荧光定量PCR法检测不同状态下铜绿假单胞菌intⅠ1基因的表达

目的检测铜绿假单胞菌Ⅰ类整合酶基因(intⅠ1基因)在生物膜状态和浮游状态表达水平的差异,探讨整合子的作用机制。方法对3株Ⅰ类整合酶阳性的铜绿假单胞菌分别进行液相培养和生物膜细菌培养,常规方法提取3株细菌两种生长状态的总RNA。采用荧光定量PCR(FQ-PCR)法,以细菌的16srRNA为内参照,分别测定菌株SW07、R07和TH12的浮游细菌和生物膜细菌intⅠ1mRNA的相对表达量,比较3株菌在两种状态下intⅠ1mRNA的表达水平。结果3株铜绿假单菌的生物膜细菌和浮游细菌都检测到intⅠ1基因的表达。3株菌在两种状态下intⅠ1mRNA的表达量不同,生物膜细菌intⅠ1基因的表达水平较高,其中菌株R07、SW07和TH12的生物膜细菌intⅠ1mRNA的表达量分别较浮游细菌高1.4、5.7和128倍。结论在生物膜状态下,铜绿假单胞菌intⅠ1基因的表达上调,本实验结果提示整合子在生物膜细菌中可进行更加活跃的基因盒捕获和积累,整合子和细菌生物膜的形成是导致细菌对抗生素耐药的重要机制。

产生志贺样毒素的噬菌体φ297整合酶基因(int)的克隆和序列分析

目的 :克隆并分析细菌性噬菌体 φ2 97的整合酶基因 (int)。方法 :采用加接头的基因DNA片断为模板进行步移PCR ,根据溶源性噬菌体 φ2 97的染色体DNA上类似于噬菌体 933W的整合酶基因的一个 40个核苷酸设计引物 ,进行扩增、克隆、亚克隆、测序和序列分析。结果 :得到了噬菌体 φ2 97编码的整合酶基因 (int)的完整序列 ,它的长度是 1 2 87bp ,编码了 42 8个氨基酸的Int蛋白质。将它们的序列与λ噬菌体的整合酶家族其它成员进行了比较 ,发现噬菌体 φ2 97的整合酶基因 (int)与噬菌体VT1 Sakai的整合酶基因有 79%的同源性 ,噬菌体 φ2 97的Int蛋白与噬菌体VT1 Sakai的Int蛋白在氨基酸序列上有 82 %的同源性。N 末端的氨基酸区域是完全保守的 ,而中心区和C 末端则显示出较大差异。结论 :噬菌体 φ2 97与λ噬菌体的int基因来源于同一基因库 ,噬菌体 φ2 97可能属于λ噬菌体家族。

致肠出血性EH297整合酶基因(int)的克隆与分析

目的 克隆并分析致肠出血性埃希氏大肠杆菌O15 7:H7菌株EH2 97的整合酶基因。方法 采用加接头的步移PCR方法 ,从溶源性噬菌体 φ2 97的染色体DNA上类似于噬菌体 933W的整合酶基因的一个 4 0个核苷酸开始的 ,进行了克隆、亚克隆、测序和序列分析等分子生物学研究。结果 得到了噬菌体 (2 97编码的整合酶基因(int)的完整序列 ,它的长度是 12 87bp ,编码了 4 2 8个氨基酸的Int蛋白质。将它们的序列与λ噬菌体的整合酶家族的其它成员进行了比较。发现噬菌体 φ2 97的整合酶基因 (int)与噬菌体VT1 Sakai的整合酶基因有 79%的相似性 ,噬菌体 φ2 97的Int蛋白与噬菌体VT1 Sakai的Int蛋白在氨基酸序列上有 82 %的相似性。N 末端的氨基酸区域是完全保守的 ,而中心区和C 末端则显示出高度的变异。结论 噬菌体 φ2 97属于λ噬菌体或它们的int基因来源于同一基因池。

int－2基因扩增与食管癌发生发展的关系

对３２例原发性食管癌组织ＤＮＡ进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹转移，发现有１５例（４７％）ｉｎｔ－２基因扩增，扩增程度为２～８倍，其中１０例淋巴结转移癌全部扩增。实验结果说明ｉｎｔ－２基因扩增的程度与病理组织学变化和临床分期存在较明显的关联性，提示ｉｎｔ－２基因扩增的程度可作为食管癌发生、转移和预后的特异性的分子生物学标志。

产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌β-内酰胺酶与Ⅰ类整合酶基因研究

目的了解产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)肺炎克雷伯菌中β-内酰胺酶和Ⅰ类整合酶(intⅠ1)基因存在状况。方法对35株肺炎克雷伯菌,采用聚合酶链反应(PCR)检测TEM、SHV、OKP、CTX-M-1群、CTX-M-2群、CTX-M-9群、GES、PER、VEB、OXA-10、ACT-1、LEN、DHAi、ntⅠ1基因。结果35株肺炎克雷伯菌中检出β-内酰胺酶基因22株,阳性率62.9%;intⅠ1阳性21株,阳性率60.0%。结论产ESBLs肺炎克雷伯菌β-内酰胺酶基因和intⅠ1基因携带率高。

中国肠产毒性大肠杆菌中耶尔森菌强毒力岛的检测

目的 了解耶尔森菌强毒力岛在中国肠产毒性大肠杆菌中的分布及插入位点。方法 使用PCR扩增、DNA打点杂交和DNA测序及分析方法。结果 在 94株分离自中国的肠产毒性大肠杆菌中 ,14株耶尔森菌强毒力岛核心区的 8个基因PCR扩增阳性 ,除 3株菌的整合酶基因外 ,PCR扩增产物长度均与预期一致 ,但天冬酰胺转运RNA(asnTtRNA)位点扩增阴性 ;上述 14株菌进行全菌DNA打点杂交试验 ,均与irp2和 fyuA探针杂交 ;选择上述 3株菌中的 1株 ,对其整合酶基因的PCR产物测序 ,并与鼠疫耶尔森菌强毒力岛的整合酶基因序列比较 ,发现该整合酶基因于 5’端缺失了 347bp的片段。 结论 14 %肠产毒性大肠杆菌携带的耶尔森菌强毒力岛 ,且均插入在天冬酰胺转运RNA位点处 ;部分菌株所携带的耶尔森菌强毒力岛的整合酶基因发生了缺失。

烧伤病房鲍曼不动杆菌分离株消毒剂-磺胺耐药基因研究

目的:了解烧伤病房鲍曼不动杆菌耐药性及耐消毒剂-磺胺基因(qacE△1-su l1)存在情况。方法:76株临床分离菌株采用K-B法进行抗菌药物敏感性试验,采用聚合酶链反应(PCR)法检测qacE△1-su l1基因和Ⅰ类整合酶基因(intⅠ1)。结果:抗菌药物敏感率分别为:哌拉西林/他唑巴坦(TZP)35.52%、头孢哌酮/舒巴坦(SCF)57.89%、头孢他啶(CAZ)31.57%、头孢吡肟(FEP)34.21%、亚胺培南(IPM)33.39%、阿米卡星(AK)36.84%、环丙沙星(C IP)23.68%。76株鲍曼不动杆菌检测qacE△1-su lⅠ基因阳性62株(81.58%),intⅠ1基因阳性64株(84.21%)。qacE△1-su lⅠ基因和intⅠ1基因具有相关性。结论:烧伤病房分离的鲍曼不动杆菌有非常高的耐药率,并且qacE△1-su l1基因携带率较高,这和qacE△1-su l1基因与Ⅰ类整合酶基因整合在一起有关。

新世纪心血管医学展望

我们亲眼目睹的20世纪的心血管医学领域的四大进展或革命——流行病学、心脏影像、心血管疾病治疗学和基因治疗革命将为新世纪心血管医学的发展指引方向,为心血管疾病防治提供新的手段,并对降低心血管疾病的发病与死亡率产生重大影响。

中国汉坦病毒H8205株G1-G2-人源ⅠL-2融合基因DNA免疫的实验研究

目的评价融合基因pcDNA3.1/HisB-IL-2-G1-G2的DNA免疫效果。方法肌注免疫小鼠,分次采血,用酶联免疫法(ELISA)直接免疫酶斑减少中和试验检测小鼠体液免疫;淋巴细胞增殖试验(MTT法)检测其细胞免疫应答。免疫后第六周感染病毒。间接免疫荧光试验(IFIA)观察免疫小鼠抗病毒感染能力。结果pcDNA3.1/HisB-IL-2-G1-G2可诱导小鼠产生特异性抗汉坦病毒抗体和中和抗体,其效价均高于其他对照组,差异显著(P<0.05)。MTT实验表明,pcDNA3.1/HisB-IL-2-G1-G2诱导小鼠脾细胞对病毒抗原的增殖指数明显高于其他对照组。IFIA结果显示免疫小鼠对病毒攻击有保护性。结论pcDNA3.1/HisB-IL-2-G1-G2可诱导小鼠产生特异性体液和细胞免疫应答,为新一代汉坦病毒(HTV)DNA疫苗开发提供了实验依据。

鲍曼不动杆菌消毒剂——磺胺耐药基因研究

目的了解鲍曼不动杆菌耐消毒剂-磺胺基因（qacE△1-sul1）存在情况。方法自临床分离27株鲍曼不动杆菌，采用聚合酶链反应法检测qacE△1-sul1基因和Ⅰ类整合酶基因（intⅠ1）。结果27株AB菌检测qacE△1-su1Ⅰ基因阳性22株（81-4％），intⅠ1基因阳性23株（85.2％）。qacE△l-su1Ⅰ基因和intⅠ1基因具有相关性。结论我院临床分离的鲍曼不动杆菌qacE△1-sul1基因携带率较高。这和qacE△1-sul1基因与Ⅰ类整合酶基因整合在一起有关。

重金属铜对养殖场周边土壤菌群及其大环内酯类抗生素抗性水平相关基因的影响

为研究养殖场周边土壤菌群及其大环内酯类抗生素抗性水平相关基因在重金属铜的选择压力下所发生的变化情况,在实验室条件下,向采集于上海市某猪场周围的农田土壤喷洒不同质量浓度的CuSO4溶液,并采用高通量测序和实时荧光定量PCR(polymerase chain reaction)技术对土壤中的细菌多样性及大环内酯类抗生素抗性水平相关基因进行绝对定量。结果表明:长时间的Cu^2+作用降低了土壤中微生物的多样性,但一定程度上促进了抗性优势菌群的生长繁殖,其中鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)为主要优势菌属;抗性基因ermB、ermC、mefA、msrC-01、ereB的丰度与Cu^2+子质量浓度都具有一定的正相关性,当Cu^2+质量浓度为800和1000 mg/kg时,基因丰度都有所上升,其中抗性基因ermB的丰度为对照组的3.58倍;土壤中整合酶基因int-1的丰度与铜浓度并未呈现明显的相关性。由此可得,环境中高浓度的重金属铜与大环内酯类抗性基因之间能够形成共选择作用,激活大环内酯类抗性基因的表达,但对整合酶基因int-1未造成明显的共选择压力。

澳洲坚果MiMYB3基因克隆及结构与功能分析

为研究R2R3-MYB转录因子家族成员在澳洲坚果生长发育、生物胁迫和非生物胁迫等的调控机制,利用PCR技术从澳洲坚果品种‘桂热1号’叶片中克隆MiMYB3基因。采用生物信息学和荧光定量PCR(RT-qPCR)对其结构及功能进行分析预测。本研究克隆获得MiMYB3基因cDNA序列全长1 110 bp (NCBI登录号:MN254977.1),开放阅读框(ORF)长度为951 bp,共编码316个氨基酸。MiMYB3属于R2R3-MYB家族,其不存在跨膜结构、无信号肽且定位于细胞核的不稳定亲水蛋白。系统进化分析将MiMYB3与AtMYB94、AtMYB96、AtMYB30、At MYB31和AtMYB60聚类为S1亚族。RT-qPCR分析发现MiMYB3基因主要受水杨酸处理诱导显著上调表达,表明MiMYB3响应水杨酸处理。推测MiMYB3调控澳洲坚果水杨酸生物合成途径相关基因的表达进而参与植物抗病过程,为深入研究其结构和功能打下基础。

北京地区菜田土壤抗生素抗性基因的分布特征

为研究北京地区菜田土壤抗生素抗性基因（antibiotic resistance genes,ARGs）的污染状况和分布特征,采集了11个长期施用粪肥蔬菜基地的温室土壤和大田土壤,进行了抗生素以及ARGs种类和丰度的检测.结果表明,菜田土壤中四环素类抗生素残留量最高,其次为磺胺类抗生素,温室土壤抗生素残留普遍高于大田土壤.温室和大田土壤磺胺类抗性基因sul1、sul2和四环素类抗性基因tet L的检出率均为100%.温室土壤的Ⅰ类整合子（int I1）检出率比大田土壤高1.5倍.定量PCR的检测结果表明,菜田土壤中sul2和tet L的相对丰度介于10-4-10-2之间,温室土壤sul2和tet L的相对丰度普遍高于大田土壤.sul2的相对丰度与磺胺二甲嘧啶和强力霉素的含量显著正相关（P〈0.05）,tet L相对丰度与抗生素含量无明显相关性（P〉0.05）.本研究结果对于掌握北京地区农田土壤ARGs的污染现状,以及从ARGs角度评估农艺措施具有重要的指导意义.