IHH 过表达对鸡原代软骨细胞增殖和分化的影响

为探究印度刺猬因子(IHH)基因对鸡原代软骨细胞增殖和分化的调控作用,本研究根据IHH基因序列信息,构建真核过表达载体(OV-IHH);采用双酶切和测序进行鉴定,并将其转染鸡原代软骨细胞;采用CCK-8法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡,对软骨细胞进行成骨诱导分化至21 d,采用ALP试剂盒检测细胞ALP活性。结果表明,IHH真核过表达载体构建成功,与对照组和空载体组(OV-NC)相比,过表达组IHH基因的mRNA表达显著增加(P<0.01),过表达效率扩大2700倍左右。过表达IHH促进细胞周期从G1期到S期的转换,从而促进增殖,抑制细胞凋亡,且ALP活性升高,促进细胞分化。综上,IHH基因显著影响鸡软骨细胞的生长发育,研究结果为进一步解析IHH基因调控鸡匍匐性状的作用机制提供理论依据。

中医不同治法对骨质疏松症小鼠骨骼、骨骼肌Ihh含量影响的比较研究

目的观察不同治法对骨质疏松症小鼠骨骼、骨骼肌Ihh含量变化的影响,探讨中医防治骨质疏松症的作用机制。方法除正常组外,将OPG基因敲除小鼠随机分为5组,即模型对照组(模型组)、补肾中药组(补肾组)、健脾中药组(健脾组)、活血化瘀中药组(活血组)和对照药组(福善美组)。采用酶联免疫法测定小鼠骨骼、骨骼肌Ihh含量变化。结果 1与正常组比较,模型组小鼠骨骼肌的Ihh含量显著降低(P<0.01);与模型组比较,补肾组小鼠骨骼肌的Ihh含量明显升高(P<0.05),其次为健脾组(P<0.05)。2与正常组比较,模型组小鼠骨骼的Ihh含量显著降低(P<0.01);与模型组比较,补肾组小鼠骨骼肌的Ihh含量明显升高(P<0.01),其次为健脾组(P<0.01),活血组和福善美组升高程度也比较明显(P<0.01)。结论 1骨质疏松症的形成,可能与骨骼、骨骼肌Ihh含量异常变化有关。2补肾、健脾方法通过提高骨质疏松症大鼠的骨骼、骨骼肌Ihh的含量,对骨质疏松症具有一定的防治作用。

牦牛Ihh基因组织表达分析、SNP检测及其基因型组合与生产性状的关联分析

为了研究牦牛Ihh基因多态位点基因型组合与生产性状间的相关性,发现与牦牛生产性状相关的分子标记,同时进一步研究Ihh基因在牦牛和黄牛各个组织的分布和表达,试验采用高分辨率熔解曲线分析技术(High resolution melting curve,HRM)进行基因型分型和统计等位基因频率,同时,运用荧光定量PCR分析Ihh基因在牦牛和黄牛不同器官的表达差异。试验结果表明,Ihh基因在牦牛和黄牛的所有组织中均表达。然后采用SHEsis和PHASE软件对Ihh基因多态位点进行配对连锁不平衡和单倍型分析,采用SPSS17.0进行多态位点单倍型组合与生产性状关联性分析。结果检测到牦牛Ihh基因外显子3的2个多态位点5855(C/T)和6383(G/A)。群体遗传学分析显示,2个多态位点均表现为高度多态(PIC>0.25);χ2检验表明,甘南牦牛和大通牦牛群体在两个突变位点处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05),而天祝牦牛在2个突变位点处未达到Hardy-Weinberg平衡(P<0.05);多态位点配对连锁不平衡分析发现,2个突变位点之间存在强连锁平衡,有4种单倍型组合;基因型组合主要发现了3种。关联分析表明,Ihh基因2个突变位点的3种基因型组合对牦牛体斜长、体高、胸围、管围和体重有显著差异(P<0.05),具有CTGA基因型组合的牦牛个体在体斜长、体高、胸围、管围和体重方面显著高于CCGG和TTAA型(P<0.05)。因此,综上推断Ihh基因基因型组合与牦牛体斜长、体高、胸围、管围和体重存在相关性。

Ihh-PTHrP信号轴介导髁突软骨细胞对压力微环境改变的调控研究

目的 探究Ihh-PTHrP负反馈信号通路与静压力下髁突软骨细胞生物学响应的关系。方法 体外分离培养4周龄健康雌性新西兰大白兔髁突软骨细胞,100 kPa静压力条件下,分别对P2代髁突软骨细胞进行0、1、2、3、4 h的加压处理;采用Western印迹的方法比较分析髁突软骨细胞COL2A1、Ihh和PTHrP的蛋白表达变化;通过RT-qPCR检测分析静压力对Ihh和PTHrP基因水平表达的影响;选取0 h和3 h组,使用扫描电子显微镜扫描分析静压力对髁突软骨细胞形态的影响;采用SPSS19.0软件包对数据进行统计学分析。结果 Western印迹实验发现：压力加载3 h后,COL2A1出现明显高表达;Ihh蛋白表达在0-2 h内逐渐升高,在2-4 h内却逐渐降低;PTHrP在0-2 h内蛋白表达逐渐升高,并在2-4 h内维持着一个较高水平的表达。RT-qPCR检测发现Ihh在压力加载1 h时出现明显高表达,而PTHrP则在2 h时出现明显高表达。100 kPa静压力加载3 h后,髁突软骨细胞突起增多、变长。结论 兔髁突软骨细胞对压力微环境的改变具有一定的适应能力;适宜的静压力可以提高髁突软骨细胞的成软骨能力;Ihh-PTHrP负反馈信号通路参与髁突软骨细胞对压力微环境改变的适应性改建过程。

白藜芦醇对人甲状腺乳头状癌IHH4细胞增殖和凋亡的影响

目的:观察白藜芦醇对人甲状腺乳头状癌细胞(IHH4)增殖和凋亡的影响,并初步探讨其可能的机制。方法 :采用CCK-8法检测白藜芦醇对IHH4细胞增殖的影响;倒置显微镜、透射电镜、DAPI染色观察细胞的形态学变化;细胞免疫荧光和Western blot法检测细胞内cleaved caspase-3蛋白的表达;应用流式细胞技术(flow cytometry,FCM)观察细胞周期和凋亡的改变。结果:1白藜芦醇可以呈时间和浓度依赖性抑制IHH4细胞增殖;2与正常对照相比,加入白藜芦醇后IHH4细胞皱缩、变圆、脱落,细胞质中出现大小不等的空泡,胞质内容物增多;透射电镜下细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;DAPI染色后荧光显微镜下观察,细胞核呈致密浓染;3细胞免疫荧光和Western blot显示,随着白藜芦醇作用浓度和时间的增加cleaved caspase-3蛋白的表达明显增加;4流式Annexin V-FITC/PI双染检测显示白藜芦醇呈浓度依赖性诱导IHH4细胞凋亡。白藜芦醇可引起细胞S期阻滞。结论:白藜芦醇可抑制人甲状腺乳头状癌IHH4细胞增殖,诱导IHH4细胞凋亡。白藜芦醇阻滞细胞于S期,可能是抑制IHH4细胞增殖、促使其凋亡的原因之一。

IHH-Gli信号通路在CIA大鼠滑膜成纤维细胞增殖中的作用

目的初步探讨IHH-Gli信号通路在胶原诱导型关节炎(collagen induced arthritis,CIA)大鼠滑膜成纤维细胞(synovial fibroblast,SF)增殖中的作用。方法注射胶原诱导CIA大鼠模型,采用组织块贴壁法培养大鼠膝关节SF,免疫荧光法检测Vimentin鉴定细胞纯度,免疫荧光法检测IHH-Gli通路相关分子(IHH、Ptc、Smo及Gli1)的表达情况,给予GANT61阻断IHH-Gli信号通路,观察细胞形态变化、CCK8法检测细胞增殖情况、免疫荧光法检测糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)表达变化情况。结果病理及影像学检查显示CIA模型建立成功,培养的细胞95%以上均表达Vimentin,CIA-SF表达IHH、Ptc、Smo及Gli1蛋白,且CIA-SF表达IHH蛋白较正常SF高,10μmol/L及15μmol/L的GANT61能显著抑制CIA-SF的增殖,且降低GSK-3β的蛋白表达水平。结论 IHH-Gli信号通路参与CIA-SF的增殖机制,可能成为研究RA治疗药物的新靶点。

一短指家系临床特征调查及IHH基因的突变分析

目的探讨广东省一个汉族A1型短指(brachydactyly type A1)家系的临床特征及致病原因。方法在获得知情同意后对该家系成员进行病史采集和临床检测,并对其中7例患者和7例正常亲属采血进行DNA提取,采用聚合酶链反应结合DNA直接测序法对IHH基因的外显子进行突变检测。结果该家系的短指症为A1型,常染色体显性遗传;所有患者第二至第五手指和脚趾的中节指(趾)骨缺失,末节指(趾)骨短小,第一手指的远侧和近侧指骨均缩短;7例患者在IHH基因对应cDNA序列存在G391A(E131K)杂合突变,7例正常亲属均未发现该突变。结论中国广东汉族A1型短指家系的发病机制是IHH基因发生了E131K错义突变所致。

血管内皮生长因子调节成骨细胞中Ihh和p38 MAPK的表达

目的探讨血管内皮生长因子(VEGF)对大鼠成骨细胞Ihh和p38 MAPK的调节作用。方法取胎鼠颅盖骨分离培养成骨细胞,采用实时PCR检测成骨细胞中Ihh及其受体Ptch1和p38 MAPK的表达,检测成骨细胞在不同浓度(0,2,20 ng/ml)及不同时间(0,12,24 h)的VEGF作用下Ihh和p38 MAPK的表达情况。结果成骨细胞表达Ihh及其受体Ptch1,同时表达p38 MAPK。随着VEGF浓度的增加I,hh和p38 MAPK的表达量均明显增加;随着VEGF作用时间的增加I,hh和p38 MAPK的表达量与对照组相比有明显的增长趋势。结论 Ihh与其受体Ptch1在成骨细胞中共表达I,hh以自分泌方式调节成骨细胞功能;VEGF上调成骨细胞中Ihh和p38 MAPK的表达,并且VEGF可能通过调节p38 MAPK的表达而影响Ihh的表达,可能存在VEGF-p38 MAPK-Ihh通路。

Ihh-PTHrP信号轴调控髁突软骨内成骨相关机制的研究进展

Ihh-PTHrP信号轴调控软骨内成骨过程。近年来,国内外学者对Ihh-PTHrP信号通路的调控机制给予了广泛的关注,相关的调控机制屡见报道,对髁突软骨内成骨机制研究的需求日趋迫切。国内外许多文献报道了相关因子在Ihh-PTHrP信号轴中的重要角色,发现了一些具有指导意义的成果。通过对近几年国内外相关文献的总结归纳,对该信号轴调控髁突软骨内成骨的相关机制研究做一综述。

circ_0072088通过调控miR-532-3p/WEE1轴促进甲状腺癌IHH4细胞的恶性生物学行为

目的:探讨circ_0072088对甲状腺癌IHH4细胞恶性生物学行为的影响及其可能的机制。方法:选取2015年4月至2019年3月于青海大学附属医院就诊的确诊为甲状腺癌后接受切除手术且术前未进行任何治疗的48例甲状腺癌患者的甲状腺癌组织及其对应癌旁组织。根据GEO数据集(GSE93522)分析鉴定甲状腺乳头状癌中差异表达的circRNA。用qPCR法检测circ_0072088在甲状腺癌组织和细胞中的表达水平。采用CCK-8法和Transwell法检测circ_0072088和miR-532-3p过表达对甲状腺癌IHH4细胞增殖、迁移和侵袭的影响。采用生物信息学和双荧光素酶报告基因实验验证甲状腺癌细胞中circ_0072088与miR-532-3p、miR-532-3p和WEE1基因之间的关系。结果:circ_0072088在甲状腺癌组织和细胞中呈高表达(P<0.05或P<0.01)。circ_0072088过表达促进了甲状腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭(P<0.05或P<0.01),而转染miR-532-3p模拟物能够减弱这种作用(P<0.05或P<0.01)。此外,机制研究表明,circ_0072088可以与miR-532-3p靶向结合,且WEE1是miR-532-3p的下游靶基因。结论:circ_0072088通过调控miR-532-3p/WEE1轴促进IHH4细胞的增殖、迁移和侵袭。

甲状旁腺相关蛋白及其受体PTH1R及Ihh信号在鼠胚髁突软骨中的分布特征

目的 探讨甲状旁腺相关蛋白（PTHrP）及其受体PTH1R及Ihh信号在髁突软骨发育过程中的分布特征及意义。方法 取E14～18d鼠胚，以免疫组化及原位杂交染色方法，检测PTH1R抗体及PTHrP、Ihh mRNA在下颌髁突软骨发生过程中的分布特征。结果 在鼠胚下颌髁突软骨发育过程中，PTHrP、PTH1R主要表达于软骨膜间质细胞、软骨细胞及大部分肥大软骨细胞中，Ihh主要位于肥大软骨细胞上层及其与扁平细胞层交界处，PTHrP及Ihh信号可能通过自分泌和（或）旁分泌作用调控髁突软骨细胞的增殖和分化。结论 鼠胚下颌髁突软骨发育过程中，PTHrP、PTHA1R、Ihh的分布特征与其在生长板分布不同，提示PTHrP可能对髁突全层软骨细胞均具有增殖促进作用。

Ihh信号在胚胎发育期软骨内成骨中的调控机制

在胚胎发育期间,躯干和四肢骨与大部分颅面骨架均通过软骨内成骨而形成,在间充质细胞向软骨细胞、前肥大软骨细胞、肥大软骨细胞及终末分化的过程中,一系列分子信号的精密调控在正常软骨内成骨中发挥着重要作用,其中Ihh信号通过自身直接作用以及与PTHrP、BMP、FGF、CREB等信号共同调节软骨细胞的增殖和分化,在胚胎早期软骨内成骨中发挥着重要的核心调控作用。

18α-甘草次酸对IHH-4细胞FTO表达及增殖、迁移的影响

目的:评价肥胖相关基因(fat mass and obesity associated gene,FTO)蛋白在人甲状腺乳头状癌IHH-4细胞中的表达、生物学作用及18α-甘草次酸(18α-Glycyrrhetinic acid,AGA)对该细胞FTO表达的影响。方法:体外培养IHH-4细胞,取对数生长期细胞进行实验;采用MTT和Transwell迁移实验评价不同浓度的AGA(80、160、320μmol/L)对IHH-4细胞增殖和迁移能力的影响;通过RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术沉默肥胖相关基因(fat mass and obesity associated gene,FTO)的表达;采用Western blot法评价AGA处理前后FTO、周期蛋白依赖性激酶4(cyclin-dependent kinase 4,CDK4)和Cofilin-1的表达。结果:不同浓度的AGA均能显著抑制IHH-4细胞的增殖及迁移,差异具有统计学意义(P<0.05);IHH-4细胞高表达FTO、CDK4和Cofilin-1;RNAi下调IHH-4细胞FTO后导致CDK4和Cofilin-1表达水平显著降低(P<0.05),IHH-4细胞的增殖及迁移能力亦显著下降;AGA处理显著减少了IHH-4细胞中FTO、CDK4和Cofilin-1的表达水平(P<0.05);经RNAi处理48 h的IHH-4细胞再加入AGA无法进一步降低FTO、CDK4和Cofilin-1的表达水平及增殖、迁移能力(P>0.05)。结论:FTO在促进人甲状腺乳头状癌细胞的增殖及迁移中具有重要作用;AGA通过控制FTO的表达抑制IHH-4细胞的增殖及迁移。

运动对Ihh/PTHrP信号通路调控骨形成的影响研究

骨形成主要是通过膜内成骨和软骨内成骨两种方式进行的。膜内成骨侧重于调控骨长粗,而软骨内成骨则负责骨生长。之前大量研究均证实运动有助于骨健康,促进骨形成,而且均致力于膜内成骨,尚鲜有提及软骨内成骨方面。因此,本研究主要从软骨内成骨的角度着手,探讨运动调节Ihh/PTHrP信号通路达到促进软骨内成骨并增加青春期的峰值骨量、促进骨生长的机制。

Wnt7b can replace Ihh to induce hypertrophic cartilage vascularization but not osteoblast differentiation during endochondral bone development

Indian hedgehog （Ihh） is an essential signal that regulates endochondral bone development. We have previously shown that Wnt7b promotes osteoblast differentiation during mouse embryogenesis, and that its expression in the perichondrium is dependent on Ihh signaling. To test the hypothesis that Wnt7b may mediate some aspects of Ihh function during endochondral bone development, we activated Wnt7b expression from the R26-Wnt7b allele with Col2-Cre in the Ihh-/- mouse. Artificial expression of Wnt7b rescued vascularization of the hypertrophic cartilage in the Ihh-/- mouse, but failed to restore orthotopic osteoblast differentiation in the perichondrium. Similarly, Wnt7b did not recover Ihh-dependent perichondral bone formation in the Ihh-/-; Gli3-/- embryo. Interestingly, Wnt7b induced bone formation at the diaphyseal region of long bones in the absence of Ihh, possibly due to increased vascularization in the area. Thus, Ihh-dependent expression of Wnt7b in the perichondrium may contribute to vascularization of the hypertrophic cartilage during endochondral bone development.

Ihh/Gli1信号通路对大鼠急性脊髓损伤后脊髓内源性干细胞增殖分化的影响

目的:观察Ihh/Gli1m RNA在脊髓中的分布及大鼠急性脊髓损伤后Ihh/Gli1m RNA信号通路对脊髓内源性干细胞增殖分化的影响。方法:将SD大鼠随机分为空白组(A组)、假手术组(B组)、模型组(C组)。大鼠急性脊髓损伤模型用改良Allen's法建立。将大鼠于造模后不同时间点分别处死,取以损伤脊髓为中心长1cm的脊髓进行real-time PCR、原位杂交检测及免疫组化检测。结果:在成年大鼠脊髓中,Ihhm RNA在室管膜细胞仅有少量表达,其主要分布在白质区。Gli1m RNA主要表达在灰质区运动神经元核仁以外的细胞核内和胶质细胞额胞质。脊髓损伤后,Ihhm RNA和Gli1m RNA表达减少,第3至7天达到最低值后又缓慢增多;Nestin+细胞和Brdu+细胞在第3至7天达到最高值后缓慢下降。结论:脊髓损伤后Ihh/Gli1信号通路对内源性神经干细胞的增殖起负性调控作用。

CRISPR/Cas9介导鸡IHH基因载体构建及其敲除效率检测

为了揭示IHH(Indian hedgehog)基因在鸡匍匐性状形成过程中的作用机制,利用在线sgRNA平台设计4条IHH sgRNA序列,构建了sgRNA-PX459表达载体,分别命名为sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3和sgRNA4。采用脂质体转染至鸡DF-1成纤维细胞后,通过嘌呤霉素筛选4d后收集阳性细胞,采用试剂盒法提取基因组DNA,利用T7E1内切酶和TA克隆测序方法检测4个表达载体的打靶效率。结果表明:4条sgRNA表达载体构建成功,并且都能高效地在DF-1细胞中表达,其中sgRNA1表达载体能有效地打靶IHH基因,通过测序分析发现打靶效率为75.0%,测序结果表明这些突变都以碱基缺失为主。研究结果为揭示IHH基因在鸡匍匐性状中作用机制奠定了坚实的基础。

ChIP-seq技术分析突变IHH-GLI1信号传导通路对下游转录调控的影响

为发现IHH/GLI1突变导致的下游转录调控的变化,在小鼠间充质干细胞C3H10T1/2中加入人野生型重组IHH-N蛋白(WT)和突变型蛋白(MT,p.E95K)以激活IHH信号通路,利用染色体免疫沉淀高通量测序(ChIP-seq)技术挖掘GLI1转录因子结合靶点,并对其进行基因功能注释和KEGG通路分析,再结合前期基因芯片数据进行联合分析。利用ChIP-seq生物信息学分析发现两组间465个不同的GLI1结合靶点,基因注释和KEGG通路分析的结果主要富集于Wnt、刺猬因子(HH)、胰岛素等参与调控长板软骨发育的关键信号通路。联合分析发现了两个数据集中19个共同的候选基因。本研究精确定位了IHH信号蛋白突变导致的GLI1结合靶点差异,为进一步探索由IHH信号介导的BDA1的发病机制和治疗靶点提供理论基础。

补肾、健脾、活血法对绝经后骨质疏松症大鼠骨骼、骨骼肌印第安刺猬蛋白(Ihh)含量影响的比较研究

目的:观察中医不同治法对骨质疏松症大鼠骨骼、骨骼肌印第安刺猬蛋白(Ihh)含量变化的影响,为临床中医防治骨质疏松症的提供理论依据。方法:将SD雌性大鼠分为正常组、模型组、补肾组、健脾组、活血组。采用酶联免疫法测定小鼠骨骼、骨骼肌Ihh含量浓度变化。结果:(1)与正常组比较,模型组大鼠骨骼的Ihh含量降低明显(P<0.01);与模型组比较,补肾组和健脾组骨骼的Ihh含量明显升高(P<0.01)。(2)与正常组比较,模型组大鼠骨骼肌的Ihh含量显著降低(P<0.01);与模型组比较,补肾组和健脾组骨骼肌的Ihh含量明显升高(P<0.01)。结论:(1)骨质疏松症的形成,可能与骨骼、骨骼肌协调性下降有关。(2)补肾、健脾方法通过提高骨质疏松症大鼠的骨骼、骨骼肌Ihh含量,对骨质疏松症具有一定的防治作用。

两个先天性并指缺指中国家系IHH基因的突变检测

为了探讨现有的两个并指缺指中国家系基因突变情况,以正常人作为对照,应用PCR和DNA直接测序方法,在两个家系(共7位患者)中研究IHH基因3个外显子的突变情况.检测IHH基因编码区以及外显子和内含子交接区与正常对照有无差异,在所有被检成员中,除第3外显子出现序列多肽性外,其余序列均未发现突变.研究认为这两个家系的致病原因并非IHH基因编码区的突变引起.