RNA传感器IFIH1对HPV阳性的宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的探讨RNA传感器干扰素诱导的解旋酶C结构域蛋白1(interferon-induced helicase C domain protein 1,IFIH1)对人乳头瘤病毒18型(human papillomavirus 18,HPV18)阳性的人宫颈癌细胞HeLa增殖、迁移和侵袭的影响。方法利用GEPIA数据库分析IFIH1在正常宫颈组织和宫颈癌组织中的表达。Western blot检测IFIH1在C33A和HeLa细胞中的表达。将HPV18基因组转染到正常上皮细胞HaCaT中,并利用Western blot和实时定量PCR检测IFIH1的表达水平。利用实时无标记动态细胞分析技术和CCK8法检测细胞的增殖能力。划痕愈合实验、Transwell迁移实验和侵袭实验分别检测细胞的迁移能力和侵袭能力。Western blot和免疫荧光实验检测STAT3和磷酸化STAT3的蛋白表达和定位。结果GEPIA数据库分析显示IFIH1在宫颈癌组织中的表达量明显高于正常宫颈组织(P<0.05);相比于C33A细胞,HeLa细胞中IFIH1的表达水平明显增加(P<0.01);与正常HaCaT细胞相比,转染HPV18的HaCaT细胞中IFIH1的表达增加(P<0.01);与阴性对照相比,敲低IFIH1明显抑制HeLa细胞的增殖、迁移和侵袭能力,而过表达IFIH1则促进C33A细胞的增殖、迁移和侵袭(P<0.01);敲低IFIH1后,磷酸化STAT3蛋白的表达减少(P<0.01)。结论IFIHI在被HPV感染的宫颈癌细胞中表达增加,这将促进细胞的增殖、迁移和侵袭能力,可能与激活STAT3有关。

解旋酶C诱导干扰素结构域蛋白1基因多态性与江苏地区汉族人群多发性肌炎／皮肌炎的相关性研究

目的探讨解旋酶C诱导干扰素结构域蛋白1基因（IFIH1）的单核苷酸多态性（SNP）rs1990760C〉T与江苏地区汉族PM／DM发病的相关性。方法共纳入183例PM／DM患者和400名健康对照。采用TaqmanMGB探针法对rs1990760进行基因分型；采用ELISA法检测抗黑色素瘤分化相关蛋白5（MDA5）抗体；基因型及等位基因的分布频率、Hardy-Weinberg平衡（HWE）采用r检验或Fisher确切概率法进行统计分析。结果各患者组和对照组IFIHI rs1990760。的基因型均符合HWE分布。T和C等位基因频率在PM／DM组（分别为20．8％和79．2％）、DM组（分别为20．9％和79．1％）、PM组（分别为20．5％和79．5％）和对照组（分别为18．0％和82．0％）之间的分布差异无统计学意义。在隐性模型（TT与CT＋CC）和加性模型（TT与CC）中，PM／DM组TT基因型频率均显著高于对照组（6．6％与2．8％，x2值分别为4．8和4．54，P值均为0．03），DM合并间质性肺疾病（ILD）组TT基因型频率均显著高于对照组（8．3％与2．8％，x2值分别为4．84和4．41，P值分别为0．03和0．04）差异有统计学意义。在隐性模型（TT与CT＋CC）中，PM未合并ILD组TT基因型频率显著高于对照组（9．8％与2．8％，x2=5．56，P=0．04），差异有统计学意义。抗MDA5阳性患者的rs1990760等位基因和基因型分布与对照组差异无统计学意义。结论IFIHI的rs1990760 TT基因型可能与江苏地区汉族PM／DM易感性相关，且其相关性可能因DM和PM患者是否合并ILD而有所不同。

Toll样受体4接头分子对乳酸诱导巨噬细胞M2极化的促进作用及其机制

目的:探讨Toll样受体4 (TLR4)接头分子髓样分化因子88 (MyD88)和诱导β干扰素的Toll/白细胞介素1 (IL)受体(TIR)结构域衔接蛋白(TRIF)基因敲除后对乳酸诱导巨噬细胞极化的促进作用,初步阐明乳酸免疫调控的可能机制。方法:体外培养小鼠巨噬细胞Raw264.7,采用慢病毒法构建CRISPR/Cas9基因编辑载体,定向敲除MyD88和TRIF基因(MyD88-KO组和TRIF-KO组),设未感染的Raw264.7细胞为对照组,实时荧光定量PCR (RT-qPCR)法和Western blotting法检测基因敲除效果。实验分为未处理Raw264.7细胞组、Raw264.7+乳酸组、MyD88-KO组、MyD88-KO+乳酸组、TRIF-KO组和TRIF-KO+乳酸组。15 mmol·L^(-1)乳酸诱导24 h后进行各指标检测。RT-qPCR法检测各组细胞中M2极化表型分子巨噬细胞甘露糖受体CD206和精氨酸酶1(Arg1) mRNA表达水平,光学显微镜下观察各组细胞形态表现,酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测各组细胞上清中肿瘤坏死因子α (TNF-α)、γ干扰素(INF-γ)和白细胞介素10 (IL0)水平,Western blotting法检测各组细胞中核因子κB (NF-κB)信号通路相关蛋白表达水平。采用Autodock软件将乳酸分别与TLR4、MyD88和TRIF分子对接并观察其结合情况。结果:采用CRISPR/Cas9技术进行基因定向敲除后,与对照组比较,MyD88-KO组和TRIF-KO组细胞中MyD88和TRIF mRNA及蛋白表达水平明显降低(P<0.05或P<0.01)。乳酸作用24 h后,与未处理Raw264.7细胞组比较,Raw264.7+乳酸组细胞中M2极化标志物CD206和Arg1 mRNA表达水平明显升高(P<0.05);与MyD88-KO组比较,MyD88-KO+乳酸组细胞中CD206和Arg1 mRNA表达水平均升高(P<0.05);与TRIF-KO组比较,TRIF-KO+乳酸组细胞中CD206和Arg1 mRNA表达水平均降低(P<0.05)。细胞形态表现,Raw264.7+乳酸组细胞表现出M2极化形态,即体积增大、明显突起伪足和偏锥形细胞比例增加;MyD88-KO+乳酸组细胞同样表现出M2极化形态变化;TRIF-KO+乳酸组细胞形态变化不明显。ELISA法检测,与未处理Raw264.7细胞组比较,Raw264.7+乳酸组细胞中TNF-α水平明显降低(P<0.05),INF-γ和IL0水平差异无统计学意义(P>0.05);与MyD88-KO组比较,MyD88-KO+乳酸组细胞中TNF-α水平明显降低(P<0.05),INF-γ水平差异无统计学意义(P>0.05),IL0水平明显升高(P<0.05);与TRIF-KO组比较,TRIF-KO+乳酸组细胞中TNF-α水平明显升高(P<0.05),INF-γ和IL0水平差异无统计学意义(P>0.05)。Western blotting法检测,与未处理Raw264.7组比较,Raw264.7+乳酸组、MyD88-KO组、MyD88-KO+乳酸组、TRIF-KO组和TRIF-KO+乳酸组细胞中TLR4蛋白表达水平差异均无统计学意义(P>0.05),Raw264.7+乳酸组细胞中核因子κB抑制蛋白α (IκB-α)和p65蛋白表达水平明显降低(P<0.05);与MyD88-KO组比较,MyD88-KO+乳酸组细胞中IκB-α和p65蛋白表达水平明显降低(P<0.05);与TRIF-KO组比较,TRIF-KO+乳酸组细胞中IκB-α和p65蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。分子对接,乳酸分别与TLR4、MyD88和TRIF形成氢键数为2、4和4,结合能分别为-2.72、-3.24和-3.66。结结论论:乳酸作用巨噬细胞后,可通过调控TRIF抑制IκB-α活性进而抑制NF-κB,促进M2极化。

TRIF在血栓闭塞性脉管炎患者血管组织中的表达水平及临床意义

目的探讨β干扰素Toll样受体结构域衔接蛋白(TRIF)在血栓闭塞性脉管炎(TAO)患者血管组织中的表达水平及临床意义。方法取因TAO行截肢手术的26例患者(TAO组)和因非血管疾病行截肢手术的18例患者(对照组)的血管组织,采用反转录PCR(RT-PCR)及Western blot检测两组患者血管组织中的TRIF表达水平并进行组间比较。进一步采用免疫荧光共聚焦技术观察TRIF在TAO患者血管组织中的表达特点。结果TAO患者血管组织中TRIF的mRNA和蛋白表达水平明显高于对照组(P<0.05)。并且,在TAO患者中,TRIF主要表达于血管平滑肌细胞。结论TRIF的表达与TAO的起病关系密切,TRIF信号通路诱导的炎性反应可能是TAO发病的重要因素之一。

pSG5/TRIF质粒的构建及在Huh7细胞中的表达

目的构建pSG5/Myc-TRIF质粒,并检验其在Huh7细胞中的瞬时表达。方法首先用NotⅠ酶切既往构建的pCX4pur/Myc-TRIF质粒,平末端化,然后用EcoRⅠ酶切,获得TRIF片断。用SmaⅠ和EcoRⅠ先后酶切空载体pSG5。各酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。与预期吻合后,电泳回收靶片段。行连接反应。经筛选阳性克隆,扩大培养、提取、纯化重组质粒。BamHⅠ酶切鉴定重组质粒pSG5/Myc-TRIF。分别用FuGene6转染试剂和重组牛痘病毒(rVV)预感染后用Lipofectin转染重组质粒入Huh7细胞。用免疫荧光染色、Westernblot检测pSG5/Myc-TRIF的表达。结果经限制性内切酶BamHⅠ酶切后,琼脂糖凝胶电泳结果显示酶切片段大小与预期一致。转染后,荧光显微镜下可见Huh-7细胞表达Myc-TRIF蛋白,而且用rVV预感染后Lipofectin转染较用FuGene6转染表达率大大提高。Western blot结果显示在转染pSG5/Myc-TRIF的Huh7细胞中,均出现了大小约100ku的条带。rVV预感染后用Lipofectin转染较FuGene6转染表达量高,与免疫荧光染色结果一致。结论成功构建了pSG5/Myc-TRIF质粒。用rVV预感染Huh7细胞后再用Lipofectin转染重组质粒可以提高表达效率。

柯里拉京对小鼠单纯疱疹病毒性脑炎Toll样受体3-干扰素诱导链接蛋白通路的调控机制研究

目的:通过柯里拉京(Cor)干预单纯疱疹病毒性脑炎(HSE)小鼠模型,阐明柯里拉京对Toll样受体3(TLR3)信号通路的调控机制。方法:通过颅内注射单纯疱疹病毒1型(HSV1)建立单纯疱疹病毒性脑炎小鼠模型,每天定时灌胃1次等体积的柯里拉京或生理盐水,在第5天断头处死小鼠,取出右侧颞叶病变脑组织进行苏木精-伊红(HE)染色,在显微镜下观察小鼠脑组织病理改变,通过定时定量PCR检测TLR3及其下游信号分子TLR结构域的干扰素诱导链接蛋白(TRIF)mRNA的表达情况,Western blot检测TLR3、TRIF蛋白表达情况,ELISA法检测炎性组织细胞内干扰素α(IFN-α)的分泌情况。结果:HSE小鼠模型中TLR3及其下游分子TRIF的mRNA、蛋白表达及IFN-α的分泌均高于正常对照组(P<0.01);柯里拉京干预可有效缓解动物脑组织的病理变化,且TLR3及其下游分子TRIF的mRNA、蛋白表达及IFN-α的分泌均低于正常对照组(P<0.01)。结论:柯里拉京能明显抑制小鼠小胶质细胞内TLR3通路达到缓解单纯疱疹病毒1型引起的脑组织的损伤。

ARD1、DDR2和IFITM1在鼻咽癌中的表达及临床意义

目的探讨逮捕缺陷1蛋白(ARD1)、盘状结构域受体2(DDR2)、干扰素介导的跨膜蛋白1(IFITM1)在慢性鼻咽炎组织和鼻咽癌组织中的表达差异及其与患者临床预后的关系。方法选取2012年10月至2015年7月经病理组织活检确诊和存档的42例鼻咽癌组织和20例慢性鼻咽炎组织,采用实时荧光定量PCR法检测两组ARD1mRNA、DDR2 mRNA、IFITM1 mRNA表达水平;免疫组化法检测ARD1、DDR2、IFITM1蛋白表达水平;分析ARD1、DDR2、IFITM1蛋白表达与临床病理特征的关系;Kaplan-Meier法分析鼻咽癌组织中ARD1、DDR2、IFITM1表达与患者生存率的关系。结果与慢性鼻咽炎组织相比,鼻咽癌组ARD1 mRNA、DDR2 mRNA表达水平及蛋白阳性率均升高(P<0.05),IFITM1 mRNA表达水平及蛋白阳性率下降(P<0.05);ARD1、DDR2、IFITM1在有淋巴结转移、低分化、TNM分期为Ⅲ~Ⅳ期患者中阳性表达率高于无淋巴结转移、中高分化、TNM分期为Ⅰ~Ⅱ期患者(P<0.05);ARD1阴性表达者3年生存率(85.7%)高于阳性表达者(45.7%)(P<0.05),DDR2阴性表达者3年生存率(84.6%)高于阳性表达者(37.9%)(P<0.05),IFITM1阳性表达者3年生存率(81.8%)高于阴性表达者(41.9%)(P<0.05)。结论鼻咽癌组织中ARD1、DDR2高表达,IFITM1低表达,与患者临床病理特征及预后有关。

DDR2和IFITM1在鼻咽癌中的表达及临床意义

目的探讨盘状结构域受体2(DDR2)、干扰素诱导跨膜蛋白1(IFITM1)在鼻咽癌患者中的表达及其临床意义。方法选取2014年11月至2015年11月本院收治的鼻咽癌患者65例,所有患者均实施鼻咽活检术,活检术后组织标本石蜡包埋,所有标本均经病理学证实。另选取同期65例病理证实为慢性炎症的鼻炎黏膜标本作为对照组。收集两组患者的临床病理资料,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测DDR2、IFITM1 mRNA表达水平,免疫组化检测鼻咽癌组织DDR2、IFITM1蛋白表达,Pearson法进行相关性分析,对所有患者进行3年随访,采用Kaplan-Meier法对患者进行3年生存期分析。结果qRT-PCR检测结果显示,鼻咽癌组织DDR2、IFITM1 mRNA相对表达水平均显著高于对照组(P<0.05);免疫组化检测结果显示DDR2、IFITM1在鼻咽癌组织中阳性表达率显著高于对照组(P<0.05);DDR2表达与TNM分期、分化程度、浸润深度有关(P<0.05),IFITM1表达与淋巴结转移、TNM分期、分化程度及浸润深度有关(P<0.05);Pearson相关性分析结果显示DDR2与IFITM1呈正相关(r=0.608,P<0.01);Kaplan-Meier分析结果显示,DDR2阴性表达组3年无进展生存率(41.17%)、总生存率(52.94%)显著高于阳性表达组无进展生存率(16.67%)、总生存率(18.75%)(P<0.05),IFITM1阴性表达组无进展生存率(42.86%)、总生存率(61.90%)显著高于阳性表达组无进展生存率(18.18%)、总生存率(20.45%)(P<0.05)。结论DDR2、IFITM1在鼻咽癌组织中均异常高表达,其可能参与鼻咽癌的发生发展过程,且影响患者的预后。

5种生物标志物对ARDS预后的预测分析

目的 分析5种生物标志物干扰素诱导的解旋酶C域蛋白1(interferon-induced helicase C domain-containing protein 1, IFIH1)、基因干扰素调节因子1(gene interferon regulatory factor 1, IRF1)、信号传导及转录激活蛋白(signal transducer and activator of transcription, STAT1)、鸟苷结合蛋白1(guanylate binding protein 1, GBP1)、干扰素诱导蛋白与四肽重复序列3(interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 3, IFIT3)对急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)预后的预测。方法 选择2017年1月至2017年12月东南大学附属中大医院重症医学科收治的26例ARDS患者为对象,采集患者外周血行芯片检测,提取5种生物标志物IFIH1、IRF1、STAT1、GBP1、IFIT3表达量。采用单因素Cox回归和受试者工作特征曲线(ROC)评估5种生物标志物和ARDS严重程度与28 d累积病死率相关性。采用多因素COX回归构建联合模型。结果 5种生物标志物表达与ARDS患者28 d累积病死率相关(P<0.05),ARDS严重程度和28 d累计病死率不相关(P>0.05):IFIH1[HR 2.309 95%CI(1.162, 4.590)];IRF1[HR 3.152 95%CI(1.043, 9.528)];IFIT3[HR 1.793 95%CI(1.103, 2.917)];GBP1[HR 2.342 95%CI(1.087, 5.047)];STAT1[HR 2.492 95%CI(1.388,4.474)];ARDS严重程度[HR 1.665 95%CI(0.598, 4.628)]。5种生物标志物及ARDS严重程度预后预测ROC曲线下面积分别为0.883、0.833、0.900、0.925、0.908、0.625。联合模型对28 d预后预测性为0.950。结论 对ARDS患者预后的预测,5种生物标志物优于柏林标准ARDS严重程度。5种生物标志物构建的模型选出预后不佳的ARDS患者,具有临床意义。

尿液新型生物标志物对顺铂诱导大鼠急性肾早期损伤的诊断效能研究

目的在顺铂诱导的大鼠急性肾损伤模型中,系统评价短时间采尿下系列尿液肾毒性生物标志的诊断性能。方法Wistar大鼠单次ip 6 mg·kg^(-1)顺铂构建急性肾损伤模型,在检疫期、给药后第3和6天分别收集给药后5 h对照组和顺铂组动物尿液和血样,使用日立7180全自动生化仪测定血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBIL)、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)以及尿液样本中尿葡萄糖苷酶(NAG)、尿总蛋白(uTP)、尿肌酐(uCr)水平;使用Luminex仪器测定尿液中丛生蛋白(CLU)、谷胱甘肽S转移酶-α(GST-α)、干扰素诱导蛋白-10(IP-10)、肾损伤因子-1(KIM-1)、骨桥蛋白(OPN)、组织金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)、血管内皮生长因子-A(VEGF-A)、酸性糖蛋白(AGP)、白蛋白(Alb)、β_(2)微球蛋白(β_(2)M)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(CysC)、表皮生长因子(EGF)、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)水平。结合动物肾脏组织病理学检查,制作受试者操作特性曲线(ROC)进行肾毒性标志物的灵敏度和特异性分析。结果顺铂组动物AST、ALT、TBIL值与各自对照组比较无统计学差异,且解剖大体检查并未发现除肾脏以外其他组织器官病变,排除其他组织器官病变对肾生物标志物变化的影响。组织病理学结果证实顺铂诱导动物模型均出现典型急性肾损伤:外髓质外带肾小管上皮细胞变性/坏死和髓质蛋白管型等。与对照组比较,传统标志物血清BUN和CRE在顺铂给药第6天、动物严重肾损伤时才出现显著升高(P<0.05);而IP-10、KIM-1、Alb、β_(2)M和CLU生物标志物则在给药第3天已出现显著增加(P<0.05),且持续升高,增幅明显高于传统指标。ROC分析结果表明,IP-10、CysC、KIM-1和Alb的曲线下面积(AUC)明显优于BUN和CRE,具有更高的灵敏度和特异性。结论尿液IP-10、CysC、KIM-1和Alb的肾毒性诊断性能优于传统生物标志物BUN和CRE,建议可作为药物致急性肾毒性早期诊断的生物标志物。