氟西汀对慢性应激大鼠前额叶谷氨酸转运体GLT-1表达的影响

目的研究氟西汀对慢性应激大鼠前额叶谷氨酸转运体1(GLT-1)的影响,进一步探讨氟西汀抗抑郁作用可能的分子机制。方法正常SD大鼠60只,随机分为对照组、慢性不可预见性应激(CUS)组和氟西汀组。对CUS组和氟西汀组大鼠进行CUS应激后,氟西汀组给予氟西汀治疗,对照组和CUS组给予生理盐水。实验结束后进行糖水偏好和旷场行为测试,并使用免疫组织化学法和蛋白印迹分析检测大鼠前额叶GLT-1的表达水平。结果 (1)行为学测试结果显示,CUS组大鼠糖水偏好、总行程、平均移动速度及直立次数均低于对照组(P<0.01);氟西汀组上述指标均高于CUS组(P<0.01)。(2)免疫组织化学法分析显示,CUS组与对照组比较,大鼠前额叶GLT-1表达下降(P<0.01);经氟西汀治疗后,大鼠前额叶GLT-1表达比CUS组明显升高(P<0.01)。(3)蛋白印迹分析显示,CUS组与对照组比较,大鼠前额叶GLT-1表达下降(P<0.01);经氟西汀治疗后,大鼠前额叶GLT-1表达比CUS明显升高(P<0.01)。结论慢性应激下调大鼠前额叶GLT-1表达水平,而氟西汀上调GLT-1表达水平,GLT-1表达增加可能是氟西汀抗抑郁作用的分子机制之一。

生物工程人源抗-HBsFab的抗原特异亲合力简易测定

目的 建立一种简易的抗体亲合力测定技术 ,对生物工程抗 HBsFab进行抗原特异亲合力测定。方法 应用异种抗体竞争抑制法 ,在硝酸纤维素膜上进行不同抗原浓度、不同抗体抑制浓度的抗原、抗体反应。酶标记抗Fab抗体 (Fabspecific)与相应底物显色 ,通过抑制效果估测靶抗体的亲合力。结果 ①抗 HBsFab组对不同浓度的抗原皆为阳性且能显示浓度差。②鼠腹水单克隆抗 HBs在 1 0倍于人源抗 HBsFab范围内无抑制作用 ;多克隆羊抗 HBsAg在 1 0倍于人源抗 HBsFab时显示抑制效应 ,而在同倍和 1 / 1 0浓度时无抑制作用。结论 本研究建立的是一种简易、实用的方法 ,能够达到直观。

表达γ-亚麻酸的无筛选标记转基因大豆的鉴定

对所获得的9株无筛选标记基因的T1代莆豆8008转基因大豆的T2代进行了分析。PCR和Southern杂交检测表明标记基因已不存在于转基因株系中,同时目的基因以纯合或者杂合状态存在于部分株系中,除草剂抗性分析也表明这些转基因株系已不再具有抗除草剂的能力。Northern杂交检测表明Δ6-脂肪酸脱氢酶基因在转基因株系中可以转录。GC分析表明其中6个转基因植株富含GLA。

干燥综合征特异性α-胞衬蛋白的抗原表位筛选及鉴定

目的:筛选和鉴定干燥综合征特异性α-胞衬蛋白(α-Fodrin)的抗原表位.方法:采用蛋白质计算机分析软件预测α-胞衬蛋白的抗原决定簇,设计8条重叠蛋白片段序列,应用GST融合表达系统原核表达该系列融合蛋白.通过Western blot实验检测融合蛋白片段的抗原性,并对抗原性片段以外的序列片段进行融合表达和检测,最终确定抗体所识别的部位.结果:8条重叠融合蛋白片段均有抗原性,最小片段以外序列的表达片段检测不具有抗原性.结论:α-胞衬蛋白的第1～59位氨基酸是其抗原表位区域,为进一步研究α-胞衬蛋白在干燥综合征中的作用机制和应用奠定了基础.

金黄色葡萄球菌β-溶血素的原核表达及其溶血活性检测

目的为进一步研究金黄色葡萄球菌β-溶血素的致病性及免疫保护作用,对金黄色葡萄球菌β-溶血素进行了表达。方法应用聚合酶链式反应(PCR)技术,从金黄色葡萄球菌中扩增出β-溶血素基因,将该基因克隆到原核表达载体PET-32a中,获得重组质粒PET-32aβ-,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Westernblot检测分析,并对纯化后表达产物进行平板溶血试验,检测其溶血活性。结果PCR扩增的β-溶血素基因片段全长为982bp;表达的β-溶血素重组蛋白大小为57kD;纯化的重组蛋白可使绵羊红细胞发生明显溶血。结论结果表明所克隆的β-溶血素基因在大肠杆菌中得到了良好的表达,并保持良好的溶血活性。

利用枯草芽孢衣壳蛋白表面展示β-半乳糖苷酶

分别将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)芽孢衣壳蛋白CotB、CotC、CotG和CotX的启动子和编码序列与来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus IAM11001)的β-半乳糖苷酶基因bgaB进行重组,构建融合表达cotB-bgaB、cotC-bgaB、cotG-bgaB和cotX-bgaB的整合型重组质粒。将4种重组质粒分别转入枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168(trp-),获得了能在芽孢表面展示的重组菌株PB701、PB702、PB703和PB704。经Western blot检测,4种重组菌株均表达了预期分子量的融合蛋白,初步表明β-半乳糖苷酶被锚定在重组菌株的芽孢表面。以oNPG为底物测定4种重组菌株芽孢表面展示β-半乳糖苷酶的水解能力,得到的酶活分别为0.14、0.06、0.22和0.20 U/mL。

膜型基质金属蛋白酶-1在骨性关节炎患者滑膜中的表达及意义

目的:探讨膜型基质金属蛋白酶-1(MT1-MMP/MMP-14)在骨性关节炎(OA)患者膝关节滑膜中的表达和意义。方法:应用免疫组化和Western blot方法检测MT1-MMP蛋白在40例OA与40例非OA患者滑膜中的表达情况。结果:免疫组化结果表明MT1-MMP蛋白在OA与非OA患者滑膜中的表达有显著性差异(χ2=29.46,P<0.01),且阳性表达多定位于滑膜细胞的胞质;Western blot分析结果显示MT1-MMP蛋白在OA患者滑膜(1.042±0.219)中表达显著高于非OA患者滑膜组织(0.256±0.050,F=12.838,P=0.001)。结论:MT1-MMP蛋白与骨性关节炎发生发展相关,可能作为诊断及判断骨性关节炎的一项重要指标。

食管癌组织中MT-1-2与-3的表达差异及临床意义

目的:金属硫蛋白(metallothionein,MT)是一类广泛存在于生物体体内的低分子量、富含半胱氨酸的蛋白质。本研究旨在明确MT-1、-2和MT-3在食管癌中的表达差异以及MT-1、-2和MT-3的表达量与各临床病理特征的关系。方法:随机选取2008年7月至2009年7月河北医科大学第四医院胸外科行手术治疗的食管癌患者114例,其中,男64例,女50例;年龄40～75岁,平均年龄61岁。胸上段食管癌21例,肠中段食管癌58例,肠下段食管癌35例。依据国际抗癌联盟(UICC)食管癌TNM分期(2009年):Ⅱa期34例,Ⅱb期36例,Ⅲ期31例,Ⅳ期13例。组织类型均为鳞癌;组织学分级为高分化59例,中分化癌36例,低分化癌19例。应用Western blot检测肿瘤组织及切缘正常组织中MT-1、-2和MT-3的表达情况,对MT-1、-2和MT-3的表达量与临床病理参数,以及MT-1、-2与MT-3表达的关系进行分析。结果:MT-1、-2和MT-3在食管癌组织中的表达量均高于切缘正常组织(MT-1、-2t=5.214,P<0.01),(MT-3t=4.287,P<0.01),且均与肿瘤组织病理分期(MT-1、-2 r_s=0.896,P<0.01),(MT-3 r_s=-0.501,P<0.01),分化程度(MT-1、-2 r_s=-0.548,P<0.01),(MT-3 r_s=0.664,P<0.01)有关,与肿瘤部位(MT-1、-2 r_s=0.253,P>0.05),(MT-3r_s0.172,P>0.05)无关。结论:MT-1、-2和MT-3在食管癌组织中均存在高表达,其表达水平与食管癌的发生、发展及组织分化密切相关,而且MT-3在食管癌组织中的表达规律与MT-1,-2有显著不同。

髓样细胞白血病-1基因在原发性肝癌组织中的表达及临床意义

目的探讨髓样细胞白血病-1（myeloid cell leukemia-1，Mcl-1）基因及蛋白在原发性肝癌和肝硬化组织中的表达及临床病理学意义。方法采用逆转录-聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）法，蛋白质印迹法（western blot，WB）和免疫组织化学 ENVISION法分别检测20例肝癌组织，19例肝硬化组织和12例对照肝组织中 Mcl-1的表达，并分析其表达与肝癌临床病理学特征的关系。结果 Mcl-1 mRNA相对表达强度在对照组、肝硬化组和肝癌组中分别为0.52±0.17，3.46±1.7，3.65±2.93，其中肝癌组及肝硬化组分别与对照组间比较，差异均有统计学意义（t＝7.925，5.334，P＜0.05）。Mcl-1蛋白相对表达量在肝硬化组（0.51±0.35）和肝癌组（0.75±0.36）均显著高于对照组（0.21±0.19）（t＝5.526和6.355，P＜0.05）。肝癌组Mcl-1的阳性表达率为55.00％（11／20），显著高于对照组33.33％（4／12）（t＝7.835，P＜0.05），Mcl-1蛋白阳性表达与肿瘤有无坏死和TNM分期有关（χ2＝4.201，P＜0.05）。结论 Mcl-1基因及蛋白在肝癌组、肝硬化组和对照肝组织中的表达存在差异，可能参与了肝硬化的发生、发展及向肝癌的恶性转化。

木薯14-3-3蛋白家族成员MeGRF3基因的原核表达及多克隆抗体制备

14-3-3蛋白是植物体内重要的信号转导调节分子,在碳代谢、逆境胁迫响应、生长发育等过程中发挥重要调控作用。为了深入解析14-3-3蛋白家族在木薯中的生物学功能,该研究采用酶切连接方法构建木薯14-3-3蛋白家族成员MeGRF3的原核表达载体,用热激法转化大肠杆菌Rosetta(DE3)株系,诱导表达带有MeGRF3的融合蛋白;使用纯化后的MeGRF3融合蛋白免疫新西兰公兔制备多克隆抗体,并检测抗体的效价和特异性。结果显示:(1)成功构建了木薯MeGRF3的原核表达载体pET-30a-MeGRF3,并诱导表达得到带有MeGRF3和6个His标签的融合蛋白。(2)MeGRF3融合蛋白主要以包涵体的形式存在,相对分子质量约为33 kD。(3)间接酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定的抗体效价为1024000。(4)Western blot分析显示,木薯叶片、茎尖、茎皮和块根中均检测到与MeGRF3蛋白大小一致的条带,说明MeGRF3在这4个组织器官中均表达,但主要是在茎尖和块根中大量积累,表明该研究成功制备的MeGRF3多克隆抗体的特异性较好。

转基因本氏烟草中CtDXR基因拷贝数及耐盐耐高温功能的初步分析

评估转基因本氏烟草中CtDXR基因的拷贝数,并初步分析其耐盐与耐高温能力。首先利用Southern Blot技术确定野生型本氏烟草中Actin基因的拷贝数,并以Actin基因为内参基因,以转CtDXR基因本氏烟草为材料,采用实时荧光定量PCR方法,检测转基因植株中CtDXR基因的拷贝数。最后,初步分析转基因植株的耐盐与耐高温能力。基于PCR方法,随机检测10株T1代转基因本氏烟草植株均能扩增出目的条带,表明它们均已成功转入目的基因CtDXR;Actin基因在本氏烟草基因组中为单拷贝基因;以Actin基因为内参基因,最终确定80%的转CtDXR基因植株为单拷贝或低拷贝株系;盐胁迫下,转CtDXR基因植株的株高(P<0.01)、侧根数(P<0.01)与鲜重(P<0.001)优于野生型植株,高温胁迫下,转CtDXR基因植株的株高(P<0.01)、叶片数(P<0.01)与鲜重优于野生型植株,表明转基因植株具有更强的耐盐和耐高温能力。利用研究建立的转基因本氏烟草外源基因拷贝数的检测方法,对转CtDXR基因植株完成外源基因拷贝数的鉴定,且初步鉴定了CtDXR基因具有耐盐与耐高温功能。

pH值对巴西橡胶树胶乳β-1,3-葡聚糖酶结合黄色体膜的影响

基于黄色体内含物中的多种可溶性蛋白质以及黄色体膜在胶乳凝固中所起到的重要作用,已提出了多种阐明胶乳凝固机制的假说,但有关β-1,3-葡聚糖酶在胶乳凝固中的作用尚无报导。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(Tricine-SDS-PAGE)和免疫印迹技术(Western blotting),对不同pH值条件下破裂收集的黄色体内含物和膜组分中的蛋白质进行研究。结果表明,在pH5.5左右的酸性环境中,β-1,3-葡聚糖酶主要表现为可溶性蛋白质,很少结合黄色体膜;但在pH6.9左右的中性及偏碱性的环境下,大量β-1,3-葡聚糖酶结合到黄色体膜上,可溶性蛋白所占的比例很低。首次发现了β-1,3-葡聚糖酶可以结合黄色体膜,二者结合的程度明显受环境pH值的影响。该结果对于认识β-1,3-葡聚糖酶的生物功能,完善黄色体在胶乳凝固中的作用及阐明乳管堵塞机制具有重要意义。

HSP70-肿瘤肽复合物的纯化及其对肝癌细胞株HepG-2增殖的作用

目的:应用快速蛋白液相色谱(FPLC)系统从肝癌组织中分离和纯4EHSP70-肽复合物,并研究其对肝癌细胞系HepG-2增殖的影响．方法:将组织进行匀浆、高速离心提取总蛋白后依次进行ConA-Sepharose亲和层析和 DEAE-Sephacel子交换层析分离纯化,所得蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot进行蛋白分子质量及性质鉴定,Bradford 法测定蛋白浓度;利用MTT方法检测HSP70- 肽复合物对HepG-2细胞增长的情况．结果:分离、纯化得到的蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、考马斯量蓝鉴定为单一带, 分子质量为70 kDa;Western blot结果证实为 HSP70,每10 g组织最终获得1．5 mg的HSP70; HSP70刺激组12,48,72 h与对照组的A值之间有显著差异(0．1 mg／L:t=-0．2500,P=0．00; t=-0．1777,P=0．001:t=-0．3094,P=0．001; 0．5 mg／L:t=-0．2878,P=0．00;t=-0．2044,P= 0．00;t=-0．3285,P=0．00;1 mg／L:t=-0．3118, P=0．00;t=-0．2592,P=0．00;t=-0．1994, P=0．025;5 mg／L:t=-0．4007,P=0．00;t= -0．1302,P=0．016;t=-0．2537,P=0．005),细胞存活率明显高于对照组(P<0．01)．结论:使用本分离纯化方法可获得高纯度 HSP70肽复合物;HSP70肽复合物可以促进 HepG-2细胞的生长．

解偶联蛋白-2在大鼠非酒精性脂肪肝中的表达

目的:探讨解偶联蛋白-2(uncoupling protein 2,UCP2) 在大鼠非酒精性脂肪肝发生中的作用．方法:Wistar大鼠64只,随机分为高脂饮食诱导脂肪肝组和正常对照组,分别于2,4,8,12 wk用免疫组织化学和Western blot技术检测肝组织中UCP2表达变化,生化检测大鼠血清甘油三酯(TG)、游离脂肪酸(FAA)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)含量．结果:大鼠非酒精性脂肪形成过程中UCP2阳性细胞数和表达强度逐渐增加,所有动物肝组织均出现不同程度的肝细胞脂肪变性,并逐渐加重．2,4,8,12 wk血清TG(0．78±0．05,0．85±0．10,1．16±0．10,1．39±0．07 mmol/L)、FAA(371．3±13．7,439．2±14．1,486．3±13．6, 636．7±20．3 μmol／L)和ALT(630．1±41．7,713．5±75．0, 925．2±105．0,1 090．2±65．0 nkat／L)含量较对照组增高,其中TG、FAA 4,8,12 wk均有显著性(P<0．05或 P<0．01),ALT 8,12 wk有显著性(P<0．01)．结论:随着非酒精性脂肪的形成和程度加重,UCP2表达逐渐增强,其介导的酶活性显著增高,启动脂质过氧化反应,促进脂肪肝的形成和发展．

盐生杜氏藻3-磷酸甘油脱氢酶不同结构域蛋白的表达纯化及其抗体的制备与分析

盐生杜氏藻(Dunaliella salina)是迄今为止世界上发现的最耐盐的真核光合生物,而甘油是盐藻用于调节细胞内外渗透压变化的关键调渗物质.3-磷酸甘油脱氢酶(GPDH)是盐生杜氏藻甘油合成途径中的关键酶.与已经报道的其它物种的GPDH基因不同,盐生杜氏藻3-磷酸甘油脱氢酶(Ds.GPDH)基因具有两个独立的功能结构域,即丝氨酸磷酸化酶结构域(SGPP domain)和3-磷酸甘油脱氢酶结构域(GPD domain).本实验在已克隆的Ds.GPDH2基因的基础上,以含GPDH2全基因序列的T质粒载体(pMD18-T-GPDH2)为模板,PCR扩增分别得到两个单结构域片段(SGPP与GPD),以及双结构域片段(GPDH),构建了pET32a-SGPP、pET32a-GPD和pET32a-GPDH三种原核表达载体,并在大肠杆菌中成功表达.纯化蛋白制备抗原,制备出3个多克隆抗体.WesternBlot和交叉反应分析显示通过重组蛋白制备的多克隆抗体具有很高的特异性.

人纤溶酶原K1-3区基因在大肠杆菌中的表达

将人纤溶酶原kringle 1- 3 (K1- 3)基因插入融合表达载体pET - 17b ,获得重组质粒pET -K13 ,转化E coliBL2 1(DE3) ,在IPTG诱导下 ,人纤溶酶原K1- 3基因在E coliBL2 1(DE3,pET -K13)中获得高效融合表达 ,表达量占菌体总蛋白的 2 4% ,表达产物以包涵体存在 ,Westernblot证明重组蛋白对人纤溶酶原抗血清有特异免疫原性 .

TNF-α对体外培养奶牛乳腺成纤维细胞α-SMA mRNA及蛋白表达的影响

肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factorα,TNF-α）主要来源于活化的巨噬细胞、肥大细胞和T细胞等,参与炎症反应和免疫调节过程,并能够刺激成纤维细胞的增殖过程。TNF-α通过与细胞的肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor receptor,TNFR）结合发挥作用,TNFR一般分为TNFR1（CD120a）和TNFR2（CD120b）两型。TNFR1分布于多种正常细胞或肿瘤细胞表面,TNFR1被认为是TNF-α的主要受体。

ICAM-1蛋白的表达与大肠癌侵袭转移的相关性

目的探讨ICAM-1在大肠癌(colorectal carcinoma,CRC)中的表达与其侵袭转移的关系。方法采用免疫组化SABC法及Western blotting技术检测ICAM-1蛋白在大肠正常黏膜、腺瘤和癌组织中的表达。结果免疫组化结果显示ICAM-1蛋白在CRC和腺瘤的高表达均与正常黏膜的低表达之间的差异有显著性(P<0.001,P<0.001);随着组织分化的降低和Dukes分期的增加,其表达呈上升的趋势;淋巴结和远处器官转移组的表达均高于未转移组(P<0.01,P<0.05)。Western blotting的结果显示ICAM-1的特异性条带出现在Marker标准相对分子量110KD左右,ICAM-1在CRC的阳性率高于正常黏膜的,且差异有显著性(P<0.01)。结论ICAM-1在CRC的表达与其侵袭转移密切相关。

羊种布鲁氏菌M5-90 omp31蛋白原核表达

克隆、测序布鲁氏菌疫苗株M5-90外膜蛋白基因OMP31,原核表达OMP31并对其检测。从羊种布鲁氏菌M5-90中PCR获得OMP31基因,连接到pBS-T克隆质粒并测序;将测序正确的基因片段克隆入大肠杆菌表达载体pET-28a,进行SDS-PAGE,而后Western-blot检测。结果M5-90疫苗株的OMP31基因序列与羊种布鲁氏菌参考株16M的同源性为99.03%;外膜蛋白基因OMP31在大肠杆菌表达后能够被Western-blot检测到。结论:表达的布鲁氏菌疫苗株M5-90外膜蛋白OMP31可以被布鲁氏菌特异性血清识别,表现出良好的抗原性,为以后实验室诊断和疫苗的研究做好坚实的上游工作。

β-连环蛋白对毛囊细胞增殖的调节作用

目的探索β-连环蛋白促进毛囊干细胞增殖作用的分子机制。方法利用含有氨基端删除的β-连环蛋白的表达质粒转染毛囊细胞,观察转染细胞增殖,利用Westen blotting及原位杂交法观察其目的基因c-myc的表达。结果转染ΔN90β-连环蛋白基因后细胞集落形成率增加,细胞K19阳性率亦有所增加;转染细胞c-myc的表达在蛋白质水平与mRNA水平均增加。结论β-连环蛋白对毛囊细胞增殖分化的促进作用可能是通过促进c-myc基因的表达实现的。