及跨膜区组成。斜带石斑鱼IgD恒定区与鳜IgD各恒定区氨基酸序列相似性最高,δ1-δ7的相似性分别为75.5%、75.8%、65.4%、76.6%、88.1%、90.6%、82.8%,TM结构域为82.7%。sIgZ的基因结构与其他硬骨鱼类sIgZ的结构相似,包括4个外显子和3个内含子,内含子长度分别为222、129和458 bp。利用半定量PCR分别检测了这3种基因在斜带石斑鱼各器官/组织中的表达,发现mIgM在头肾、肾脏、脑、脾脏、肠、鳃、心脏和胸腺中均有表达;mIgD的mRNA在头肾、肾脏以及胸腺中有较高的表达,在肠中表达量较低;sIgZ mRNA主要分布于淋巴组织如头肾、肾及脾脏中,而在鳃、心脏和胸腺中的丰度较低。

剑尾鱼IgZ基因的克隆及疫苗免疫对其在组织中表达的影响

为研究剑尾鱼igZ基因序列及其在疫苗免疫后的表达规律，本实验根据已知的EST库设计引物，利用RT-PCR等方法，获得剑尾鱼冶z基因cDNA全长序列，并进行生物信息学分析和疫苗免疫后组织表达分析。结果显示，剑尾鱼堙z基因全长序列为5420bp，包含4个外显子和3个内含子；cDNA序列全长1527bp，包含一个1299bp的完整ORF框，该基因编码432个氨基酸，预测其编码蛋白的分子量大小为47．48ku，并具有IgZ的基本结构，与其他硬骨鱼类IgZ氨基酸序列一致性为28％～54％。荧光定量PCR分析结果显示，增z基因主要在剑尾鱼的头肾、脾脏和肠中分布，且疫苗免疫后11天内，lgZ基因在头肾、脾脏和肠组织中均表现为先上升后下降的趋势。头肾中IgZ基因的表达量在第4天时最高，为对照组的2．12倍；脾脏中IgZ基因在第4天时呈现最高峰，为对照组的4．65倍；肠组织中坛z基因的表达量在12h时有一个小高峰，第2天时最高，为对照组的11．41倍。本研究获得了剑尾鱼坛z基因cDNA全长序列，并对其表达规律进行了初步研究，发现IgZ在肠道黏膜免疫中具有重要作用，这将为进一步验证其在黏膜免疫中的作用以及剑尾鱼作为疾病研究模式动物和疫苗免疫评价模型奠定基础。

斜带石斑鱼IgZ重链基因的表达纯化和抗体制备

为获得斜带石斑鱼IgZ重链基因的多克隆抗体,成功构建了斜带石斑鱼免疫球蛋白IgZ重链重组蛋白表达质粒pQE30/IgZ,将其转化到大肠杆菌表达菌株M15中,确定了最佳诱导表达条件:IPTG 0.2 mmol/L,诱导温度30℃,诱导时间6 h。所获得的IgZ重链重组蛋白经Ni-NTA亲和层析后,纯度达到85%以上;以纯化的IgZ重链重组蛋白为抗原免疫新西兰兔,制备出相应的多克隆抗体,经ELISA测定抗血清效价约为1∶320 000。

基于IGZO的阻变存储器的研究

阻变存储器(RRAM)是新一代存储技术的理想代表之一,利用旋涂法和喷墨打印法制备了Ag/IGZO/ITO结构的RRAM,首先在ITO玻璃上旋涂IGZO薄膜,再在IGZO薄膜上打印Ag,制备MIM结构的器件,并使用半导体参数分析仪(KEITHLEY-4200A-SCS)测试其电学性能,测试结果显示其具有双极组变特性。