单增李斯特菌(LM90)inlA单基因及inlB/inlA双基因缺失株的构建及其生物学特性初步研究

为探究内化素inlA、inlB基因缺失对单核细胞增生性李斯特菌(LM)生物学特性的影响,本研究采用同源重组技术构建了inlA基因缺失株(LM90-inlA)和inlB、inlA双基因缺失株(LM90-ΔinlB/ΔinlA),并对其生物学特性进行了初步研究。结果显示:PCR和测序结果证实成功构建了目的基因(inlA、inlB)缺失株;菌落PCR和测序结果显示2种缺失株在体外连续培养20代过程中均能稳定遗传;生长特性实验表明2种缺失株与亲本株生长差异无统计学意义(t_(LM90/LM90-ΔinlA=0.34),p>0.05;t_(LM90/LM90-ΔinlB/ΔinlA)=0.324,p>0.05;t_(LM90-ΔinlA/LM90-ΔinlB/ΔinlA)=0.008,p>0.05)且inlA缺失后2缺失株对小鼠的LD_(50)分别升高了0.64、1.26个对数数量级。研究结果表明inlA基因和inlB基因对LM90的部分生物学特性具有一定的调控作用,这对于阐明LM毒力因子的致病机理提供了参考依据,也为研究内化素介导LM穿越血脑屏障(BBB)的作用机制奠定了科学基础。

单增李斯特菌inlB基因缺失株的构建及其生物学特性

为探究单增李斯特菌inlB基因缺失株的生物学特性,利用同源重组技术成功构建了inlB基因突变株(LM90-△inlB)。对突变株进行了溶血试验、细菌计数小鼠肝、脾和脑载菌试验测定、体外耐酸碱生长培养试验及鼠脑微血管内皮细胞侵袭、黏附、增殖试验。结果显示,突变株溶血活性无变化;小鼠肝脏载菌量突变株低于亲本株,但差异不显著,脾脏载菌量无差异;突变株的毒力显著降低,对小鼠半数致死剂量比野生型菌株有明显升高(P<0.05);在体外耐酸碱生长能力培养中,inlB突变株耐酸性没有改变,而耐碱能力强于亲本株;细胞黏附侵袭及增殖试验表明突变株明显低于亲本株(P<0.05)。说明inlB基因对LM90的毒力具有一定的调控作用,结果对于阐明LM毒力因子的致病机理提供了科学依据。

单核细胞增多性李氏杆菌野毒株InlB的分子特征及其表达和纯化研究

采用PCR技术扩增单核细胞增多性李氏杆菌TA野毒株内化索B（InlB）基因，进行编码分子的序列和结构分析，并克隆人大肠杆菌表达载体pET28a中诱导表达。该基因全长1893bp，编码630个氨基酸，其中前35个氨基酸残基构成信号肽序列。在推导的InlB蛋白氨基酸序列中，从N端到C端分别包括1个α-螺旋的Cap结构域、6个富含亮氨酸的重复基序（LRR）、1个免疫球蛋白样结构域（IR）、1段B重复序列和3个串联的GW结构域，同时还存在5个潜在的N-联糖基化位点，Leu占所有氨基酸残基的10．2％。与GenBank已经报道的18个不同流行株InlB基因相比，核苷酸和推导的氨基酸序列的同源性分别在91．1％～99．6％和92．3％～99，8％之间。重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE和Western blot分析证实该基因已经正确表达。用Ni^2＋亲和层析柱纯化了InlB重组蛋白。

单核细胞增生李斯特菌毒力基因inlB/actA双缺失突变株的构建

单核细胞增生李斯特菌inlB和actA毒力基因的编码产物InlB和ActA是与其致病性相关的重要毒力因子,与该菌在细胞间扩散、传播有着直接的关系,其中肌动蛋白聚集因子ActA是细菌由细胞浆扩散至相邻细胞所必须的因子,而内化素InlB在对肝细胞的侵袭过程中起着重要作用。本研究中利用同源重组技术在inlB缺失菌株基础上成功构建了毒力基因inlB和actA双缺失的突变株,获得减毒突变株,为构建预防人类和动物疾病的疫苗载体奠定了基础。

环境因素对单增李斯特菌inlB毒力基因表达的影响

针对单增李斯特菌毒力基因inl B设计五对引物,从中筛选出一对特异性强的引物,利用反转录荧光定量PCR技术来考察毒力基因表达的强弱。在不同环境因素条件下培养单增李斯特菌,分别提取菌体RNA,继而合成c DNA,以管家基因16S r RNA为内参基因,利用循环阈值（Ct）的变化计算inl B基因的相对表达量。结果表明,毒力基因inl B在温度为15℃、p H为6、氯化钠浓度为1.5%~2.0%、蔗糖浓度为0.75%~1.25%时能高效表达;温度为0℃和45℃、p H为4和9、氯化钠浓度为3.5%以上以及蔗糖浓度为0%~0.25%和2.25%以上时,对毒力基因inl B的表达起明显的抑制作用;在p H为6的条件下,酸的种类对毒力基因inl B的表达影响不大。

InlA／InlB基因的双缺失对单增李斯特菌毒力的影响

为了探讨InlA/InlB对单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)毒力的影响,本研究利用同源重组技术在LM△InlA菌株的基础上构建LMInlA/InlB基因双缺失株。通过小白鼠肝脾脑细菌计数、LD50和溶血实验,研究LM在InlA/InlB基因缺失后毒力上的差异。结果显示:LM△InlA/△InlB基因双缺失株与LM菌株相比,双缺失株的LD50升高2个数量级;与LM△InlA、LM△InlB菌株相比,双缺失株的LD50均升高1个数量级;双缺失菌株在小白鼠肝脏、脾脏和脑组织内的载菌量均显著减少(P<0.05);但没有改变其溶血特性。结果提示,InlA/InlB基因双缺失后,LM菌株的毒力能够明显减弱,但不改变其溶血特性。

不同来源单核细胞增多性李氏杆菌inlB和actA基因的克隆测序分析及基因缺失株的毒力试验

根据GeneBank上发表的单核细胞增多性李氏杆菌(Listeria monocytogenes,LM)的内化素B(internalin B,inlB)和肌动蛋白A(actin A,actA)基因设计特异性引物,对5株不同来源的健康绵羊单核细胞增多性李氏杆菌和一株临床分离的单核细胞增多性李氏杆菌的inlB及actA基因进行PCR扩增,克隆测序分析其序列,并对2株部分基因缺失的单增李氏杆菌进行小鼠攻毒试验。结果表明:5株健康绵羊分离株单增李氏杆菌与临床分离株有较高的同源性,并且发现2株部分基因缺失的单增李氏杆菌;小鼠攻毒试验表明缺失株毒力有降低,但是不明显。

单核细胞增生李斯特菌InlA、InlB和InlJ基因缺失株构建及对MBMEC细胞骨架与细胞紧密连接的影响

为探究InlA、InlB和InlJ对单核细胞增生李斯特菌(LM)毒力及在其侵袭MBMEC过程中对细胞骨架与细胞紧密连接的影响,本试验以致绵羊脑炎分离株LM90为亲本株,构建单基因缺失株LM90-△InlA、LM90-△InlB和LM90-△InlJ,通过LD50、溶血试验、MBMEC黏附侵袭、胞内增殖及细胞免疫荧光染色方法,研究LM缺失株和亲本株的差异。结果显示,InlA、InlB和InlJ基因缺失株的LD50分别比LM90高出101.5,101.3,101.33倍;对MBMEC的黏附率、侵袭率及胞内增殖都显著下降,且侵袭率差异显著(P<0.05),溶血性无变化;免疫荧光染色结果表明,InlB缺失株不能使MBMEC细胞骨架发生重排,InlA缺失株细胞骨架重排不明显,InlJ缺失株与亲本株则使细胞骨架完全破坏;LM90与InlA、InlB和InlJ缺失株都使MBMEC细胞间紧密连接蛋白呈不连续分布,而阴性对照则呈连续分布。结果表明,InlA、InlB和InlJ与LM毒力密切相关,且在LM侵袭MBMEC过程中,InlB影响MBMEC细胞骨架重排,InlA对其影响弱于InlB,InlJ则影响微弱或者不影响。LM可引起细胞间紧密连接改变,但InlA、InlB和InlJ在该过程中几乎不发挥作用。

双基因敲除减毒单增李斯特菌(ΔactA/ΔinlB)的构建及其生物学初步鉴定

减毒单增李斯特菌具有成为疫苗活载体的潜力,可同时引起MHCⅠ和MHCⅡ类抗原递呈系统,具有强烈激发CD8+和CD4+细胞免疫的能力。构建毒力基因缺失菌株进而评估其生物活性对于其作为疫苗活载体的开发尤为重要。本文采用同源重组技术构建单缺失菌株Lm-△act A和双缺失菌株Lm-△act A△/inl B,从生长状态、毒力基因表达和对Hep G2细胞侵袭能力方面探讨减毒菌株生物学特性。生长活性测定显示两种减毒菌株和野生型Lm(EGD-e)三者生长状况无差异;实时定量PCR结果显示act A基因缺失后,inl A基因表达水平上升两倍;act A和inl B基因双缺失后,plc B和hly基因的表达水平都有较大幅度的上升;侵袭Hep G2细胞结果显示act A基因缺失后侵袭能力增强、act A和inl B基因共同缺失后侵袭能力减弱。因此,减毒菌株的构建及其生物特性研究不仅对食源性致病菌Lm致病机理具有重要意义,也为构建预防人类和动物疫病的疫苗载体奠定了基础。

绵羊李斯特菌载体结核疫苗株inlB1基因缺失减毒株的构建及评价

目的对以绵羊李斯特菌(Listeriaivanovii,LI)为载体的结核疫苗候选株LI-Ag85C进行基因减毒,初步评价其体内外生物学特性。方法构建含有inlB1基因上、下游同源序列的打靶质粒,电转原始菌LI-Ag85C感受态细胞,同源重组敲除inlB1基因;测定减毒株LIΔinlB1-Ag85C和原始株LI-Ag85C的体外生长曲线;测定两株菌对于肝癌细胞系HepG2细胞的黏附、侵袭能力的影响,比较两株菌溶血能力的差异,两株菌对于小鼠的半数致死量(median lethal dose,LD_(50))差异。结果敲除inlB1基因的重组结核疫苗候选株LIΔinlB1-Ag85C的基因序列符合预期结果。减毒株与原始株的体外生长情况基本一致;对于HepG2细胞的黏附率分别为6.66%和7.46%,侵袭率分别为0.031%和0.042%,减毒株的黏附、侵袭能力均低于原始株,但差异无统计学意义;减毒株的溶血活性较原始株无明显变化;对小鼠的LD_(50)值分别为3.2×10^(8 )CFU/只和6.7×10^(7 )CFU/只,减毒株LD_(50)相较于原始株明显提高。结论成功构建inlB1基因缺失的新型结核疫苗候选株LIΔinlB1-Ag85C,其毒力较原始株降低。

单增李斯特菌inl A/inl B双基因缺失株生长特性观察及对小鼠致病性研究

目的探究单增李斯特菌inl A/inl B双基因缺失株的生物学特性。方法通过体外胁迫培养条件下OD600测定以及小鼠感染试验,对Lm90-△inlAB和Lm90的抗胁迫能力及细菌致病力进行研究。结果低温(4℃、30℃)环境下,Lm90和Lm90-△inlAB生长差异无统计学意义(t4℃=0.057,P>0.05;t30℃=0.441,P>0.05),适温37℃及42℃高温环境下,Lm90-△inlAB较Lm90生长受到抑制,生长差异具有统计学意义(t37℃=0.763,P<0.05;t42℃=1.147,P<0.05);体外耐酸碱试验中,Lm90-△inlAB耐酸性未明显改变,而耐碱能力强于亲本株Lm90,生长差异具有统计学意义(pH=9时t=2.837,P<0.05);在含有3.5%酒精的BHI培养基及含5%NaCl高渗BHI培养基中,Lm90-△inlAB增长趋势明显低于Lm90,生长差异具有统计学意义(t酒精=1.422,P<0.05;tNaCl=1.382,P<0.05),Lm90-△inlAB对酒精及高盐的耐受力显著低于Lm90;小鼠毒力测定结果表明,Lm90-△inlAB与Lm90半数致死量分别为106.94 CFU、105.68 CFU,Lm90-△inlAB毒力下降明显,在不同检测时间点Lm90-△inlAB在小鼠肝脏和脾脏内的载菌量均少于Lm90,载菌量差异具有统计学意义(t肝=2.454,P<0.05;t脾=2.443,P<0.05)。结论 Lm的抗胁迫能力可能随着基因的缺失发生显著改变,内化素InlA/InlB与单增李斯特菌侵染宿主的能力有一定的调控作用。缺失株生物学特性测定对研究Lm胁迫环境生存及毒力因子的致病机理提供了科学依据。

实时荧光环介导等温扩增技术检测熏肉中单增李斯特氏菌的研究

建立一种实时荧光环介导等温扩增方法(Real-Time Fluorescence Loop-mediated Isothermal Amplification,RTF-LAMP)来快速、灵敏地检测熏肉中单增李斯特氏菌。针对单增李斯特氏菌的特异性基因inl B设计4条LAMP引物,并建立一套最优的RTF-LAMP反应体系。对该方法进行特异性验证,同时对灵敏度和人工污染熏肉的检出限进行测定。3株单增李斯特氏菌被检测为阳性,17株非单增李斯特氏菌为阴性。表明引物具有良好的特异性。RTF-LAMP和传统LAMP检测单增李斯特氏菌的灵敏度分别为1.1×10~1、1.1×10~2 CFU/m L。通过对熏肉进行人工污染,得出RTF-LAMP的检出限为3.5×10~1 CFU/g。通过与国标方法GB 4789.30—2016进行对比并计算RTF-LAMP反应的敏感性,特异性和准确度,结果分别为100.00%、98.44%和98.46%。研究建立的RTF-LAMP能够实时、快速地检测熏肉中单增李斯特氏菌,具有良好的应用前景。