菩人丹超微粉对T2DM大血管病变大鼠骨骼肌组织IRS-1mRNA、GLUT4mRNA表达的影响

目的观察菩人丹超微粉(Pu Ren Dan Superfine Powder,PRD)对2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus,T2DM)大血管病变大鼠骨骼肌组织胰岛素受体底物-1(insulinreceptor substrate-1,IRS-1)mRNA及葡萄糖转运蛋白4(glucose transporter4 GLUT4)mRNA表达的影响,探讨PRD调控骨骼肌葡萄糖转运的分子机制。方法以Wistar大鼠造T2DM模型大鼠,造模成功的T2DM大鼠按血糖结合体质量分层随机分为5组:模型组、罗格列酮组、PRD低、中、高剂量(0.885g/kg;1.770g/kg;3.540g/kg)治疗组,另取10只大鼠作为正常对照组。各组动物每日灌胃给药1次,正常对照组和T2DM模型组灌胃等剂量蒸馏水,连续给药4周。实验期间除正常对照组给予普通饲料外,其余各组均给予高脂高热量饲料。采用反转录PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)技术和凝胶电泳成像分析方法,观察T2DM大血管病变大鼠骨骼肌组织IRS-1、GLUT4mRNA表达。结果 T2DM大血管病变大鼠骨骼肌组织IRS-1、GLUT4mRNA表达与正常对照组比较明显降低(P<0.01);PRD治疗组均能提高T2DM大鼠骨骼肌组织IRS-1、GLUT4mRNA的表达(P<0.05,P<0.01)。结论 PRD可提高T2DM大血管病变大鼠骨骼肌IRS-1mRNA及GLUT-4mRNA的表达水平。

苍附导痰汤对肥胖型PCOS-IR模型大鼠卵巢TLR4/NF-κB p65信号通路的影响

目的 探讨苍附导痰汤对肥胖型PCOS-IR (polycystic ovarian syndrome-insulin resistance, PCOS-IR)模型大鼠卵巢Toll受体4(TLR4)/核转录因子κB p65(NF-κB p65)信号通路的调控作用。方法 48只♀大鼠随机分为正常组8只和模型组40只。来曲唑(1 mg·kg^(-1))联合高脂饮食建立肥胖型PCOS-IR大鼠模型,快速革兰染色法观察动情周期,挑选24只模型大鼠随机分为:模型组、阳性药(二甲双胍135 mg·kg^(-1))组、苍附导痰汤高、低剂量(57.96、14.49 g·kg^(-1))组,每组各6只,药物干预21 d。观察动情周期、卵巢和子宫指数变化;血液生化仪测定空腹血糖(FBG)和血脂(甘油三酯TG和总胆固醇TC)变化;酶联免疫吸附(ELISA)法测定空腹胰岛素(FINS)水平;免疫组化法和荧光定量PCR法检测卵巢中TLR4和NF-κB p65蛋白及基因的表达。结果 与正常组比较,模型组大鼠动情周期紊乱,卵巢多囊性改变明显,FBG、TG、TC含量和FINS、HOMA-IR水平上调,卵巢中TLR4和NF-κB p65蛋白及mRNA表达均增加(P<0.05);与模型组比较,苍附导痰汤高剂量组大鼠排卵周期得到改善,卵巢多囊性改变减轻,上述指标出现明显逆转(P<0.05)。结论 苍附导痰汤能有效改善肥胖型PCOS-IR大鼠卵巢排卵和糖脂代谢功能,作用机制可能与调控卵巢TLR4/NF-κB p65信号通路有关。

含miR-497野生及突变结合位点的胰岛素受体mRNA 3′UTR区报告基因载体的构建和鉴定

目的利用pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector(简称为pmirGLO报告基因载体)构建并鉴定含miR-497野生及突变结合位点的胰岛素受体mRNA 3′UTR区报告基因载体(pmir-Insr-3′UTR及pmirmutant-Insr-3′UTR)。方法以大鼠肝脏cDNA为模板,PCR获取目的片段(即含miR-497野生及突变结合位点的胰岛素受体mRNA 3′UTR区);用PmeI、XbaI双酶切pmirGLO报告基因载体和含miR-497野生及突变结合位点的胰岛素受体mRNA 3′UTR区,用T4 DNA连接酶连接纯化后的酶切产物;连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞并挑选阳性克隆,并通过PCR、双酶切、DNA测序鉴定构建的重组质粒。结果 PCR和双酶切证实pmir-Insr-3′UTR及pmir-mutant-Insr-3′UTR重组载体中均插入目的片段;DNA测序结果进一步证实pmir-Insr-3UTR重组载体中成功插入了胰岛素受体mRNA 3′UTR区,pmir-mutant-Insr-3′UTR重组载体中成功插入了在miR-497结合位点含有3个突变碱基的胰岛素受体mRNA 3′UTR片段。结论成功构建了含miR-497野生及突变结合位点的胰岛素受体mRNA 3′UTR报告基因载体pmir-Insr-3′UTR及pmir-mutant-Insr-3′UTR。

肝癌和癌旁肝组织中IGF-Ⅰ,IGF-Ⅰ受体mRNA的表达

目的 探讨胰岛素样生长因子Ⅰ（ＩＧＦⅠ） 及其受体（ＩＧＦⅠＲ）在肝细胞癌变过程中的作用及意义．方法 采用ＤＮＡＲＮＡ 原位杂交方法观察肝癌（ ｎ ＝ ３０） 和癌旁肝组织中ＩＧＦⅠ，ＩＧＦⅠ受体ｍ ＲＮＡ 的表达．结果 在肝癌和癌旁肝组织中ＩＧＦⅠ的表达率分别为４０－０ ％和５０－０ ％ ，ＩＧＦⅠ受体的表达率分别为４６－７ ％ 和５３－３ ％ ；ＩＧＦⅠ，ＩＧＦⅠ受体在分化较差的癌细胞和不典型增生肝细胞中表达最为明显．结论 ＩＧＦⅠ和ＩＧＦⅠ受体可能在肝细胞癌变过程中发挥重要作用．

IGF-Ⅰ及其受体、IGF结合蛋白-2和LH受体mRNA在卵泡中的表达

利用原位杂交和原位DNA－3’末端标记的方法研究了胰岛素样生长因子河（IG－I）、IGF－I受体、IGF结合蛋白－2、和促性腺激素受体的信使核糖核酸（mRNA）在不同生长与闭锁阶段的大鼠卵巢卵泡中表达的变化。结果表明：IGF－I主要在正常生长的初级卵泡、窦前卵泡和小窦状卵泡中表达。在各生长与成熟阶段的卵泡中都检测到IGF－I受体mRNA，闭锁卵泡的IGF－I受体表达降低。窦前与窦状的生长和闭锁卵泡均表达IGFBP－2。促卵泡激素（FSH）受体在窦前和小窦状卵泡的表达水平比其在大卵泡中的高。窦前与小窦状卵泡仅在膜细胞中表达黄体生成素（LH）受体mRNA，大卵泡的膜细胞与颗粒细胞均表达LH受体，在闭锁卵泡中仅在膜细胞中观察到LH受体的信号。综上结果，提示IGF－I，IGF－I受体和FSH受体在窦前和小窦状卵泡中的协同表达对卵泡的早期发育有重要作用。LH受体mRNA特异地在大卵泡的颗粒细胞中表达可能与优势卵泡选择相关。

覆盆子酮对HepG2细胞胰岛素信号转导通路中SHP-1和IRS-1表达的影响

目的观察覆盆子酮对HepG2细胞糖消耗的影响及胰岛素信号转导通路中SHP-1和人胰岛素受体底物(IRS-1)表达的影响。方法体外培养人肝癌HepG2细胞,采用MTT法检测细胞活力;葡萄糖氧化酶法检测细胞糖消耗;RT-PCR法检测蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1的基因表达;Western-blot法检测IRS-1的表达量。结果覆盆子酮可明显促进HepG2细胞对葡萄糖的消耗,明显降低HepG2细胞SHP-1 mRNA基因表达量,并能促进IRS-1蛋白表达量。结论覆盆子酮可能通过影响胰岛素信号转导通路中IRS-1和SHP-1的表达发挥降糖作用。

TNF琢对体外培养的人脂肪细胞葡萄糖摄取和IRS-1酪氨酸磷酸化的影响

【目的】探讨肿瘤坏死因子琢(TNF琢)对体外培养的人脂肪细胞胰岛素刺激的葡萄糖摄取和胰岛素受体底物1(IRS-1)酪氨酸磷酸化的影响,为多囊卵巢综合征(PCOS)的胰岛素抵抗(IR)病因学研究提供新的实验依据。【方法】脂肪细胞葡萄糖摄取的测定采用3H标脱氧右旋葡萄糖(2-[3H]DG)吸收法,IRS-1酪氨酸磷酸化的检测采用免疫沉淀、Western印迹和增强化学发光蛋白免疫印迹法及图像分析。【结果】①胰岛素(100nmol/L)作用下,TNF琢刺激浓度分别为0、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL时,脂肪细胞2-[3H]DG的摄取分别为(652±203)U,(609±172)U,(511±135)U和(404±168)U,当TNF琢刺激浓度达20ng/mL时,脂肪细胞对葡萄糖摄取的降低有显著性差异(P<0.05)。②胰岛素(100nmol/L)刺激下IRS-1的酪氨酸磷酸化在TNF琢(5ng/mL)作用时(74.50%±16.86%)较无TNF琢作用(94.00%±14.70%)有所降低,但无显著性差异;当TNF琢刺激浓度分别为10ng/mL(31.16%±10.44%)和20ng/mL(27.33%±9.63%)时,胰岛素(100nmol/L)刺激后IRS-1的酪氨酸磷酸化明显降低(P<0.001)。【结论】①TNF琢刺激浓度的升高可抑制体外培养的人脂肪细胞胰岛素刺激的葡萄糖摄取。②TNF琢可抑制体外培养的人脂肪细胞胰岛素刺激的IRS-1的酪氨酸磷酸化,并存在一定的量效关系。

APP17肽对心肺复苏大鼠海马神经元IR IRS-1表达的影响

目的观察APP17肽对心肺复苏大鼠海马神经元CA1区胰岛素受体(IR)、胰岛素受体底物-1(IRS-1)表达的影响。方法24只SD大鼠随机分为3组：假手术对照组(对照组)、心肺复苏组(复苏组)、APP17肽组,每组8只。用室息法制作大鼠心肺复苏模型。APP17肽组于自主循环恢复(ROSC)时立即静脉注射APP17肽3．33μg/100 g体质量,约5 mL；对照组和复苏组给予等剂量生理盐水。2 h后断头取脑行免疫组化染色,观察3组大鼠海马CAl区神经元IR、IRS-1表达的变化。结果与对照组相比复苏组大鼠海马CA1区IR、IRS-1染色阳性神经元明显减少(P＜0．05-0．01)差异有统计学意义；与复苏组相比APP17肽组IR、IRS-1阳性神经元明显增加,差异有统计学意义(P＜0．05～0．01)。结论心肺复苏大鼠海马神经元IR、IRS-1表达降低,复苏早期给予APP17肽干预可使其表达恢复正常或接近正常。

Nelfinavir损害鼠胰岛素瘤INS-1细胞内IRS-2信号传导

目的 :探讨 HIV- 1蛋白酶抑制剂 nelfinavir对胰岛 β细胞内胰岛素信号传导蛋白磷酸化的影响。方法 :体外观察鼠胰岛素瘤 INS- 1细胞经 nelfinavir治疗 4 8h后 ,用 10 0 nmol/ L胰岛素刺激 2 min,细胞裂解产物中的胰岛素信号传导蛋白磷酸化采用免疫沉淀和 Western印迹方法测定。用台盼蓝染色细胞计数和 MTT衰减试验 ,评估nelfinavir对 INS- 1细胞活力的影响。结果 :nelfinavir降低胰岛素刺激的胰岛素受体底物 IRS- 2和 Akt- Thr3 0 8磷酸化 ,并呈剂量依赖关系。nelfinavir浓度为 10 μmol/ L时 ,分别降低 IRS- 2和 Akt- Thr3 0 8磷酸化达 5 2 %和 5 5 % ,在这个浓度下 nelfinavir没有细胞毒性作用。结论 :nelfinavir治疗可以损害胰岛 β细胞内 IRS-

妊娠肝内胆汁淤积症胎盘超微结构及IGF-IR表达的研究

目的 探讨妊娠期肝内胆汁淤积对胎盘绒毛超微结构及胰岛素样生长因子Ⅰ受体 (IGF IR)表达的影响。方法 应用电镜观察 18例正常妊娠胎盘、2 7例妊娠期肝内胆汁淤积症 (ICP)胎盘绒毛超微结构 (其中 10例合并胎儿生长受限 ,FGR) ,并借助免疫组化方法及计算机分析系统对两组胎盘IGF IR的表达进行定位及半定量分析。结果 ICP时胎盘合体滋养细胞表面微绒毛短少 ,空泡状结构增多 ,绒毛间质内成纤维细胞增多 ,毛细血管内皮细胞内各类细胞器减少。胎盘IGF IR主要表达于合体滋养细胞的胞膜表面 ,ICP时表达减少 (P <0 0 5 ) ,在合并IUGR时 ,IGF IR的表达明显减弱 (P <0 0 1)。结论 胆汁淤积时 ,高浓度胆酸和胆红素的毒性刺激直接影响胎盘超微结构及功能 ,可使滋养细胞表达IGF IR减少 ,胎儿生长滞缓 ,临床应早诊断 ,早治疗。

卷柏活性部位对胰岛素抵抗大鼠肝脏胰岛素受体mRNA表达的影响

目的探讨卷柏对胰岛素抵抗大鼠肝脏胰岛素受体mRNA表达的影响。方法动物分为5组,每组8只,阳性对照组给予盐酸二甲双胍片,给药组分别给予卷柏水提液及大孔树脂50%乙醇洗脱组分(简称50%组分),用RT-PCR方法检测大鼠肝脏胰岛素受体mRNA表达水平。结果阳性对照组、卷柏水提液、卷柏50%乙醇洗脱组分与模型组比较,大鼠肝脏胰岛素受体基因mRNA表达水平显著提高(P<0.01)。结论卷柏通过改善大鼠肝脏胰岛素受体基因mRNA表达而改善胰岛素抵抗。

PCOS患者IRS-2及酪氨酸磷酸化的表达

目的研究多囊卵巢综合征患者脂肪组织胰岛素受体底物-2蛋白的表达及其酪氨酸磷酸化,探讨其在多囊卵巢综合征产生胰岛素抵抗中的作用。方法采用放射免疫法检测多囊卵巢综合征胰岛素抵抗组(24例)、多囊卵巢综合征非胰岛素抵抗组(15例)及对照组(20例)血清空腹胰岛素的浓度;葡萄糖氧化酶法测定血浆空腹血糖;稳态模型计算胰岛素抵抗指数;Western blot方法检测胰岛素受体底物-2蛋白的表达,应用免疫沉淀及增强化学发光法检测酪氨酸磷酸化程度。结果①多囊卵巢综合征胰岛素抵抗组患者血清空腹胰岛素及胰岛素抵抗指数均显著高于多囊卵巢综合征非胰岛素抵抗组与对照组(F=66.25,P<0.01;F=97.31,P<0.01);多囊卵巢综合征非胰岛素抵抗组患者血清空腹胰岛素及胰岛素抵抗指数亦显著高于对照组(均P<0.05);②多囊卵巢综合征胰岛素抵抗组、多囊卵巢综合征非胰岛素抵抗组及对照组3组相比较,胰岛素受体底物-2蛋白表达无显著性差别;③多囊卵巢综合征胰岛素抵抗组胰岛素受体底物-2蛋白质酪氨酸磷酸化程度显著降低(F=48.12,P<0.05)。结论多囊卵巢综合征患者脂肪组织胰岛素受体底物-2蛋白质酪氨酸磷酸化程度降低,可能是其产生胰岛素抵抗的机制之一。

GM-CSF与生长抑素融合表达质粒对小鼠肌肉组织GHR和IGF-I mRNA表达的影响

选择70只小白鼠,随机分为7组,每组10只,雌雄各半。其中第1组为对照组,第2-4组分别肌肉注射pcS/2SS、pGM-CSF/SS和pGM-CSF+pcS/2SS DNA疫苗;第5～7组分别口服以减毒沙门氏菌为载体的pcS/2SS、pGM-CSF/SS和pGM-CSF+pcS/2SS DNA疫苗,以β-actin作为内参,利用相对半定量RT-PCR,检测小鼠肌肉组织GHR和IGF-I mRNA的表达。结果表明:第3、5和6组的GHR mRNA表达显著高于1组和7组(P<0.05),第5和6组的IGF-I mRNA表达显著高于1组、2组、4组和7组(P<0.05),GM-CSF与SS的融合表达质粒(pGM-CSF/SS)的GHR和IGF-I mRNA表达高于pGM-CSF+pcS/2SS共同免疫,同种DNA疫苗,口服免疫组的GHR和IGF-I mRNA表达总体上比肌肉注射组要高。这些结果证明,GM-CSF可促进SS DNA疫苗的免疫效果,提高肌肉组织中GHR和IGF-I mRNA的表达;pGM-CSF/SS效果优于pGM-CSF+pcS/2SS,口服免疫组要优于肌肉注射免疫组。

IGF-I、IGF-IR在喉鳞癌中的表达及意义

目的探讨胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、胰岛素样生长因子-I受体(IGF-IR)在喉鳞癌中的表达及意义。方法采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术和免疫组织化学技术,检测29例喉鳞癌标本和癌旁正常组织中的IGF-I、IGF-IR的mRNA及其蛋白表达情况。结果IGF-I、IGF-IR在喉鳞癌中mRNA及其蛋白表达明显高于癌旁正常组织,差别具有显著性意义(P<0.001);肿瘤组织中,在有淋巴结转移组表达量高于无淋巴结转移组(P<0.001)。结论IGF-I、IGF-IR可能在喉鳞癌的发生、发展中起作用;二者可能与颈部淋巴结转移相关。

祛胰抵方对2型糖尿病大鼠肝脏IRS-2蛋白表达的影响

目的 :观察2型糖尿病大鼠血糖、血清胰岛素浓度和胰岛素受体底物-2(insulin receptor substrate 2,IRS-2)的蛋白表达变化及祛胰抵方对其变化的影响。方法 :以小剂量链脲佐菌素(30 mg/kg)腹腔注射合并高脂饮食诱导2型糖尿病大鼠模型,给予不同剂量祛胰抵方治疗12周。分别测定其血糖、血清胰岛素浓度、肝脏组织的IRS-2蛋白表达。结果 :造模后2型糖尿病大鼠的血糖、血清胰岛素升高,肝脏组织的IRS-2蛋白表达下降;祛胰抵方能降低模型大鼠的血糖和血清胰岛素,并能显著升高肝脏组织IRS-2的蛋白表达。结论 :祛胰抵方治疗2型糖尿病可能与其提高肝脏组织IRS-2的蛋白表达从而改善胰岛素信号传导有关。

丝胶对2型糖尿病大鼠肝脏IR的调节作用

目的:研究丝胶对2型糖尿病大鼠肝脏IR的调节作用。方法:36只SPF级雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组和实验组,每组12只。采用高脂高糖饲料喂养+腹腔注射STZ的方法建立2型糖尿病大鼠模型。成模后,给予实验组大鼠丝胶灌胃35d。采用葡萄糖氧化酶法检测各组大鼠空腹血糖;Real Time Q-PCR法检测各组大鼠肝脏IR mRNA的表达。结果:与模型组大鼠相比,实验组大鼠血糖明显降低,IR mRNA的表达明显升高(P<0.05)。结论:丝胶可能通过上调肝脏IR的表达来增强胰岛素信号的转导效应,进而起到降低血糖的作用。

花旗泽仁对胰岛素抵抗大鼠肝脏CaSR mRNA、蛋白表达及AKT活性的影响

目的:观察花旗泽仁对胰岛素抵抗(IR)大鼠肝脏组织中钙敏感受体(Ca SR)mRNA、蛋白表达及蛋白激酶B(AKT)活性的影响,探讨花旗泽仁改善2型糖尿病胰岛素抵抗的作用机制。方法:雄性Wistar大鼠用复合脂肪乳连续灌胃4周配合小剂量注射链脲佐菌素的方法复制2型糖尿病胰岛素抵抗模型,将大鼠随机分为花旗泽仁组、阳性对照组、模型对照组、空白对照组。检测空腹血糖(FBG)及空腹血清胰岛素(FINS),并计算胰岛素敏感指数(ISI);采用qRT-PCR、Western blot技术检测Ca SR mRNA、Ca SR蛋白、磷酸化AKT(Ser473和Thr308)蛋白表达水平。结果:与空白对照组比较,模型对照组组大鼠FBG及FINS水平明显增高,ISI显著降低;与模型对照组相比,花旗泽仁组和阳性对照组大鼠FBG和FINS水平明显降低,ISI明显升高;与空白对照组比较,模型对照组大鼠肝脏组织中Ca SR mRNA表达水平明显降低;与模型对照组相比,花旗泽仁组和阳性对照组大鼠肝脏组织中Ca SR mRNA表达水平显著增高;与空白对照组比较,模型组大鼠肝脏组织中Ca SR蛋白、磷酸化AKT(Ser473和Thr308)蛋白表达量均显著降低;与模型对照组相比,花旗泽仁组和阳性对照组大鼠肝脏组织中Ca SR蛋白、磷酸化AKT(Ser473和Thr308)蛋白表达量均明显增加。结论:花旗泽仁可能通过调节Ca SR基因及蛋白表达,改善2型糖尿病胰岛素抵抗。

IGF-IR反义基因抑制乳腺癌细胞内源性IGF-IR表达的研究

目的探讨重组的人胰岛素样生长因子I型受体(IGFIR)的反义基因,对乳腺癌细胞内源性IGFIR表达的抑制作用。方法体外构建人IGFIR的反义基因真核表达载体pIGFIR/As,并转染人MCF7乳腺癌细胞,经G418筛选而获得稳定表达外源性反义基因的新细胞株MCF7/As,在基因水平和蛋白质水平检测内源性IGFIR的表达情况。结果人IGFIR的反义基因真核表达载体pIGFIR/As构建成功。RTPCR显示MCF7转染前后IGFIRmRNA的表达水平分别为(0.71±0.04)和(0.43±0.06),表达明显下降(P<0.05);Westernblot显示其蛋白质的表达水平呈相同的变化趋势(P<0.01)。结论本实验构建的载体pIGFIR/As能够稳定转染MCF7细胞,所表达的IGFIR的反义基因能够在基因和蛋白质水平显著抑制内源性IGFIR的表达。

2型糖尿病大鼠肝脏IRS-1的变化及丝胶的调节作用

目的:研究2型糖尿病大鼠肝脏胰岛素受体底物-1(IRS-1)表达的变化及丝胶的调节作用。方法:将36只雄性SPF级SD大鼠随机分为正常组(12只)和造模组(24只),造模组大鼠采用腹腔注射链脲佐菌素+高脂高糖饲料饲养的方法建立2型糖尿病大鼠模型,成模后将大鼠随机分为模型组(12只)和实验组(12只)。连续给予实验组大鼠丝胶、其余组大鼠生理盐水灌胃35d。葡萄糖氧化酶法用于检测各组大鼠空腹血糖;SP免疫组织化学法、Real Time Q-PCR法用于检测各组大鼠肝脏IRS-1的表达。结果:同模型组大鼠相比,实验组大鼠血糖明显降低、IRS-1的表达明显升高(P<0.05)。结论:丝胶降低血糖的作用可能是通过上调肝脏IRS-1的表达进而增强胰岛素信号通路的转导效应来实现。

胰岛素对体外培养牛肝细胞胰岛素受体mRNA水平的影响

在新生牛单层肝细胞培养液中添加胰岛素,其浓度分别为0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、50μmol/L和100μmol/L,处理12h,应用半定量RT-PCR方法研究胰岛素对体外培养新生牛单层肝细胞胰岛素受体(IR)mRNA水平的影响。结果表明随胰岛素浓度的升高,肝细胞IR mRNA丰度呈下降趋势,指示肝细胞内IR mRNA丰度下降以调节胰岛素浓度。