X盒结合蛋白1与肾移植相关损伤

缺血-再灌注损伤(IRI)和排斥反应是影响移植肾远期存活的主要因素。IRI或排斥反应引起内质网应激(ERS)可导致肾损伤,X盒结合蛋白1(XBP1)作为调控细胞稳态主要的ERS相关蛋白,通过肌醇需求酶1α(IRE1α)剪接内含子后生成剪接体XBP1,进而影响靶基因表达重塑细胞环境。适当的ERS可促进细胞存活,但超过阈值时XBP1表达过多会导致细胞失稳态或死亡,进而引起肾脏内环境失衡,这与肾移植相关损伤的发病机制和疾病进展相关。因此,XBP1的有效激活对应激损伤具有保护作用,有助于维持肾脏系统的活力和功能的完整性。本文评述了ERS通路IRE1α-XBP1、XBP1在肾实质细胞和免疫细胞中的作用、XBP1在肾缺血性损伤和排斥反应中的作用及靶向XBP1的临床检测和潜在疗法,探讨靶向XBP1对肾移植相关损伤的潜在价值,以期为改善肾移植预后提供新靶点和新方向。

肌醇需求酶1对顺铂所致小鼠耳蜗毛细胞凋亡的作用研究

目的 研究肌醇需求酶1(inositol-requiring enzyme 1,IRE1)对顺铂所致小鼠耳蜗毛细胞凋亡的作用。方法 分离生后3~5 d的健康昆明小鼠(500只)耳蜗基底膜并进行体外培养,24 h后随机分为对照组和不同浓度顺铂组(4、8、16和32μg/ml)(每组200条),再培养24 h。应用异硫氰酸荧光素(FITC)染色观察小鼠耳蜗毛细胞的缺失;应用Hoechst 33258和四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)标记的鬼笔环肽双重荧光染色观察小鼠耳蜗毛细胞的凋亡;并用Western blot检测小鼠耳蜗中p-IRE1α、p-JNK、Bax及caspase-3的蛋白水平。结果 与对照组比较,顺铂组小鼠耳蜗毛细胞缺失、细胞凋亡率以及p-IRE1α、p-JNK、Bax、caspase-3等蛋白水平显著增高(P<0.01),并且p-IRE1α与Bax、caspase-3表达和细胞凋亡率呈正相关(P<0.05)。结论 IRE1可能参与调控顺铂所致小鼠耳蜗毛细胞凋亡。

中药复方缓压乐对应激性高血压大鼠内质网应激IRE1信号通路的影响

目的探讨中药复方缓压乐(HYL)对应激性高血压(Stress induced hypertension,SIH)大鼠血管组织内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)肌醇需求因子1(Inositol-requiring enzyme 1,IRE1)信号通路的影响。方法取30只Wistar大鼠随机分为模型组,高、中、低剂量药物干预组和阳性对照组,每组6只,另取6只为正常组(不建模)。除正常组以外的大鼠进行间断足底电、噪声刺激12周,建立SIH模型;在造模期间,模型组大鼠每天用蒸馏水灌胃,药物干预组大鼠每天灌胃不同剂量的HYL,阳性对照组大鼠每天灌胃依普利酮溶液。造模期间检测各组大鼠尾动脉收缩压和舒张压;用RT-qPCR检测大鼠胸主动脉组织ace、at1r基因的mRNA表达水平;用IHC法对胸主动脉组织X盒结合蛋白1(X-box binding protein-1,XBP1)的表达进行定位和定量;用Western blot检测血管组织总受磷蛋白(phospholamban,PLB)、p-PLB、p-IRE1及XBP1相对表达水平。结果(1)与正常组相比,模型组、中及低剂量组大鼠收缩压和舒张压明显升高(P<0.05),高剂量组与阳性对照组无明显变化(P>0.05)。(2)与正常组相比,模型组大鼠胸主动脉组织ace、at1r基因mRNA表达水平均上调;与模型组相比,高剂量组和阳性对照组中ace、at1r基因mRNA表达水平均下调(P<0.05)。(3)与正常组相比,模型组和低剂量组大鼠胸主动脉组织血管平滑肌细胞中XBP1蛋白总表达量明显增多(P<0.05);相对于模型组,高剂量组和阳性对照组中XBP1蛋白染色淡、阳性表达低,且总表达量明显减少(P<0.05)。(4)相较于正常组,模型组、中及低剂量组总PLB、p-IRE1、XBP1表达量均明显上调,p-PLB表达量明显下调(P<0.05);与模型组相比,高剂量组及阳性对照组中总PLB、p-IRE1、XBP1表达量均明显下调,而p-PLB表达量明显上调(P<0.05)。结论HYL通过调节SIH大鼠血管组织PLB的活性、且抑制IRE1信号通路相关蛋白表达水平,降低血管组织ERS,从而发挥降低血压的作用。

内质网应激通路相关蛋白IRE1、PERK、ATF6在舌鳞癌中的表达及其功能的生物信息学分析

目的:本研究旨在通过生物信息学方法系统分析肌醇需求酶1(Inositol-Requiring Enzyme 1,IRE1)、蛋白激酶R样内质网激酶(Protein Kinase R-like Endoplasmic Reticulum Kinase,PERK)、激活转录因子6(Activating Transcription Factor 6,ATF6)在舌鳞癌中的表达及意义。方法:使用GEO、Kaplan-Meier Plotter、GeneMANIA、DAVID等多个数据库对IRE1、PERK、ATF6在舌鳞癌中的表达与预后价值、相互蛋白作用网络及功能富集进行综合分析。结果:ATF6在舌鳞癌组织中表达高于癌旁正常组织,差异具有统计学意义(P <0.05)。IRE1及PERK高表达组患者总生存率(OS)高于低表达组,ATF6高表达组患者OS低于低表达组,差异均具有统计学意义(P <0.05)。本研究筛选出与IRE1、PERK、ATF6相互作用的蛋白质各20个并进行GO富集分析。IRE1及相关蛋白富集于内质网、线粒体等细胞组分中,具有蛋白质结合、蛋白磷酸酶结合等分子功能,参与内质网应激反应、泛素依赖性ERAD途径等生物学过程。PERK及相关蛋白富集于胞液、细胞膜等细胞组分中,具有翻译起始因子活性、RNA结合等分子功能,参与内质网未折叠蛋白反应、细胞对葡萄糖饥饿的反应等生物学过程。ATF6及其相关蛋白富集于内质网、细胞核等细胞组分中,具有转录调控区序列特异性DNA结合、蛋白质异二聚化活性等分子功能,参与RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、内质网未折叠蛋白反应等生物学过程。结论:ATF6在舌鳞癌组织中呈现高表达,同IRE1、PERK与舌鳞癌患者不良预后相关。在未来抗肿瘤治疗中,IRE1、PERK、ATF6可能成为舌鳞癌的诊断和治疗的新选择。

参芪益心方对异丙肾上腺素致心肌损伤大鼠IRE1、Cleaved Caspase-3的影响及作用机制研究

目的:探讨异丙肾上腺素诱导的心肌损伤及参芪益心方对肌醇需求酶1(IRE1)、裂解凋亡蛋白酶-3(Cleaved Caspase-3)的影响及作用机制研究。方法:将40只SD大鼠随机分为对照组、异丙肾上腺素组、曲美他嗪组、参芪益心方低剂量组和参芪益心方高剂量组。除对照组外,其余各组给予颈背部皮下注射异丙肾上腺素建模,实验连续2周后,对照组给予等量生理盐水,曲美他嗪组给予曲美他嗪混悬液每日5 mg/kg,参芪益心方低剂量组、高剂量组分别给予参芪益心方水煎剂每日10 g/kg、20 g/kg,对照组和异丙肾上腺素组给予等量生理盐水灌胃,实验连续2周。分别在实验给药2周末、4周末进行心电图、超声心动图检查。实验给药4周末苏木精-伊红(HE)染色观察各组心肌组织病理学改变,蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测各组心肌组织IRE1、Cleaved Caspase-3蛋白水平。结果:实验4周末,异丙肾上腺素组q波振幅加深、ST段抬高,且较对照组心率明显增快(P<0.05);曲美他嗪组q波振幅减小,参芪益心方低剂量组ST段抬高幅度减小;参芪益心方高剂量组ST段位于等电位线上,无明显偏移,参芪益心方治疗组相比异丙肾上腺素组心率明显降低(P<0.05)。实验4周末,与对照组比较,异丙肾上腺素组大鼠左室前壁舒张末厚度(Dist A)、左室后壁舒张末厚度(Dist C)减小,舒张末心室内径(Dist B)、收缩期心室内径(Dist D)增加,左室射血分数(LVEF)、左心室短轴缩短率(LVFS)明显减低;心肌组织IRE1、Cleaved Caspase-3蛋白表达水平明显升高(P<0.001)。与异丙肾上腺素组比较,各治疗组大鼠在药物干预后各项指标均有改善(P<0.05),且参芪益心方高剂量组优于参芪益心方低剂量组(P<0.05)。与异丙肾上腺素组比较,曲美他嗪组心肌间质少量炎性细胞浸润,心肌纤维轻度肿胀;参芪益心方低剂量组和参芪益心方高剂量组纤维排列相对规则,断裂与空泡变性减少,并且参芪益心方高剂量组优于参芪益心方低剂量组。结论:内质网应激参与异丙肾上腺素诱导的心肌损伤,参芪益心方能够明显降低内质网相关因子IRE1、Cleaved Caspase-3水平,改善心肌损伤,其机制可能与抑制内质网应激的启动和凋亡信号通路有关,且高剂量治疗效果更明显。

结肠癌转移相关基因1、磷酸化需肌醇酶1蛋白在鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤组织中的表达及其与临床分期的关系

目的:探讨结肠癌转移相关基因1(MACC1)、磷酸化需肌醇酶1蛋白(p-IRE1)在鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤组织中的表达及其与临床分期的关系。方法:选取80例鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤患者作为研究对象,所有患者均行外科手术治疗,在手术过程中取患者鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤组织进行病理诊断,依照不同分期将所有患者分为四组,即T_(1)组(n=18),T_(2)组(n=23),T_(3)组(n=25)和T_(4)组(n=14),另选取20例同期体检的健康志愿者鼻腔黏膜组织作为对照组。对比五组受检者鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤组织和鼻腔黏膜组织MACC1和p-IRE1表达水平,并分析鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤临床分期与MACC1和p-IRE1的相关性。随后对所有鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤患者进行3年随访,将患者分为预后良好组(n=56)和预后不良组(n=24),对比两组患者临床一般情况与MACC1和p-IRE1表达水平,并应用Logistic回归分析鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤组织中MACC1和p-IRE1表达对患者的预后预测价值。结果:不同临床分期患者MACC1和p-IRE1组织表达水平对比差异有统计学意义(均P>0.05),T_(4)组明显高于T_(3)组、T_(2)组、T_(1)组和对照组(均P<0.05);Spearman相关分析结果显示MACC1和p-IRE1与鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤临床分期呈正相关(r=0.423、0.539,均P<0.05);预后良好组与预后不良组患者性别、年龄、是否初发情况对比无统计学差异(均P>0.05),两组患者临床分期、组织分化程度、MACC1和p-IRE1阳性情况对比有统计学差异(均P<0.05);Logistic回归分析表明:MACC1和p-IRE1为鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤的预后独立因素(均P<0.05)。结论:鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤组织中MACC1和p-IRE1阳性表达率明显高于健康鼻腔黏膜组织,且MACC1和p-IRE1表达水平与鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤的临床分期呈正相关。另外,可通过MACC1和p-IRE1阳性表达来预测鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤患者的预后情况,且MACC1和p-IRE1为鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤的预后独立因素。

鼻咽癌p-IRE1蛋白表达与放射治疗预后的关系

目的探讨磷酸化需肌醇酶1(p-IRE1)蛋白在鼻咽癌组织中的表达及其与放射治疗预后的相关性。方法选取2010年1月至2011年12月在我院首次行根治性调强放射治疗的鼻咽癌患者53例,免疫组化SP法检测鼻咽癌组织中p-IRE1蛋白表达水平,观察鼻咽癌患者放射治疗后生存期,分析p-IRE1蛋白表达水平与鼻咽癌患者临床病理特征、预后的关系。结果 53例鼻咽癌组织中p-IRE1阳性表达36例(67.9%),高表达14例(26.4%);p-IRE1蛋白表达水平与淋巴分期相关(P=0.033);多因素分析显示p-IRE1蛋白表达水平(P=0.026)、是否联合化疗(P=0.020)是鼻咽癌放射治疗的独立预后因素,p-IRE1高表达鼻咽癌患者放射治疗后死亡风险是低表达组的2.979倍。结论 p-IRE1蛋白可成为预测鼻咽癌放射治疗预后的新指标。

参附注射液对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑皮层IRE1α表达及神经元凋亡的影响

目的:观察参附注射液对缺氧缺血性脑损伤(HIBD)新生大鼠脑皮层中内质网应激关键分子-肌醇需求因子1α(inositol-requiring enzyme1α,IRE1α)表达及神经元凋亡的影响,探讨其脑保护机制。方法:参照Rice法制备HIBD模型,将7日龄SD大鼠随机分为假手术组(S)和HIBD模型组,模型组又分为生理盐水对照组(C)和参附治疗组(SF),各组按照观察时间点不同进一步分为3、6、12、24、72 h 5个亚组,每组均10只。HE染色光镜下观察脑组织病理变化;RT-PCR方法检测IRE1αmRNA的表达变化;Western blot方法检测IRE1α蛋白表达变化;流式细胞术检测神经元的凋亡率;结果:(1)RT-PCR:C组在HIBD后3、6、12、24 h时间点IRE1αmRNA表达量较S组升高(P<0.05);SF组各时间点IRE1αmRNA表达均较S组升高(P<0.05)。SF组在6、12、24、72 h时间点的IRE1αmRNA表达量较C组升高明显(P<0.05)。(2)Western blot:C组和SF组各时间点IRE1α蛋白表达量均较S组升高(P<0.05),SF组在6、12、24、72 h时间点的IRE1α蛋白表达量较C组升高明显(P<0.05)。(3)神经元的凋亡率:SF组各时间点的凋亡率均明显低于C组(P<0.05)。结论:参附注射液可能通过上调IER1α的表达,减少神经元凋亡来减轻新生大鼠缺氧缺血性脑损伤。

布雷菲德菌素A通过激活IRE1-XBP1信号通路增强顺铂诱导的人肺癌GLC-82细胞凋亡

长时间剧烈的内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)可启动ERS相关通路诱导细胞凋亡;而IREl-XBP1(肌醇需求蛋白1α-X盒结合蛋白1)为高度保守的ERS基本通路。它是最有前景的肿瘤治疗靶点之一。我们研究已证明,布雷菲德菌素A(brefeldin A,BFA)能增强顺铂(cisdichlorodiamine platinum,CDDP)的肺癌细胞杀伤作用,但其分子机制尚不清楚。本研究证明了IRE1-XBP1通路在该协同效应中的作用。Annexin V/PI双染结合流式细胞分析显示,与BFA或CDDP单独处理比较,BFA联合CDDP处理能增强人肺癌GLC-82细胞的凋亡。RT-q PCR和Western印迹揭示,与单独处理比较,BFA联合CDDP处理能增强GLC-82细胞的procaspase3转录本(mRNA)和蛋白质的表达,以及procaspase3的裂解激活,进一步证明了BFA联合CDDP处理可增强GLC-82细胞凋亡。最重要的是,RT-q PCR和Western印迹结果证明,与单独CDDP处理比较,BFA处理的GLC-82细胞中IRE1、XBP1水平明显上调(P<0.05),而BFA+CDDP处理的细胞中IRE1、XBP1水平进一步上调,超过BFA组(P<0.01)。结果提示BFA和BFA+CDDP处理细胞可激活ERS的IRE1-XBP1通路。这些结果证明,BFA可通过激活ERS中的IRE1-XBP1通路增强顺铂诱导的肿瘤细胞凋亡。本研究结果为IREl-XBP1是颇具前景的肿瘤治疗靶点提供了新的证据。

内质网应激中IRE1级联反应对动脉粥样硬化的作用

1概述内质网（endoplasmic reticulum,ER）蛋白质折叠在生理上是至关重要的,它的破坏导致内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）触发动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）发生发展。未折叠蛋白反应（unfolded protein response,UPR）是目前研究最为透彻的ERS信号通路,

行为学训练对血管性痴呆大鼠内源性神经干细胞增殖及肌醇需要因子1蛋白表达的影响

目的：检测肌醇需要因子l（IREl）在血管性痴呆海马神经干细胞中的表达及穿梭箱训练的干预作用，探讨影响神经干细胞增殖分化的分子调控机制。方法：采用大脑中动脉栓塞（MCAO）制作大鼠血管性痴呆模型，用免疫组织化学和免疫印迹检测海马神经干细胞BrdU、IREl的表达及穿梭箱训练的干预作用。结果：脑缺血再灌注第3天缺血海马神经元BrdU阳性细胞明显增多，第7天达高峰。IREl反应产物脑缺血再灌注第3天较正常组增多，随缺血再灌注时间的延长逐渐减少。穿梭箱训练后BrdU、IREl的表达明显增加。结论：穿梭箱训练促进神经干细胞的增殖及缺血脑组织IREl的表达，提示穿梭箱训练促进神经干细胞增殖作用可能由IREl信号介导。

NAMPT在多发性骨髓瘤中的作用机制及其临床意义

目的:探讨烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT)在多发性骨髓瘤中的作用机制及其临床价值。方法:采用RT-q PCR和Western blot方法检测多发性骨髓瘤细胞和正常骨髓单个核细胞中NAMPT的表达水平,同时通过细胞增殖与凋亡实验、小干扰RNA沉默、过表达实验和染色质免疫共沉淀实验分析NAMPT的生物学功能。结果:多发性骨髓瘤细胞系(MM1R、MM1S、U266和RPMI-8226)中NAMPT m RNA和蛋白的表达水平较正常骨髓单个核细胞均显著升高(P<0.001),且在U266细胞中最明显。与Si-NC组相比,Si-NAMPT组转染24、48、72 h均显著抑制U266细胞增殖(P=0.006,P<0.001,P=0.001),转染48 h时U266细胞凋亡率升高显著(P<0.001)。与Flag-NC组比较,Flag-NAMPT组U266细胞增殖均显著升高(P=0.003,P=0.002,P<0.001),转染48 h时细胞凋亡率明显降低。在U266细胞中NAMPT的表达在转录水平受到XBP1的调控。用硼替佐米处理XBP1或NAMPT稳定敲除或经MKC3946预处理的U266细胞后细胞增殖率均显著下降,BAX m RNA和蛋白水平显著升高,BCL-2 m RNA和蛋白水平显著下调,Caspase-3裂解度显著下降,Caspase-3/7活性急剧增加(P<0.05)。结论:NAMPT在多发性骨髓瘤细胞系中高表达,促进多发性骨髓瘤细胞增殖,抑制细胞凋亡。在U266细胞中NAMPT受IRE1α-XBP1信号通路的转录调控。稳定敲除NAMPT或阻断IRE1α-XBP1通路可显著提高U266细胞对硼替佐米的敏感性。

糖络宁对高糖环境中雪旺细胞内质网应激IRE1通路的影响

目的观察中药复方糖络宁对高糖环境下雪旺细胞的抗凋亡保护作用,探讨糖络宁对于内质网应激IRE1信号通路的调控作用。方法在高糖环境中培养雪旺细胞,设置空白对照组、模型组、糖络宁组、不同阻断剂组。培养12、24小时后,应用流式细胞术检测糖络宁含药血清处理下的细胞凋亡水平,应用免疫印迹法(Western blot,WB)检测内质网应激的IRE1-TRAF2-JNK凋亡通路的标志蛋白肌醇依赖酶1(inositol-requiting enzyme 1,IRE1)、X盒结合蛋白(X-box binding protein 1,XBP1)、肿瘤坏死因子受体相关因子2(TNF receptor-associated factor 2,TRAF2)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)的表达,应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测XBP1、TRAF2、JNK的基因表达。结果高糖孵育雪旺细胞12、24小时可显著诱导其损伤,细胞活力下降;与正常组比较,高糖环境下雪旺细胞凋亡水平明显升高(P<0.05);与模型组比较,糖络宁含药血清能够改善高糖环境下雪旺细胞的凋亡(P<0.05)。在造模后检测时间点12小时、24小时,与空白组比较,模型组IRE1α、TRAF2和JNK表达显著升高(P<0.05);与模型组比较,糖络宁组含药血清组TRAF2和JNK蛋白的表达显著降低(P<0.05)。在造模后检测时间点12小时,与空白组、模型组比较,糖络宁组含药血清组XBP1蛋白表达显著升高(P<0.05)。PCR结果显示,糖络宁含药血清能够发挥类似于TRAF2 siRNA阻断剂的作用,抑制IRE1途径下游凋亡通路。结论糖络宁可对抗高糖环境引起的雪旺细胞损伤,作用机制与调控内质网应激IRE1信号通路有关。在IRE1通路被激发的初期,可能激活IRE1-XBP1通路,提高高糖环境下雪旺细胞的存活能力;当内质网应激过载时糖络宁抑制IRE1-TRAF2-JNK通路,减轻高糖环境下的雪旺细胞的凋亡。

内质网应激通路需肌醇酶1α/X盒结合蛋白1在中性粒细胞弹力蛋白酶诱导的气道黏液分泌中的作用

目的·探讨内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)反应在中性粒细胞弹力蛋白酶(neutrophil elastase,NE)诱导人气道上皮细胞黏蛋白5AC(mucin 5AC,MUC5AC)分泌中的作用及机制。方法·培养人气道上皮细胞HBE16,分别给予活性氧(reactive oxygen species,ROS)抑制剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)、ERS抑制剂4-苯基丁酸(4-phenylbutyrate,4-PBA)预处理,或分别转染需肌醇酶1α(inositol-requiring kinase 1α,IRE-1α)小干扰RNA(siRNA)、X盒结合蛋白1(X-boxbinding protein 1,XBP-1)siRNA,再予以NE刺激;同时设单纯NE组和空白对照组。试剂盒检测ROS的生成水平;Westernblotting检测干预后ERS相关信号分子葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)、磷酸化蛋白激酶R样内质网激酶(phosphorylated protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase,pPERK)、活化转录因子6(activating transcription factor 6,ATF6)、磷酸化IRE-1α(pIRE-1α)及XBP-1蛋白表达量的变化;实时荧光定量PCR检测剪切的XBP-1(XBP-1s)mRNA水平;ELISA和免疫荧光检测MUC5AC在各组细胞中的蛋白表达情况。结果·与空白对照组相比,NE刺激24 h后细胞ROS含量增加,GRP78、ATF6、pPERK及pIRE-1α蛋白水平均显著升高(均P<0.05),XBP-1s mRNA及蛋白表达也明显增加(均P<0.05),同时MUC5AC蛋白表达增加(均P<0.05);NAC及4-PBA预处理后均使上述ERS相关蛋白表达较单纯NE组降低(均P<0.05),MUC5AC蛋白水平降低(均P<0.05);转染IRE-1αsiRNA或XBP-1 siRNA,细胞中MUC5AC蛋白表达也较单纯NE组明显降低,同时XBP-1s mRNA及蛋白表达也有明显下降(均P<0.05)。结论·NE通过产生ROS引起ERS反应,诱导MUC5AC蛋白表达及分泌增加,ERS通路IRE-1α/XBP-1在其中发挥着一定的作用。

低剂量辐射诱导小鼠睾丸细胞中IRE1α和XBP1 mRNA及其蛋白的表达

目的:检测小鼠睾丸细胞中肌醇需求酶1α(IRE1α)和X盒结合蛋白1(XBP1)mRNA和蛋白的表达,探讨IRE1-XBP1通路激活在低剂量辐射(LDR)诱导小鼠睾丸细胞内质网应激中的作用。方法:50只健康雄性ICR小鼠,随机分为10组,经75 mGy X射线全身照射后不同时间(0、3、6、12和24h)及不同剂量(0、50、75、100和200mGy)X射线照射后12h处死,分别采用实时定量PCR法和Western blotting法检测小鼠睾丸细胞中IRE1α、Total-XBP1(T-XBP1)和Spliced-XBP1(S-XBP1)mRNA表达水平及蛋白表达强度。结果:75mGy X射线照射后0~24h,小鼠睾丸细胞中IRE1α、T-XBP1和S-XBP1mRNA(除了3h时T-XBP1和S-XBP1mRNA)表达水平均随时间延长而升高,并在6h时达到峰值,而后逐渐降低;与0h组比较,6、12和24h组IRE1αmRNA、6和12h组T-XBP1mRNA及S-XBP1mRNA表达水平均明显升高(P<0.05或P<0.01)。与0h组比较,不同时间组IRE1α和S-XBP1蛋白表达强度升高,6和12h组IRE1α蛋白表达强度升高最明显,24h组S-XBP1蛋白表达强度升高最明显,而T-XBP1蛋白表达强度稍有降低。0~200mGy照射后12h,小鼠睾丸细胞中IRE1α、T-XBP1和S-XBP1mRNA表达水平升高,75mGy X射线照射后升高达峰值后逐渐降低,甚至降至0mGy以下;与0mGy组比较,75和200mGy组小鼠睾丸细胞中IRE1α、75mGy组小鼠睾丸细胞中T-XBP1和S-XBP1mRNA表达水平明显升高(P<0.05或P<0.01)。与0mGy组比较,75mGy组IRE1α和S-XBP1蛋白表达强度升高,75和200mGy组小鼠睾丸细胞中S-XBP1蛋白表达强度升高最明显,而T-XBP1蛋白表达强度无明显变化。结论:LDR可诱导小鼠睾丸细胞中IRE1α和S-XBP1mRNA表达水平和蛋白表达强度增加,从而激活内质网应激中的IRE1-XBP1信号通路。

单宁酸联合顺铂增强肝癌HepG2细胞IRE1-XBP1通路的激活水平

本文主要研究单宁酸(TA)联合顺铂(CDDP)对肝癌HepG2细胞内质网应激IRE1-XBP1通路的影响。用180μM单宁酸、0.9μg/m L顺铂单独用药或者联合用药处理肝癌HepG2细胞24 h或48 h后,应用流式细胞技术测定HepG2细胞的凋亡率,实时荧光定量PCR技术(q-RT-PCR)、蛋白免疫印迹(western blot)技术检测IRE1α和XBP-1分子的表达水平。MTT结果显示,单宁酸和顺铂均能显著抑制HepG2细胞的生长,且均呈剂量性依赖;二者联合用药能够显著增加HepG2细胞的生长抑制率;流式细胞术结果显示,单宁酸与顺铂联合用药能够显著抑制HepG2细胞的增殖,并诱导细胞凋亡的发生;q-RT-PCR及Western blot结果显示,单宁酸与顺铂联合用药能显著上调细胞IRE1α和XBP-1的表达水平。结果表明单宁酸能够联合顺铂增强肝癌HepG2细胞内质网应激IRE1-XBP1通路的激活水平,提示IRE1-XBP1通路可能是单宁酸和顺铂协同抗肝癌HepG2细胞的分子机制之一。

茵陈蒿汤对梗阻性黄疸大鼠肝细胞中IRE1α蛋白表达的影响

目的:研究茵陈蒿汤血清对梗阻性黄疸大鼠肝细胞中肌醇酶1α(inositol-requiring enzyme-1-α,IRE1α)蛋白表达的影响.方法:通过结扎SD大鼠胆总管建立梗阻性黄疸模型,分离梗阻性黄疸大鼠原代肝细胞进行体外培养.通过喂食SD大鼠茵陈蒿汤制备相应的含药血清.处理组(B组)以含药血清培养基培养大鼠原代肝细胞,对照组(A组)以不含药的常规培养基培养大鼠原代肝细胞.分别测定细胞中IRE1α蛋白表达情况及培养液中谷丙转氨酶(alanine transaminase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate transaminase,AST)含量.结果:通过比较对照组(A组)各时间点与处理组(B组)的蛋白和转氨酶含量,B组在I R E1α蛋白表达(I R E1α表达量:6 h 1.85±0.04 vs 1.58±0.04,24 h 1.95±0.02 vs 1.60±0.03,48 h 2.22±0.13 vs 1.99±0.10,P<0.05)及ALT、AST测定值均降低(AST测定值:6 h17.23 U/L±3.01 U/L vs 13.13 U/L±2.41 U/L,24 h 19.33 U/L±3.01 U/L vs 15.67 U/L±2.36U/L,48 h 24.40 U/L±3.93 U/L vs 19.18 U/L±1.65 U/L,P<0.05;ALT测定值:6 h 17.23U/L±3.01 U/L vs 13.13 U/L±2.41 U/L,24 h19.33 U/L±3.01 U/L vs 15.67 U/L±2.36 U/L,48 h 24.40 U/L±3.93 U/L vs 19.18 U/L±1.65U/L,P<0.05),差异有统计学意义.结论:血清药理学研究方法可以用于茵陈蒿汤的药效评价,经IRE1α介导的内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)可能是茵陈蒿汤对梗阻性黄疸大鼠肝细胞保护作用的一条重要通路.

丙泊酚后处理对小鼠N2a细胞氧糖剥夺/复糖复氧模型内质网IRE1-XBP1信号通路的影响

目的探讨丙泊酚后处理对小鼠神经母细胞瘤(N2a)细胞氧糖剥夺/复糖复氧(OGD/R)模型内质网肌醇酶1(IRE1)-X盒连接蛋白1(XBP1)信号通路的影响。方法培养小鼠N2a细胞至对数生长期,采用随机数字表法将细胞平均分为三组:对照组(C组)、OGD/R组(O组)和OGD/R+丙泊酚后处理组(P组)。C组在正常条件下培养,O组氧糖剥夺3 h后在正常条件下培养进行复糖复氧24 h,P组氧糖剥夺3 h后于复糖复氧即刻加入丙泊酚50μmol/L孵育2 h,随后在正常条件下培养22 h。三组均采用流式细胞学技术检测细胞凋亡率,CCK-8法检测细胞存活率,Western blot法检测IRE1、XBP1蛋白含量,qRT-PCR法检测IRE1、XBP1 mRNA表达量,透射电镜法观察细胞内质网形态。结果与C组比较,O组和P组细胞凋亡率明显升高(P<0.05),细胞存活率明显降低(P<0.05),IRE1、XBP1蛋白含量和mRNA表达量明显升高(P<0.05)。与O组比较,P组细胞凋亡率明显降低(P<0.05),细胞存活率明显升高(P<0.05),IRE1、XBP1蛋白含量和mRNA表达量明显降低(P<0.05)。透射电镜结果显示,C组细胞内质网形态正常、排列规则、粗面内质网清晰可见;O组细胞内质网排列不规则、水肿、扩张、断裂、呈囊池状,粗面内质网严重脱颗粒,部分与细胞膜融合;P组细胞内质网排列轻度不规则,部分内质网出现轻度水肿、扩张,粗面内质网脱颗粒现象较O组减轻。结论丙泊酚后处理可以减少小鼠N2a细胞OGD/R后细胞凋亡,提高细胞存活率,其机制可能与抑制内质网IRE1-XBP1信号通路,减轻内质网应激反应有关。

过表达Bax抑制子1(BI-1)通过内质网IRE1-JNK通路抑制蛛网膜下腔出血大鼠海马神经元凋亡

目的探讨慢病毒介导Bax抑制子1(BI-1)过表达对蛛网膜下腔出血(SAH)大鼠海马神经元保护作用以及与内质网膜蛋白肌醇酶1-c-Jun氨基末端激酶(IRE1-JNK)信号通路的关系。方法制备BI-1过表达慢病毒并经侧脑注射,24 h后采用血管内穿刺法建立SAH大鼠模型。于造模后24 h,对大鼠进行神经行为学评估和脑含水量检测,原位末端转移酶标记技术(TUNEL)观察大鼠海马神经元凋亡情况,Western blot法检测BI-1蛋白以及内质网应激标志蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和IRE1蛋白水平。采用IRE1α特异性抑制剂KIRA6处理SAH后大鼠,Western blot法检测BI-1过表达对IRE1-JNK信号通路相关蛋白磷酸化的IRE1(p-IRE1)、磷酸化的JNK(p-JNK)及凋亡相关蛋白Bax、Bcl2和caspase-3蛋白水平的影响。结果过表达BI-1提高SAH模型大鼠的神经行为学评估得分,降低SAH模型大鼠的脑含水量和海马神经元凋亡率,并且BI-1过表达可以下调SAH后大鼠海马神经元中GRP78和IRE1蛋白水平。KIRA6处理和BI-1过表达均可抑制p-IRE1、p-JNK、Bax的表达和caspase-3的活化,促进Bcl2的表达。结论过表达BI-1可通过阻断IRE1-JNK通路抑制SAH后大鼠海马神经元凋亡。

GLP-1对非酒精性脂肪肝大鼠肝脏脂肪变性的影响

目的从对内质网应激影响的角度,探讨胰升糖素样肽1 (GLP-1)对非酒精性脂肪肝(NAFLD)大鼠肝脏脂肪变性的影响。方法将45只雄性SD大鼠随机均分为三组,各15只。观察组采用高脂饮食造模,并采用GLP-1干预;疾病对照组采用高脂饮食造模,并采用生理盐水干预;正常对照组接受正常饮食,并采用生理盐水干预。在干预4周后,测定大鼠血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)水平。随后处死大鼠,测定肝匀浆中TG、TC水平,并通过HE染色观察肝脏脂肪变性情况,采用Western印迹法测定肝组织中肌醇需求激酶1α(IRE1α)、磷酸化IRE1α(PIRE1α)、c-jun氨基末端激酶(JNK)、磷酸化JNK(P-JNK)水平。结果三组大鼠血清TG、TC、AST均呈疾病对照组最高、观察组次之、正常对照组最少趋势,组间比较差异均有统计学意义(P <0.05)。血清ALT,肝匀浆中TC、TG,肝匀浆P-IRE1α/IRE1α、P-JNK/JNK水平均呈疾病对照组最高、正常对照组次之、观察组最少趋势,组间比较差异均有统计学意义(P <0.05)。HE染色显示正常对照组肝脏组织结构正常,疾病对照组呈明显脂肪变性,观察组在两者之间。P-IRE1α/IRE1α、P-JNK/JNK均与肝脏脂肪变性程度呈明显正相关(ρ=0.617,0.730;P均<0.001)。结论 GLP-1能够抑制NAFLD大鼠肝脏脂肪变性,其机制可能与调节内质网应激中IRE1α-JNK通路有关;应用GLP-1类似物可能有助于治疗NAFLD。