Anti-IL-12/IL-23 p40抗体对实验性自身免疫性葡萄膜炎的抑制作用及其机制

目的探讨Anti-白细胞介素(IL)-12/IL-23 p40抗体对实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)的抑制作用及其机制。方法选取SPF级健康无眼疾6~8周龄雌性C57BL/6N小鼠66只,其中24只采用光感受器维生素A类结合蛋白(IRBP)651-670诱导小鼠EAU模型,分别在免疫前及免疫后第3、12、18天各取6只小鼠,流式细胞术检测各时间点小鼠脾脏、淋巴结和眼球中IL-17A^(+)γ干扰素(IFN-γ)^(+)CD4^(+)T细胞比例。取6只小鼠制作EAU模型,免疫后18 d采用小动物成像仪进行眼底拍照并行光相干断层扫描(OCT)检查。检查完成后处死小鼠,摘取眼球,采用苏木精-伊红染色法检测小鼠视网膜炎症反应和组织结构形态学改变;取淋巴结行流式细胞术检测IL-17A^(+)IFN-γ^(+)CD4^(+)T细胞比例,按照表达数量不同分为IL-17A^(+)IFN-γ^(+)细胞高表达组和IL-17A^(+)IFN-γ^(+)细胞低表达组,比较2个组小鼠视网膜损伤情况。取36只小鼠制作EAU模型,采用随机数字表法分成Anti-IL-12/IL-23 p40组和IgG组,每组18只,分别尾静脉注射Anti-IL-12/IL-23 p40和IgG,每3天1次。免疫后第12天和第18天每组各取6只小鼠,分别取淋巴结和眼球组织,采用流式细胞仪检测T细胞亚群比例。免疫后第24天,每组各取6只小鼠,摘取眼球,采用苏木精-伊红染色法观察视网膜损害情况;采用流式细胞仪检测CD4^(+)T细胞体外诱导分化情况;采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测IL-17A^(+)IFN-γ^(+)CD4^(+)T细胞诱导分化后IL-17和IFN-γ表达情况;采用实时荧光定量PCR法检测IL-17A^(+)IFN-γ^(+)CD4^(+)T细胞诱导分化后Th1细胞转录因子T-bet和Th17细胞转录因子维甲酸相关孤核受体γt(ROR-γt)相对表达量。结果免疫前和免疫后第3、12、18天,淋巴结、脾脏、眼球中IL-17A^(+)IFN-γ^(+)CD4^(+)T细胞比例总体比较差异均有统计学意义(H=9.642、16.531、10.385,均P<0.05),其中与免疫前相比,EAU小鼠免疫后第12天淋巴结IL-17A^(+)IFN-γ^(+)CD4^(+)T细胞比例明显升高;免疫后第18天脾脏、眼球中IL-17A^(+)IFN-γ^(+)CD4^(+)T细胞比例明显升高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。IL-17A^(+)IFN-γ^(+)细胞高表达组小鼠视网膜严重水肿、视网膜脱离、重度炎性细胞浸润和广泛视网膜褶皱;IL-17A^(+)IFN-γ^(+)细胞低表达组小鼠视网膜轻度水肿、局灶性炎性细胞浸润、轻度视网膜褶皱。Anti-IL-12/IL-23 p40组免疫后18 d,眼球中CD3和IL-17A^(+)IFN-γ^(+)CD4^(+)T细胞比例低于IgG组,差异均有统计学意义(t=15.304、8.080,均P<0.05);免疫后12 d,Anti-IL-12/IL-23 p40组淋巴结中IL-17A^(+)IFN-γ^(+)CD4^(+)T细胞比例为(0.33±0.18)%,明显低于IgG组的(4.83±0.45)%,差异有统计学意义(t=15.974,P<0.001)。与IgG组相比,Anti-IL-12/IL-23 p40组Th1、Th17、IL-17A^(+)IFN-γ^(+)CD4^(+)T细胞百分比及IL-17、IFN-γ、T-bet、ROR-γt表达量明显降低,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论Anti-IL-12/IL-23 p40可通过抑制IL-17A^(+)IFN-γ^(+)CD4^(+)T细胞发挥对EAU的治疗作用。

阻断白介素12p40功能的新型治疗性单克隆抗体的开发

目的设计并利用抗体工程方法构建并制备全新序列的阻断白介素12(IL-12)p40功能的单克隆抗体MAB1,并对其生物学活性进行鉴定,以制备可应用于治疗多种自身免疫病的IL-12通路的阻断剂。方法根据已有的IL-12 p40蛋白序列,设计、构建并制备了全新的单克隆抗体MAB1,利用间接ELISA测定其与抗原结合的亲和力,并用细胞学方法鉴定它的生物学活性。结果抗体MAB1与p40抗原的结合亲和力为0.0399 nmol/L,并能明显抑制IL-12诱导的人皮肤淋巴细胞相关抗原(CLA)水平上调。其抗原结合能力以及抑制IL-12生物学活性能力与美国强生公司抗体药Stelara(ustekinumab)相当或更优。结论全新构建的单克隆抗体MAB1可作为IL-12通路的高亲和力阻断剂,从而成为自身免疫疾病(例如斑块型银屑病)治疗用新药的临床候选药物。

IL-12双亚基共表达载体的构建及其在人骨髓间充质干细胞中的表达

目的构建人IL-12(hIL-12)p40和p35双亚基真核共表达载体并转染人骨髓间充质干细胞(hMSC)。方法根据hIL-12p40和p35亚基全长cDNA序列分别设计合成引物行PCR扩增,将扩增所得p40和p35片段采用overlapPCR法拼接,获得的rhIL-12融合基因与pGEM-TEasy质粒连接,将鉴定正确的pGEM-T/rhIL-12重组质粒克隆至pcDNA3.1(+)真核表达质粒中,构建pcDNA3.1(+)/rhIL-12真核表达载体,并进行测序鉴定。将鉴定正确的pcDNA3.1(+)/rhIL-12经脂质体介导转染hMSC,同时以转染pcDNA3.1(+)空质粒作为对照组,在倒置显微镜下观察细胞生长形态;在转染后第4天采用蛋白质印迹法检测细胞培养上清液中rhIL-12融合基因的表达;另分别在转染后第2、4、6、8、10、12、14天,采用ELISA方法检测细胞培养上清液中rhIL-12融合基因的表达水平。结果PCR扩增结果显示特异性扩增出p40(1000bp)、p35(600bp)、rhIL-12(1600bp)片段,均与预期DNA表达片段大小一致。pcDNA3.1(+)/rhIL-12测序显示克隆的rhIL-12基因序列与报告序列完全相同。倒置显微镜下观察,可见转染pcDNA3.1(+)/rhIL-12的hMSC生长形态和生长速度与对照组hMSC相比均无明显差异。蛋白质印迹和ELISA检测显示,转染pcDNA3.1(+)/rhIL-12的hMSC培养上清液中可见rhIL-12融合蛋白的持续表达;而对照组中均未检测到rhIL-12融合蛋白表达。结论成功构建了hIL-12p40和p35双亚基真核共表达载体pcDNA3.1(+)/rhIL-12,为利用hIL-12进行非病毒载体抗肿瘤基因治疗奠定了基础。目的构建人IL-12(hIL-12)p40和p35双亚基真核共表达载体并转染人骨髓间充质干细胞(hMSC)。方法根据hIL-12p40和p35亚基全长cDNA序列分别设计合成引物行PCR扩增,将扩增所得p40和p35片段采用overlapPCR法拼接,获得的rhIL-12融合基因与pGEM-TEasy质粒连接,将鉴定正确的pGEM-T/rhIL-12重组质粒克隆至pcDNA3.1(+)真核表达质粒中,构建pcDNA3.1(+)/rhIL-12真核表达载体,并进行测序鉴定。将鉴定正确的pcDNA3.1(+)/rhIL-12经脂质体介导转染hMSC,同时以转染pcDNA3.1(+)空质粒作为对照组,在倒置显微镜下观察细胞生长形态;在转染后第4天采用蛋白质印迹法检测细胞培养上清液中rhIL-12融合基因的表达;另分别在转染后第2、4、6、8、10、12、14天,采用ELISA方法检测细胞培养上清液中rhIL-12融合基因的表达水平。结果PCR扩增结果显示特异性扩增出p40(1000bp)、p35(600bp)、rhIL-12(1600bp)片段,均与预期DNA表达片段大小一致。pcDNA3.1(+)/rhIL-12测序显示克隆的rhIL-12基因序列与报告序列完全相同。倒置显微镜下观察,可见转染pcDNA3.1(+)/rhIL-12的hMSC生长形态和生长速度与对照组hMSC相比均无明显差异。蛋白质印迹和ELISA检测显示,转染pcDNA3.1(+)/rhIL-12的hMSC培养上清液中可见rhIL-12融合蛋白的持续表达;而对照组中均未检测到rhIL-12融合蛋白表达。结论成功构建了hIL-12p40和p35双亚基真核共表达载体pcDNA3.1(+)/rhIL-12,为利用hIL-12进行非病毒载体抗肿瘤基因治疗奠定了基础。

Moderating effect of synthesized docosahexaenoic acid-enriched phosphatidylcholine on production of Th1 and Th2 cytokine in lipopolysaccharide-induced inflammation

Objective: To evaluate effects of docosahexaenoic acid-enriched phosphatidylcholine(DHAPC) on cytokine production induced by lipopolysaccharide(LPS). Methods: The culture supernatants of splenocytes exposed to DHA-PC along with LPS were harvested to determine the production of Th 1(IFN-kines. Cytokines were m毭 and IL-2) and Th2 [IL-4, IL-5, IL-6 and IL-12/IL-23(p40)] cytoeasured using ELISA. Results: Co-administration of DHAPC with LPS resulted in significantly lower IL-2 expression compared to that observed with administration of only LPS(P<0.01). Treatment with DHA-PC and LPS significantly increased IL-5 expression(P<0.01). Moreover, co-administration of DHA-PC with LPS significantly decreased IL-6 and IL-12/IL-23(p40) expressions compared to that observed with administration of only LPS(P<0.01). Conclusions: Our results suggest that DHA-PC inhibits pro-inflammatory cytokines [IL-2, IL-6 and IL-12/IL-23(p40)] expression on induction of inflammation.

白细胞介素12亚单位p40基因1188A／C多态与多发性硬化的关系

目的探讨中国南方人群中白细胞介素12亚单位p40（IL-12B）基因＋1188A／C位点多态与复发缓解型多发性硬化（RRMS）的相关性。方法收集中山大学附属第三医院神经内科就诊的RRMS患者94例，以145名性别、年龄相匹配的健康体检者为对照，采用聚合酶链反应一限制性片段长度多态性（PCR—RFLP）方法检测IL-12B基因＋1188A／C位点多态，并进行统计学分析。结果RRMS患者IL-12B基因＋1188A／C位点A等位基因频率（64．4％）高于健康对照组（53．8％），差异有统计学意义（Х^2=5．228，P=0．022）。携带A等位基因增加RRMS发病的危险性（OR=1．551，95％CI 1．064—2．262）。结论IL-12B基因＋1188A／C位点多态与RRMS相关，A等位基因可能是中国南方人群RRMS发生的危险因素。

白细胞介素-12 p40 3’非翻译区基因多态性与丙型肝炎病毒感染的相关性

目的探讨丙型肝炎患者IL-12脚03’非翻译区rs3212227位点基因多态性与HCV感染的关系。方法应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析（PCR—RFLP）和DNA测序的方法检测127例丙型肝炎患者IL-12 p40 03’非翻译区rs3212227位点的基因型，采用荧光定量PCR技术测定丙型肝炎患者血清HCVRNA水平。组间基因型及等位基因分布频率比较采用χ2检验。结果丙型肝炎患者IL-12 p40 3＇非翻译区rs3212227位点AA、AC、CC基因型分布频率分别为34．6％、40．9％和24．4％，等位基因A、C分布频率分别为55．1％、44．9％。丙型肝炎患者中HCVRNA≥2．0×10^6拷贝／mL组IL～12 p40 rs3212227位点C等位基因携带者分布频率明显高于HCVRNA〈2．0×10^6拷贝／mL组（χ2=7．367，P=0．007）。IFN无应答组IL-12 p40 rs3212227位点C等位基因分布频率明显高于IFN应答组（χ2=4．942，P=0．026）。结论IL-12 p40 3’非翻译区rs3212227位点基因多态性与HCV感染具有相关性，携带C等位基因的个体可能更利于HCV复制，而不利于IFN治疗。