IgG型自身抗体Fab段遮断红细胞自身抗原的探索研究

目的应用自身抗体的Fab段结合红细胞上的自身抗原,以遮断完整自身抗体与自身抗原的结合。方法含自身抗体的患者血清,通过吸收放散试验获得成分单一的自身抗体,再应用木瓜酶37℃过夜水解自身抗体IgG分子获得Fab段,用Fab段特异性结合相对应的自身抗原,从而遮断完整自身抗体与自身抗原的结合。结果3例含自身抗体的患者血浆标本,经过吸收放散试验获得的组分单一的自身抗体,均经过木瓜酶水解处理生成Fab段,此Fab段与各自放散液中的完整自身抗体混合后,均能遮断完整自身抗体与红细胞自身抗原的结合。同时3例标本之间,1号标本与2号标本的有相互遮断效应,而2号标本和3号标本之间未见相互遮断效应。结论自身抗体Fab段能消除完整自身抗体与红细胞自身抗原的凝集,此方法可以应用到临床实践中,解决多种临床问题。

扩大FAB法焊接范围技术研究与应用

文中介绍了扩大FAB法焊接范围的工艺方法,从焊接材料、焊接设备、坡口准备、焊接参数及操作要点等方面进行研究,突破了国内外FAB单丝焊接25 mm的板厚上限,实现30 mm厚度钢板FAB单丝焊接,为21万吨散货船槽型舱壁分段制作全面采用FAB法焊接提供了技术支撑,焊接效率提升2倍以上,槽型舱壁分段制作周期缩短3天以上。

LPCAT1在FAB-M2亚型成人急性髓系白血病患者中的预后意义

目的:研究溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶1(LPCAT1)在急性髓系白血病(AML)中的预后价值。方法:使用基于Taq Man的逆转录-实时荧光定量聚合酶链反应检测214例初治成人AML患者和24例健康对照者LPCAT1的相对表达量。使用Kaplan-Meier方法进行生存分析,Cox比例风险回归模型用于确定预后因素。结果:LPCAT1在成人AML中的表达水平为34.37%(1.83%-392.63%),显著低于健康对照者的92.81%(2.60%-325.84%)(P<0.001)。本研究在具有完整临床信息和预后数据的171例非急性早幼粒细胞白血病患者中评估了LPCAT1的预后意义。生存分析结果表明,LPCAT1的表达水平对整个队列的预后没有显著影响。然而,在FAB-M2亚型(M2-AML)的AML患者中,低表达LPCAT1患者的2年无复发生存率为35.4%(95%CI:0.107-0.601),显著低于高表达LPCAT1患者的79.2%(95%CI:0.627-0.957)(P=0.012)。多因素分析结果表明,低表达LPCAT1是M2-AML患者无复发生存率的独立危险因素(HR=0.355,95%CI:0.126-0.966,P=0.049)。结论:LPCAT1在成人AML患者中低表达,LPCAT1低表达是M2-AML患者无复发生存率的独立危险因素。

犬冠状病毒S1蛋白特异性小分子抗体Fab的制备

为表达犬冠状病毒(canine coronavirus,CCV)S1蛋白,制备其特异性小分子抗体Fab,为CCV的防治提供新材料。采用PCR扩增CCV S 1基因全长及其截短片段,分别克隆到原核表达载体pET28a或pGEX4T-1中,转到BL21(DE3)或Rosetta(DE3)感受态细胞构建重组表达菌株;用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导目的蛋白表达,通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blot鉴定分析重组蛋白;纯化蛋白分别与ISA71AVG或ISA201VG佐剂配伍乳化后制备免疫原,免疫蛋鸡,用聚乙二醇(PEG)沉淀法提取得到CCV S1蛋白的卵黄抗体,通过Western blot检测抗体滴度,用胃蛋白酶水解卵黄抗体制备小分子抗体Fab。结果显示,S1蛋白全长无表达,CCV S1-a和CCV S1-b分子量分别为79 ku和68 ku。在免疫后第35天2种佐剂组的卵黄抗体滴度可达1∶128000。制备小分子抗体Fab最佳酶切条件为卵黄抗体与胃蛋白酶混合质量比20∶1、pH值4.1、37℃酶切8 h。完整的IgY可以与CCV呈特异性反应,胃蛋白酶处理后制备的小分子抗体Fab可以有效阻断CCV的感染性。综上,本研究成功表达了CCV S1的2个截短片段蛋白,制备了卵黄抗体及其小分子抗体Fab,为进一步开展犬冠状病毒病的诊断和防治技术研究奠定了基础。

嵌合抗CD_(20) Fab′对B淋巴瘤细胞Raji细胞生长的影响

目的：研究嵌合抗CD_(20)基因工程抗体Fab′的抗肿瘤活性。方法：利用MTT法以及3H掺入法测定嵌合抗CD_(20) Fab′对Raji细胞生长的影响。结果：MTT法测定结果显示嵌合抗CD_(20) Fab′对Raji细胞的生长具有抑制作用，抑制作用成剂量依赖性，其IC50为24μg／ml；嵌合抗CD_(20) Fab′对3H－TdR掺入Raji细胞无抑制作用，表明抗CD_(20) Fab′不影响Raji细胞DNA的合成；但嵌合抗CD_(20) Fab′抑制3H－UdR掺入Raji细胞，表明嵌合抗CD_(20) Fab′对Raji细胞RNA合成具有抑制作用，其抑制作用成剂量相关性。结论：嵌合抗CD_(20) Fab′抑制Raji细胞生长，嵌合抗CD_(20) Fab′具有较好的抗肿瘤活性。

FAB法大间隙焊接工艺研究与应用

主要针对生产现场拼板间隙过大条件下的FAB法工艺开发与应用进行研究。经过对多种板厚FAB法大间隙焊接工艺的研究,优化了焊接参数,在保证焊接质量的同时,提高了该焊接工艺在生产现场使用时的适应性。

某FAB厂房的结构设计及难点分析

以某实际工程中的FAB厂房结构设计为例,详细介绍了基础和上部结构设计的思路和要点,并对其中重载大跨度钢屋架的概念设计、结构选型、受力特性、计算分析、支座构造等进行了进一步的设计探讨,总结了此类结构设计中的一些难点和经验,可作为结构工程师在进行类似项目设计时的参考。

嵌合抗CD20 Fab′诱导Raji细胞凋亡

为了研究嵌合抗CD2 0基因工程抗体Fab′的抗肿瘤活性及其抗肿瘤机制 ,利用3H掺入法测定嵌合抗CD2 0Fab′对Raji细胞生长的影响 ,结果显示嵌合抗CD2 0Fab′对Raji细胞的生长具有抑制作用 ,利用流式细胞仪测定嵌合抗CD2 0Fab′诱导Raji细胞凋亡作用 ,结果显示嵌合抗CD2 0Fab′可诱导Raji细胞凋亡作用。这些实验结果证明嵌合抗CD2 0Fab′通过诱导Raji细胞凋亡的机制抑制Raji细胞生长。

Fab类抗体的研究进展

在基因工程抗体中,Fab类(Fabs)抗体有许多优势,如相对分子质量小、组织分布特异性强和免疫原性低等,使Fab类抗体成为近几十年来的研究热点。除了应用较广泛的体外酶消化法外,多种表达系统(如大肠杆菌和昆虫等)皆用于Fab类抗体的获得,其中大肠杆菌表达的系统研究最为彻底,且已经应用于制备Fab类临床药物。目前已经有赛妥珠单抗等6种Fab类抗体药物通过了美国FDA申请并上市,并有多种Fab类药物正处于临床试验阶段。本文分别对Fab类抗体的基本结构及特点、Fab类抗体的生成、表达和提高产量的策略、临床应用的研究进展进行介绍。

Fab Lab创新模式及其启示

信息技术融合与发展为科技创新模式嬗变提供了新机遇。本文讨论了Fab Lab创新模式的发展背景及典型案例,并重点分析了其对我国以用户创新为中心的应用创新实践的理论及现实意义,以期引发研究与实践领域围绕用户参与的创新2.0模式发展的深入思考。

抗HBsAg抗体Fab段在大肠肝菌中的高效表达与复性

将抗ＨＢｓＡｇ 抗体的轻链（Ｌ）和重链Ｆｄ 段基因，分别克隆于ｐＥＴ２０ｂ 质粒中并分别转化到大肠肝菌ＢＬ２１（ＤＥ３），ＬＰＴＧ诱导后，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析发现在２７ＫＤ（Ｌ）和２５ＫＤ（Ｆｄ）处有外源蛋白表达，表达蛋白含量分别为５３％ 和４８％ 。Ｌ链和Ｆｄ 包涵体蛋白经盐酸胍变性后，等量混合于折叠液中，Ｌ和Ｆｄ 可复性形成了约５０ＫＤ的蛋白。ＥＬＩＳＡ结果表明，复性蛋白具有与ＨＢｓＡｇ 结合的能力。抗ＨＢｓＡｇ 抗体Ｆａｂ 段在大肠杆菌中的表达与复性的成功，表明包涵体表达基因工程抗体在技术是可行的。

人源性抗HBsAg抗体Fab段在酵母中的表达

通过分步整合的方式 ,将人源性抗乙肝表面抗原 (HBsAg)抗体Fab的轻、重链基因分步整合到巴斯德毕赤(Pichiapastoris)酵母GS115菌株的染色体上 ,经甲醇诱导 ,成功地分泌表达出抗HBsAg抗体的Fab片段 ,表达量达5 0～ 80mg L。ELISA结果显示重组酵母分泌表达出的Fab具有较强的结合HBsAg的能力。通过抗Fab的抗体柱亲和层析 。

397例急性白血病细胞遗传学与FAB分型相关性研究

本研究探讨急性白血病的细胞遗传学改变,了解染色体核型异常与急性白血病FAB分型的关系及其对预后因素的影响。397例急性白血病患者于治疗前抽取骨髓标本,采用短期细胞培养法制备染色体标本,应用G显带技术进行染色体核型分析。结果显示,397例急性白血病中78例无分裂相,319例可供染色体核型分析的患者中染色体核型异常175例(占54.9%)。在急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓系白血病(AML)和急性混合细胞白血病(AMLL)3种类型的白血病患者中,染色体核型异常分别为33/120例(占27.5%)、129/252例(占51.2%)和13/25例(占52.0%)。超二倍体41例(占23.4%),亚二倍体22例(占12.5%),正常二倍体112例(占64.0%)。AML染色体核型异常中与FAB分型相关的特异性染色体重排74/129例(占57.4%)。结论:大约55%左右的急性白血病存在克隆性染色体异常,一些特异性染色体异常改变是急性白血病的细胞遗传学特征,与急性白血病的FAB分型有明显相关性,染色体检查和分子遗传学方法相结合,对于白血病的诊断、分型、治疗和预后都具有重要意义。

人源中和性抗汉滩病毒单克隆抗体Fab段基因的获得和表达

运用噬菌体表面表达（Ｐｈａｇｅｄｉｓｐｌａｙ）技术，获得人源中和性抗汉滩病毒汉滩型Ｇ１基因工程单克隆抗体（单抗）Ｆａｂ段基因及其表达，并同时获得抗汉滩病毒核蛋白（ＮＰ）的Ｆａｂ抗体。从肾综合征出血热疫区恢复期病人抗凝血中分离到的外周淋巴细胞中，提取了总细胞ＲＮＡ。通过ＲＴ－ＰＣＲ方法，用一组人ＩｇＧＦａｂ基因特异性引物，从合成的ｃＤＮＡ中经ＰＣＲ扩增了一组轻链和重链Ｆａｂ段基因，将轻链和重链先后插入噬菌体载体ｐＣｏｍｂ３，成功地建立了抗汉滩病毒抗体基因库，并用纯化的汉滩病毒颗粒及抗汉滩病毒糖蛋白鼠单抗捕捉糖蛋白抗体原的方法，对此抗体库进行了富集筛选，在短期内成功地获得了抗汉滩病毒核蛋白和糖蛋白Ｇ１的人源单抗Ｆａｂ段基因，并在大肠杆菌中获得有效表达。核苷酸序列分析证实，所获得的基因为人源ＩｇＧＦａｂ基因。用特异性放射免疫沉淀（ＩＰ）、ＩＦＡＴ和ＥＬＩＳＡ以及空斑减少中和试验鉴定表明，表达的人Ｆａｂ抗体能识别汉滩病毒结构蛋白，其中抗Ｇ１人Ｆａｂ抗体具有体外中和活性。人源抗汉滩病毒基因工程抗体的获得，为今后可能的临床应用提供了良好前景。

人源噬菌体Fab抗体库构建过程中引物的优化和初步鉴定

目的 优化设计一套引物 ,扩增全套人抗体Fd片段和L链基因 ,改善扩增效率 ,益于人源噬菌体抗体库的构建。方法 根据V BASE数据库提供的人抗体可变区胚系基因 ,在其家族分类基础上 ,根据FR1区 5’端保守序列重新分组 ,设计特异性的 5’端扩增引物。同时对设计引物的匹配情况进行分析 ,并应用PCR扩增和测序反应对其扩增效果进行鉴定。结果 Fd链 5’端扩增引物有 5条 ,κ轻链有 6条 5’端扩增引物 ,而λ轻链 5’和 3’扩增引物有 10条。分析表明 ,人抗体可变区胚系基因与 5’引物有较好的匹配率 ,数目较少 ,匹配率较高。PCR结果显示 ,全部的重链及轻链引物对均能高效扩增出特异性较高的目的片段。测序结果表明PCR扩增产物具有较好的亚类和可变区家族分布。结论 优化了一套扩增全套人抗体Fd片段和L基因的引物 。

抗体Fab片段的表达与应用研究进展

目前,抗体Fab片段在癌症、病毒感染和炎症等疾病的诊断治疗中越发重要,占抗体市场份额逐渐上升。相对于全长抗体,抗体Fab片段具有无须N糖基化、可用原核系统进行表达、分子小、免疫原性低等优势,使之成为研究的热点。大肠杆菌由于遗传背景清晰、使用广泛、生产成本低,因而常作为原核表达宿主。本文综述了大肠杆菌系统抗体Fab片段产量低的解决方法、Fab抗体的临床应用,并结合当前研究现状展望了Fab抗体生产的研究方向。

非竞争性ELISA法测定人源抗HBsAg Fab功能性亲和常数

目的 测定完全人源化基因工程抗体HBsAgFab的亲和常数。方法 采用非竞争性ELISA固相法 ,经确定最佳抗原包板浓度、最佳抗原包板时间及最佳抗原与抗体结合反应时间后 ,得到了HBsAg与抗体片段抗HBsAgFab及完整抗体抗HBsAgIgG的抗原抗体结合反应曲线 ,计算出抗HBsAgFab及抗HBsAgIgG的亲和常数。结果 人源基因工程抗体抗HBsAgFab的功能性亲和常数在 10 7～10 8M 1水平 ,比完整抗HBsAgIgG仅仅小约 1个数量级 (10 8～ 10 9M 1)。结论 该基因工程抗体与抗原结合能力较强 ,为今后开发应用Fab进行生物导向治疗提供了理论基础。

抗角蛋白Fab抗体在大肠杆菌中的表达与复性研究

目的 :用大肠杆菌分别表达抗角蛋白抗体的轻链和Fd片段 ,体外复性得到Fab抗体。方法 :从已构建的质粒p3MH/Fab中 ,亚克隆抗角蛋白抗体的轻链和Fd片段基因 ,并分别插入载体pET32a中 ,构建重组质粒。以重组质粒分别转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,在IPTG诱导下进行表达。SDS PAGE分析发现 ,在相对分子量 (Mr)为 2 5 0 0 0处有外源蛋白表达。轻链和Fd片段变性后等量混合于折叠液中 ,复性后形成Mr 约为4 5 0 0 0的蛋白。结果 :成功地表达抗角蛋白抗体的轻链和Fd片段 ,ELISA和Westernblot证实 ,复性产物具有与角蛋白结合的能力。结论 :获得了具有活性的抗角蛋白的Fab抗体 ,为其应用研究打下了基础 ,也表明包涵体表达基因工程抗体技术是可行的。

IgG Fab-BPI融合蛋白真核表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达

目的构建抗抗LPSFab-BPI真核表达载体,并在CHO细胞中表达。方法通过RT-PCR,获得广谱抗LPSmAbC3A2IgG的Fd和完整轻链LCcDNA片段。在分别构建了pcDNA3-Fd和pcDNA3-LC表达载体的基础上,将包括BPIN端抗LPS活性中心的180bpDNA片段,通过一段长16个氨基酸的linker连接于上述Fab表达载体中Fd基因的下游,构建成Fab-BPI融合蛋白FB真核表达载体。将pcDNA3-LC质粒中包括hCMV启动子、LC和BGHpolyA等序列在内的片段,插入到pcDNA3-Fd中hCMV启动子上游,从而构建成单质粒的Fab-BPI表达载体pcD-NA3-FB,转染真核细胞。结果序列测定表明,重组质粒构建正确。pcDNA3-FB转染CHO细胞后,经ELISA、免疫荧光和mR-NA鉴定表达成功,免疫印迹试验显示,与抗κ轻链和抗BPI抗体反应的蛋白区带的Mr均为60000左右。交叉反应试验证明,Fab和FB与多种革兰氏阴性菌的LPS有交叉反应性。结论成功地在CHO细胞中表达出了抗LPSFab-BPIFB融合蛋白。FB作为融合蛋白,集广泛交叉反应性和强大中和活性于一身,有可能成为更适于临床应用的新的抗LPS免疫制剂。

筛选Fab抗体库的细菌展示技术的建立

目的:利用NlpA蛋白的前六个氨基酸(CDQSSS)将抗体锚定在细菌内膜建立筛选Fabs抗体库的展示技术,为今后抗体的研发工作奠定基础。方法:从pNAD质粒中克隆出NlpAleader(含有CDQSSS序列)基因序列,利用相应的酶切位点将该序列插入pComb3表达载体中构建成用于展示Fab的重组质粒pBFD。将从pEAI质粒克隆得到的anti-human IL-1β抗体的重链Fab和全长轻链分别插入到NlpAleader和pelBleader(pComb3载体自带的果胶酶基因前导肽)的下游。将pBFD-Fab转入到E.coli DH5α中诱导表达,原生质球制备后,采用梯度浓度的抗原进行孵育,最后经流式细胞术(FCM)检测抗体展示情况并且分选阳性群体,利用质粒提取的方法来替代PCR方法拯救阳性基因,转化E.coli DH5α,利用FCM再次检测该群体展示的抗体与抗原结合情况。结果:所展示的anti-hIL-1β Fab抗体依次与抗原和FITC标记的抗原特异性抗体孵育后,用FCM实时检测,结果显示出很强的荧光信号并且表现出抗原浓度依赖性。拯救出的pBFD-Fab-原生质球的FCM检测结果与首次展示的FCM结果一致,该系统能够稳定的展示抗体。结论:经过该细菌展示系统展示的Fab抗体能够有效的折叠,与相应的抗原具有很好的特异性结合能力。成功改进该展示技术的基因拯救方法,避免了基因突变和链置换的发生。此外还证明了该展示技术具有很好的稳定性。本实验成功构建了筛选Fab抗体库的细菌展技术。