旋转微重力细胞培养系统下Indianhedgehogd转染兔BMSCs促进成软骨分化并抑制老化的实验研究

目的探讨模拟微重力环境下,Indianhedgehog(IHH)基因过表达对兔BMSCs成软骨分化的影响。方法取第2代兔BMSCs,分为旋转微重力细胞培养系统(rotary cell culture system,RCCS)组和传统组2个大组,每个大组进一步分为3个亚组,即IHH基因腺病毒载体转染组(RCCS 1组和传统1组)、绿色荧光蛋白腺病毒载体转染组(RCCS 2组和传统2组)及空白对照组(RCCS 3组和传统3组)。RCCS组细胞均在模拟微重力环境下进行成软骨细胞诱导分化;常规组在6孔板中进行常规细胞培养及成软骨细胞诱导分化。诱导分化过程中,检测IHH蛋白表达(ELISA法)及ALP活性;实时荧光定量PCR检测软骨及软骨肥大相关基因表达;Wertern blot法检测Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖(aggrecan,ANCN)蛋白表达;并取细胞爬片行甲苯胺蓝染色及膜联蛋白V(Annexin V)-cy3免疫荧光染色观察。结果转染后荧光显微镜下RCCS 1、2组可见明显绿色荧光,转染效率约95%。ELISA检测示,RCCS及传统1组IHH蛋白均明显高于2、3组(P<0.05);传统1组各时间点ALP活性均高于传统2、3组(P<0.05),RCCS 1组ALP活性仅于诱导分化3、7 d稍高于RCCS 2、3组(P<0.05)。实时荧光定量PCR检测示,传统1组在诱导分化早期高表达Ⅱ型胶原、ANCN,但在后期高表达Ⅹ型胶原、ALP及AnnexinⅤ(P<0.05);RCCS1组在诱导分化各时期均高表达软骨相关基因Ⅱ型胶原、ANCN、SOX9,且低表达软骨肥大相关基因Ⅹ型胶原、ALP及AnnexinⅤ(P<0.05)。Wertern blot法检测示,诱导21 d时传统1组Ⅱ型胶原蛋白表达量明显低于传统2、3组(P<0.05);RCCS 1组各时间点Ⅱ型胶原、ANCN蛋白表达量均明显高于RCCS 2、3组(P<0.05)。甲苯胺蓝染色示,诱导21 d时传统1组染色浅于传统2、3组,RCCS 1组各时间点染色均明显深于RCCS 2、3组;Annexin V-cy3免疫荧光染色示,各时间点传统1组红色荧光均强于传统2、3组,RCCS各亚组红色荧光表达均较弱且组间无明显差异。结论在模拟微重力环境下,IHH基因转染BMSCs可有效促进软骨生成,并抑制软骨老化或向成骨发展,适合软骨组织工程的需要。