代谢组学在感染性疾病中的研究进展

感染性疾病是全球严重的公共卫生问题之一,对人类健康危害性极大。近年来,代谢组学逐步应用于感染性疾病的研究中,以了解小分子水平的宿主-病原体相互作用,通过基于核磁共振(NMR)或基于质谱(MS)的代谢组学筛选疾病特异性生物标志物,为预防疾病及探索病因、发病机制等方面带来新的机遇。本综述讨论了代谢组学技术在生物标志物筛选和病毒、细菌、寄生虫感染等感染性疾病中代谢物的发现以及免疫代谢组学的应用,以期为感染性疾病的诊断研究提供新的依据。

猪链球菌重组磷酸ABC转运体ATP酶的免疫保护效果评价

猪链球菌(S.suis)是一种重要的人畜共患病原菌,给养猪业造成重大的经济损失。为了评估猪链球菌磷酸ABC转运体ATP酶蛋白的免疫保护效果,本研究构建了猪链球菌磷酸ABC转运体ATP酶原核表达载体进行蛋白的重组表达,纯化并制备该重组蛋白的亚单位疫苗,加强免疫接种后两周,检测其血清抗体效价、免疫保护率、各脏器载菌量以及炎性因子表达情况。结果显示,该蛋白经大肠杆菌表达后主要以可溶形式存在。ELISA检测表明该蛋白可以诱发小鼠产生高水平IgG抗体,免疫组小鼠抗体水平显著高于对照组,该重组蛋白对小鼠感染2型猪链球菌(S.suis serotype 2,S.suis 2)的保护率达到60%,显著降低了小鼠大脑、心脏及肺脏的载菌量,免疫组小鼠细胞因子IL-1β、IFN-γ、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA表达显著上调。研究表明猪链球菌重组磷酸ABC转运体ATP酶蛋白具有较强的免疫原性,是猪链球菌病潜在的亚单位疫苗候选蛋白。

鸭瘟病毒gG基因缺失株的构建及其免疫保护效果研究

鸭瘟病毒(DEV)是引起鸭高致死率的重要病原。为探究gG基因对DEV疫苗株免疫保护效果的影响,本研究在本实验室已构建的DEV疫苗株细菌人工染色体感染性克隆pDEV-EF1的基础上,通过“Red E/T两步重组”技术,构建DEV gG基因缺失的感染性克隆pDEV-ΔgG,对其进行酶切、PCR及测序鉴定。将p DEV-EF1和pDEV-ΔgG分别转染CEF细胞,待两组细胞均出现荧光后,收获细胞培养物反复冻融3次后,连续传至20代,每隔5代采用PCR及测序鉴定,分析p DEV-ΔgG的遗传稳定性,并采用western blot进一步鉴定,结果显示,正确构建gG基因缺失株,且能在CEF上稳定传代,命名为rDEV-ΔgG。将rDEV-ΔgG和亲本病毒rDEV-EF1接种CEF,测定体外生长曲线和测定蚀斑形成能力。结果显示,rDEV-ΔgG和rDEV-EF1的病毒滴度在24 h~72 h呈上升趋势,均在72 h时达到高峰,且二者的病毒滴度无显著差异;rDEV-ΔgG感染CEF后形成的蚀斑较亲本病毒rDEV-EF1产生的蚀斑面积减小27.37%。将r DEV-ΔgG以不同剂量免疫30日龄麻鸭2周后,进行DEV攻毒试验,观察各组鸭的临床症状,统计各组麻鸭的存活率,攻毒后1 d到9 d采集各组鸭肛拭子,并在攻毒后2 d、4 d、6 d和8 d各组分别随机剖杀3只麻鸭,取其各脏器组织,经荧光定量PCR分别检测各组麻鸭各脏器病毒载量及排毒情况。攻毒试验结果显示,1.0×10^(5)TCID_(50)和1.0×10^(4)TCID_(50)rDEV-ΔgG免疫的麻鸭在强毒攻击下的保护率较相同剂量rDEV-EF1免疫的麻鸭均下降17%。各脏器病毒载量结果显示,在攻毒后2 d麻鸭胸腺的病毒载量最高,其次是脾脏,在攻毒后4 d,麻鸭食道、泄殖腔、胸腺病毒载量较高。泄殖腔排毒结果显示,攻毒后1 d~4 d泄殖腔排毒量持续升高,并攻毒后4 d各组麻鸭的排毒量达到峰值。本研究比较了gG基因缺失病毒rDEV-ΔgG和亲本病毒rDEV-EF1的生物学特性和免疫保护效果差异,为明确gG在DEV基因组中的功能提供研究基础。

口服卵黄抗体对杂交鳢弹状病毒(HSHRV)感染的免疫保护效果

为了研究抗杂交鳢弹状病毒(hybrid snakehead rhabdovirus,HSHRV)卵黄抗体的制备方法并评价其免疫保护效果,将杂交鳢弹状病毒经白油乳化制备疫苗,免疫蛋鸡收集高免蛋,采用喷雾干燥方法制备成卵黄抗体粉,以细胞中和试验评估卵黄抗体中和病毒的效果。按照每kg鱼投喂卵黄抗体0.25 g、0.40 g、0.60 g的比例制备低、中、高3种添加剂量的饲料,持续投喂杂交鳢10 d,在口服免疫第4天时以104 TCID50/0.1mL的杂交鳢弹状病毒江门I株(HSHRV-JMI)病毒经腹腔注射对杂交鳢进行攻毒,并记录6 d内各组死亡情况。结果显示,四次免疫后卵黄抗体中和效价达到高峰,为1∶46.8,抗体维持时间为60d。高中低剂量组的存活率分别为64.4%、70.6%、78.5%;相对保护率分别为61.1%、67.9%、76.5%,三者均显著高于非特异性卵黄抗体对照组(P<0.001)。表明杂交鳢弹状病毒能有效刺激卵黄抗体产生,高效价卵黄抗体经口服免疫后可以有效抑制杂交鳢弹状病毒的侵染,显著提高杂交鳢存活率和相对保护率。

鱼类迟缓爱德华氏菌肠溶口服疫苗的制备及免疫保护效应研究

本文采用海藻酸钠作为载体,采用乳化复沉淀方法包裹迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)全菌制备疫苗微球。制备工艺研究结果表明:3%(m/v)海藻酸钠溶液,4%(m/v)CaCl_(2)溶液,水油相比1∶2,乳化剂Span801%,搅拌速度1200 r/min为最佳制备工艺,微球包埋率达91.04%,微球平均粒径(16.51±11.87)μm。通过人工胃肠液对疫苗微球的耐受性进行分析,微球在体外人工模拟胃液和肠液中16h释放率分别为0.8%和98.1%。用表达有绿色荧光蛋白的大肠杆菌做示踪标记,口灌免疫半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Gunther),疫苗能耐受胃的酸性环境影响,通过前消化道到达后肠。免疫保护效应研究表明,口腔灌注疫苗后,出现特异性和非特异性免疫应答,疫苗组在初免后第14天血清效价达到峰值1∶322;外周血白细胞吞噬率在初免后第14天达到峰值27.06%,吞噬指数在初免后第14天达到峰值1.65。初免后第28天用迟缓爱德华氏菌活菌攻毒,对照组死亡率58.82%,疫苗组死亡率13.33%,免疫保护率为77.33%。本研究优化了鱼类肠溶口服疫苗的制备工艺,疫苗免疫评价结果表明,该口服疫苗可以有效激活鱼体免疫反应,预防鱼类疾病发生。

共表达膜结合型与可溶性H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白的重组基因Ⅶ型新城疫病毒的构建及免疫效果评价

旨在构建能高效稳定表达H9N2 AIV的HA蛋白的重组基因Ⅶ型新城疫病毒,有望开发抗新城疫和H9N2亚型禽流感病毒的二联疫苗,为控制H9N2 AIV和NDV提供新的防御思路,对NDV疫苗载体的构建和优化有重要的参考意义。利用反向遗传技术,以rDHN3-mF为骨架,在病毒基因组的P和M之间的非编码区插入全长膜结合HA和另外一个带有截短跨膜结构域的可溶性HA蛋白,获得了能高效稳定表达H9N2 AIV的HA蛋白的基因Ⅶ型NDV减毒株重组病毒rDHN3mF-HA和rDHN3mF-2HA。通过鸡胚接种、Western blot、血凝效价(HA)及平均鸡胚致死时间(MDT)等试验来检测重组病毒的稳定性以及生物学特性,将重组病毒以10~6 EID_(50·)只^(-1)剂量免疫7日龄SPF鸡并测定血凝抑制(HI)抗体,在免疫后28 d对各组进行攻毒保护试验。结果显示:重组病毒在鸡胚中连续传至十五代后HA基因无突变发生;Western blot证明重组病毒可稳定高效地表达特异性的HA蛋白;重组病毒的生长曲线说明了重组病毒与亲本毒株具有相似的复制特性和低毒力特征;重组病毒免疫组的SPF鸡均能产生针对NDV或者H9N2 AIV的特异性HI抗体;攻毒保护试验结果:重组病毒均能对攻毒后的鸡产生100%保护效果;喉、肛拭子检测结果说明重组病毒可显著减少NDV与H9N2 AIV的体外排毒;气管与肺qPCR检测结果显示攻毒后3 d, rDHN3mF-2HA较rDHN3mF-HA更显著地降低了脏器中H9N2 AIV含量。本研究成功构建了共表达膜结合型与可溶性H9N2亚型禽流感HA蛋白的基因Ⅶ型重组NDV,为H9N2 AIV和NDV的一种新型重组基因工程二联活载体疫苗的研制与应用奠定了基础。

致病性螺旋体黏附素的研究进展

致病性螺旋体的独特侵入、定植、播散和在宿主体内持续生存能力与其表面黏附素密切相关。螺旋体黏附素主要功能是介导其对宿主细胞外基质成分、细胞表面受体、宿主血清和细胞外液成分的黏附。螺旋体黏附素在免疫中的重要作用包括诱导保护性免疫、激活炎症反应,以及通过抗原变异和补体抵抗,导致螺旋体免疫逃逸和形成持久性感染。本文综述了梅毒螺旋体、问号钩端螺旋体和伯氏疏螺旋体的主要黏附素在致病和免疫中作用的研究进展,为深入了解螺旋体的致病机制和设计新型螺旋体疫苗提供依据。

副猪革拉瑟菌影递送猪圆环病毒2型DNA二联疫苗的制备及小鼠免疫效果评价

本研究旨在研制猪圆环病毒2型(PCV2)-副猪革拉瑟菌(GPS)二联菌影疫苗,并评价其在小鼠上的免疫保护效果。选择GPS 5型菌株SH0165作为疫苗株,利用氢氧化钠最低抑菌浓度法将其制备成菌影,再将PCV2的ORF2基因克隆至pEGFP-N1真核表达质粒,将GPS菌影作为PCV2 DNA疫苗的载体,构建PCV2-GPS二联菌影疫苗,设计了商品化疫苗组、PCV2-GPS二联菌影疫苗组、菌影组、质粒组、PBS组、空白组,对4周龄BALB/c小鼠进行免疫,测定免疫后PCV2和GPS的IgG抗体效价、PCV2中和抗体、脏器中PCV2病毒载量、血清杀菌率、GPS攻毒保护率以及血清中细胞因子(IFN-γ、IL-12)水平。结果显示:二联菌影疫苗组小鼠血清中PCV2和GPS的IgG抗体水平显著增高,PCV2中和抗体滴度提高,PCV2攻毒后的小鼠淋巴结和肺脏中病毒载量下降,血清杀菌率显著提高,GPS攻毒后免疫保护率达70%(7/10),小鼠血清中IFN-γ含量显著上调。综上表明,PCV2-GPS二联菌影疫苗显著激活了小鼠对PCV2和GPS的体液免疫反应和细胞免疫反应,且能够抑制PCV2在小鼠体内的增殖,对感染GPS的小鼠达到较好的保护效果,为新型安全高效的PCV2、GPS联合疫苗的研制提供了生物材料和实验数据。

布鲁氏菌外膜蛋白OMP10间接ELISA检测方法的建立及免疫原性评估

目的建立布鲁氏菌外膜蛋白OMP10间接ELISA检测方法,评价OMP10在小鼠体内的免疫效果。方法本研究表达和纯化了布鲁氏菌外膜蛋白OMP10,通过Western Blot进行验证,建立了OMP10间接ELISA检测方法,然后将OMP10与弗氏佐剂和LDH佐剂配伍成2种亚单位疫苗,免疫小鼠后检测抗体水平、脾脏淋巴细胞的增殖水平、CD4^(+)和CD8^(+)T细胞比值以及细胞因子分泌,最后通过攻毒试验评估OMP10的免疫保护效果。结果OMP10作为诊断抗原的特异性和符合率均高于70%;免疫小鼠后2种亚单位疫苗均能产生高滴度的IgG抗体,CD4^(+)/CD8^(+)T的比值均高于PBS对照组,IFN-γ高于PBS对照组,差异具有统计学意义(P<0.01),但IL-4未发生明显变化,表明OMP10能够诱导很好的体液免疫及Th1型免疫应答。免疫保护结果显示,2种亚单位疫苗免疫组小鼠脾脏指数和脾脏载菌量低于布鲁氏菌M5感染组,差异具有统计学意义(P<0.01),表明OMP10蛋白配伍的亚单位疫苗对布鲁氏菌M5感染小鼠具有高度的保护作用。结论外膜蛋白OMP10在布鲁氏菌诊断和疫苗方面具有一定的应用价值。

大型艾美耳球虫重组蛋白GAPDH对兔的免疫保护效果评价

本研究旨在评价大型艾美耳球虫重组蛋白(rEm-GAPDH)对兔的免疫保护效果,为大型艾美耳球虫重组亚单位疫苗的研制奠定基础。根据转录组数据筛选出Em-GAPDH基因,进行原核表达与蛋白纯化;将50只45日龄无球虫感染幼兔随机分为5组(空白对照组、不免疫攻虫组、Trx-His-S tag攻虫对照组、Quil-A saponin攻虫对照组和rEm-GAPDH免疫组),分别经颈部皮下注射1 mL PBS、1 mL PBS、1 mL PBS含100μg pET-32a空载蛋白和1 mg Quil-A、1 mL PBS含1 mg Quil-A、1mL 100μg rEm-GAPDH含1 mg Quil-A,首免14 d后同等剂量加强免疫,二免14 d后每只兔经口感染1×10^(5)个大型艾美耳球虫孢子化卵囊,观察各组兔临床症状,每周固定时间采血和称重,感染14 d后宰杀剖检并测定和统计各组兔的卵囊排出量、相对增重、特异性IgG抗体和细胞因子等。结果成功表达了重组蛋白rEm-GAPDH,大小在59 ku左右,且大部分表达在包涵体。免疫保护试验表明:感染后不免疫攻虫组出现症状,而免疫组症状不明显。rEm-GAPDH免疫组的卵囊减少率达57.16%,相对增重率显著大于不免疫攻虫组(P<0.05),ACI值为144.96。特异性IgG抗体水平、细胞因子(IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、TGF-β)水平均与对照组存在显著差异(P<0.05)。大型艾美耳球虫重组蛋白rEm-GAPDH可以减少增重损失和卵囊排出,能引发宿主体内的细胞免疫和体液免疫应答,具有一定免疫保护作用,可以作为大型艾美耳球虫重组亚单位疫苗的候选抗原。

基因工程疫苗在兽医领域的应用

基因工程疫苗即利用DNA重组技术,将病原的保护性抗原编码基因片段定向插入载体或表达系统中,使之能够实现体内或体外的高效表达进而制成疫苗,如亚单位疫苗、重组活载体疫苗、基因缺失疫苗和核酸疫苗等。相较于传统疫苗,基因工程疫苗能不断刺激机体免疫系统产生长期免疫;避免因病原体变异而造成免疫逃避;一个质粒载体可克隆多个抗原基因组成多价疫苗,提高了疾病的防治效率和效果,是未来的主要发展和研究方向之一。文章对基因工程疫苗在兽医领域的研究进展进行了概述,旨在为相应研究与实践提供一定参考。

日本血吸虫p53融合蛋白的表达及免疫保护效果评价

为评估日本血吸虫p53(Sjp53)蛋白的免疫保护效果,利用PCR扩增Sjp53基因,构建重组表达质粒pColdⅠ-Sjp53,并在大肠杆菌(E. coli)中诱导表达,用Western blot检测其免疫原性。将融合表达蛋白免疫小鼠评估其免疫保护效果,ELISA检测其特异性抗体水平。结果扩增到Sjp53基因2883 bp的编码区,构建的重组表达质粒pColdⅠ-Sjp53可在大肠杆菌中诱导表达并纯化得到约111 kDa的融合蛋白r Sjp53。应用r Sjp53结合ISA206佐剂免疫BALB/c鼠,可诱导高水平的特异IgG抗体。免疫血清可识别r Sjp53和日本血吸虫成虫抗原的相应条带,本研究表明r Sjp53具有良好的抗原性。r Sjp53在小鼠日本血吸虫病免疫保护试验中诱导了显著的肝脏减卵率,为35.34%。本研究结果为进一步研究日本血吸虫p53基因的功能提供了理论基础。

斯氏艾美耳球虫3-磷酸甘油醛脱氢酶重组蛋白对兔的免疫保护效果评价

旨在评价斯氏艾美耳球虫重组蛋白Es-GAPDH对兔的免疫保护效果,为兔斯氏艾美耳球虫重组亚单位疫苗的研制奠定基础。利用相对荧光定量PCR分析Es-GAPDH在斯氏艾美耳球虫不同发育时期的转录水平,并对Es-GAPDH进行原核表达与蛋白纯化;然后将42只45日龄无球虫幼兔随机分为5组(空白对照组、不免疫攻虫组、Trx-His-S tag攻虫对照组、Quil-A saponin攻虫对照组和rEs-GAPDH免疫组),分别经颈部皮下注射1 mL PBS、1 mL PBS、1 mL PBS含100μg pET-32a空载蛋白含1 mg Quil-A、1 mL PBS含1 mg Quil-A、1 mL 100μg rEs-GAPDH含1 mg Quil-A,首免14 d后同等剂量加强免疫。二免14 d后除空白对照组外,其余各组实验兔经口感染1×10^(4)个斯氏艾美耳球虫孢子化卵囊,攻虫后观察各组临床表现,每周定时采血、称重,感染21 d后剖检观察肝组织病理变化,并测定和统计每组的相对增重、料肉比、肝指数、卵囊排出量、生化指标、特异性IgG抗体以及细胞因子等。结果发现,Es-GAPDH在斯氏艾美耳球虫各个发育阶段均有转录,且转录水平存在差异,在孢子化卵囊阶段转录水平最高。免疫保护试验表明:感染后不免疫攻虫组出现兔肝球虫病典型症状,而rEs-GAPDH免疫组症状不明显。rEs-GAPDH免疫组的卵囊减少率达87.09%,相对增重率显著大于三个攻虫对照组(P<0.05),特异性IgG抗体水平、细胞因子(IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、TGF-β)水平均与不免疫攻虫组存在显著差异(P<0.05),组织病理切片也显示,免疫组相较不免疫攻虫组肝组织被破坏程度低,虫体数量较少。综上,斯氏艾美耳球虫重组蛋白rEs-GAPDH可减少增重损失和卵囊排出,能引发宿主体内的细胞免疫和体液免疫应答,具有一定免疫保护作用,可作为斯氏艾美耳球虫重组亚单位疫苗的候选抗原。

嗜水气单胞菌分泌蛋白重组疫苗对斑马鱼的免疫保护效力评价

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是一种常见的水产致病菌,可引发人畜鱼共患疾病,对水产养殖业造成严重危害,因此预防其传播和感染是当前亟待解决的问题。为开发高效的潜在亚单位疫苗,并为防治嗜水气单胞菌病害提供理论依据,基于前期的研究结果,选取在嗜水气单胞菌强毒株LP-2中表达丰度较高的8种分泌蛋白(ORF0322、ORF3982、ORF2874、ORF1767、ORF3984、ORF2546、ORF0472、ORF1609)作为研究目标,首先利用实时荧光定量PCR(qPCR)技术对其进行基因表达检测,结果发现这8种分泌蛋白在细胞中均可正常表达;然后将这些蛋白进行基因克隆与表达纯化,并将纯化的重组蛋白免疫斑马鱼(Danio rerio),连续培养28 d后,发现斑马鱼中相关免疫基因均发生上调,说明这些分泌蛋白可引起宿主发生免疫反应;最后,对这8种分泌蛋白进行免疫保护评价,细菌攻毒实验结果显示,其中6种分泌蛋白(ORF3982、ORF2874、ORF1767、ORF3984、ORF0472、ORF1609)的相对免疫保护率(Relative immune protection rate,RPS)大于50%,可作为候选疫苗开发。

旋毛虫肌幼虫排泄分泌抗原诱导的肠道免疫保护作用研究

目的 研究旋毛虫肌幼虫排泄分泌抗原(Trichinella spiralis muscle larvae excretory-secretory, Ts-Es)诱导小鼠肠道保护性免疫能力以及免疫调节作用。方法 54只BALB/c小鼠随机分为3组,空白对照组、旋毛虫感染组(Ts)、旋毛虫Ts-Es抗原免疫组(Ts-Es)。空白组小鼠腹腔注射PBS;抗原免疫组小鼠腹腔注射0.1 mL的Ts-Es抗原与等量弗氏完全佐剂;旋毛虫感染组腹腔注射PBS和弗氏完全佐剂,每隔7 d注射1次,共3次,末次注射后7 d旋毛虫感染组和Ts-Es抗原免疫组用400条/mL旋毛虫感染性幼虫灌胃攻击感染。解剖取材,检查肠道成虫及肌肉幼虫减虫率,用HE染色法观察肠道病理变化,RT-qPCR法检测小肠中目的基因mRNA表达水平。结果 与旋毛虫感染组相比Ts-Es抗原免疫组成虫和肌幼虫减虫率分别为49%(t=8.109,P<0.05)和67%(t=8.090,P<0.05);与空白对照组相比旋毛虫感染组小肠T-bet(t=5.25,P<0.05)、GATA3(t=2.50,P<0.05)、RORγ-t(t=4.71,P<0.05)、IFN-γ(t=3.17,P<0.05)、IL-4(t=2.60,P<0.05)、IL-5(t=3.05,P<0.05)、IL-17A(t=4.88,P<0.05) mRNA表达量升高,Foxp3表达量没有统计学差异(t=1.55,P>0.05);与旋毛虫感染组相比Ts-Es抗原免疫组T-bet(t=4.23,P<0.05)、RORγ-t(t=4.30,P<0.05)、IFN-γ(t=3.02,P<0.05)、IL-17A(t=3.17,P<0.05) mRNA表达量下降;GATA3(t=3.96,P<0.05)、Foxp3(t=2.76,P<0.05)、IL-4(t=5.16,P<0.05)、IL-5(t=3.69,P<0.05)、IL-10(t=2.61,P<0.05) mRNA表达量升高;与空白对照组相比Ts-Es抗原免疫组GATA3(t=6.4,P<0.05)、Foxp3(t=4.32,P<0.05)、IL-10(t=2.6,P<0.05)、IL-4(t=7.26,P<0.05)、IL-5(t=6.3,P<0.05) mRNA表达量升高均有统计学差异;RORγ-t(t=0.41,P>0.05)、T-bet(t=1.02,P>0.05)、IFN-γ(t=0.09,P>0.05)、IL-17A(t=1.80,P>0.05) mRNA表达量无统计学差异;肠道HE染色结果显示,与旋毛虫感染组相比抗原免疫组炎症好转,肠道HE染色结果显示,与旋毛虫感染组相比抗原免疫组炎症好转。结论 Ts-Es抗原免疫小鼠后可诱发转录因子GATA3,Foxp3相关的混合型免疫应答,并抑制旋毛虫感染引起的T-bet、RORγ-t所介导的炎症型免疫反应,抑制炎型细胞因子的释放,诱导宿主产生抗旋毛虫感染的免疫保护效果。

日本血吸虫rSj338及膜蛋白rSj22.6抗原表位联合免疫对小鼠的保护性研究

目的 观察日本血吸虫 (中国大陆株 )的线粒体相关蛋白 r Sj338及膜蛋白 r Sj2 2 .6有效抗原表位混合后对小鼠的免疫保护性 ,为将来复合疫苗的研制提供理论依据。方法 分别用特异性抗r Sj338抗体和抗 r Sj2 2 .6的抗体筛选噬菌体随机 12肽库 ,将获得的 r Sj338的有效抗原表位与r Sj2 2 .6有效抗表位混合后免疫 BAL B/ c小鼠 ,并与 r Sj338的有效抗原表位混合免疫组进行比较。结果 r Sj338的 4种表位和 r Sj2 2 .6抗原的 4种表位混合免疫组小鼠获得了 4 5 .4 % (P<0 .0 1)的减虫率及 5 9.1% (P<0 .0 1)肝总减卵率 ,r Sj338的 4种表位混合免疫组小鼠获得了 34.2 % (P<0 .0 1)的减虫率及 4 6 .8% (P<0 .0 1)肝总减卵率 ;r Sj3384种表位和 r Sj2 2 .6的 4种表位混合免疫组获得的减虫率和肝总减卵率均高于 r Sj338的 4种表位混合免疫组 ,差异有显著性 (P<0 .0 5 )。

堆型艾美耳球虫cSZ1基因在减毒沙门氏菌的表达及免疫保护效果研究

用PCR方法扩增堆型艾美耳球虫广东株子孢子表面抗原基因cSZ1的阅读框架 (ORF) ,与质粒表达载体pYA3342连接后转化大肠杆菌E-coliX6 2 12 ,获得阳性重组质粒后将其电转化至减毒鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)X4 5 5 0。经IPTG诱导获得了cSZ1基因在减毒S typhimurium的高效表达 ,表达产物占菌体总蛋白的 9 2 % ,重组蛋白分子量约为 19kDa。将重组减毒S typhimurium分别以 10 8或 10 9CFU 鸡经口免疫 4日龄岭南黄肉鸡 ,免疫后两周血清中可检测到抗cSZ1的特异性IgG ,3周时抗体水平达到峰值 ;2 5日龄时可在肠道检测到特异性IgA的分泌。免疫后 3周 ,试验鸡分别经口攻击感染 5 0 0个E acervulina孢子化卵囊 ,结果显示免疫组与非免疫组有相似的排卵囊曲线 ;计数攻虫感染后第 3 5～ 9 5天卵囊总产量 ,2个免疫组分别能降低 2 5 . 1%和 4 6 . 4 %的卵囊产生。

弓形虫pcDNA3-p30-ROP2-HSP70复合核酸疫苗免疫保护性的研究

目的研究pcDNA3-p30-ROP2-HSP70复合核酸疫苗的免疫保护作用。方法 150只BALB/c小鼠随机分为5组,其中3实验组,每鼠分别肌肉注射pcDNA3-p30-ROP2-HSP70、pcDNA3-p30-ROP2、pcDNA3-ROP2各50μg;2对照组每鼠分别注射pcDNA3空质粒50μg、PBS 50μL。共免疫3次,每次间隔2w,末次量加倍。末次免疫后2w,各组分别取6只小鼠的血清和脾组织,检测CD4+、CD8+及各细胞因子。各组其余小鼠腹腔注射RH株弓形虫速殖子500个/每鼠,观察其存活时间等。结果 pcDNA3-p30-ROP2-HSP70复合核酸疫苗能诱发小鼠产生细胞免疫和体液免疫反应。小鼠血清抗体滴度高并能识别重组ROP2蛋白抗原;免疫接种后CD4+和CD8+均增殖明显,组间有显著性差异(F=45.00,P<0.01;F=15.01,P<0.01),实验组CD4+/CD8+比值增加明显,各组间有显著性差异(F=9.17,P<0.01);其脾、淋巴结细胞培养液及血清中白细胞介素2(IL-2)、IL-4、IL-12、γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子(TNF)均有不同程度的升高,尤其是血清中升高最为显著。弓形虫攻击感染后,实验组与对照组比较,实验组小鼠存活时间明显延长。结论该复合核酸疫苗具有较强的免疫原性,能产生良好的免疫保护作用。

EnMIC2重组减毒沙门氏菌的构建及免疫保护效果研究

成功构建了表达鸡毒害艾美耳球虫(Eimerianecatrix)广东株(GD)微线蛋白2基因(EnMIC2)的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌,在IPTG诱导下获得了EnMIC2的高效表达,SDSPAGE分析表明,表达产物约占菌体总蛋白的8.6%,分子量大小约为35ku,与抗E.necatrix的高免血清进行WesternBlotting,结果为阳性。将重组减毒沙门氏菌以108和109CFU/鸡免疫4日龄岭南黄肉鸡,免疫后2周血清中可检测到特异性IgG,3周时抗体水平达到峰值,同时可在肠道检测到特异性IgA的分泌。免疫接种后3周,试验鸡分别经口攻击感染500个E.necatrix(GD)孢子化卵囊,结果显示免疫组与非免疫组有相似的排卵囊曲线;但108和109CFU免疫组的卵囊总产量分别能降低26.62%和48.92%。

日本血吸虫pcDNA3/SjCWL01核酸疫苗的构建及其对小鼠免疫效果观察

目的构建日本血吸虫pcDNA3/SjCWL01核酸疫苗并进行免疫保护效果观察,评价其作为疫苗的潜能。方法将日本血吸虫基因SjCWL01亚克隆入真核表达载体pcDNA3,构建目的基因真核表达质粒,将pcDNA3/SjCWL01质粒转化大肠杆菌DH5α,大量制备DNA疫苗并免疫小鼠3次,间隔2w,末次免疫后2w,用ELISA法检测免疫鼠血清特异性抗体效价,日本血吸虫尾蚴进行腹部皮肤攻击感染,感染后45d剖杀冲虫,分别计算减虫率,每克肝、粪卵减少率。结果重组DNA疫苗(pcDNA3/SjCWL01)与对照组比较,虫荷、每克肝卵、每克粪卵数分别下降了27.6%,39.5%,45.9%。结论表明pcD-NA3/SjCWL01疫苗可诱导小鼠产生部分抗血吸虫感染的保护力。