福氏志贺菌毒力蛋白IpaC的表达、纯化及免疫活性鉴定

目的表达、纯化福氏志贺菌毒力蛋白IpaC并对其免疫活性进行鉴定。方法将含有ipaC基因的pET32a-ipaC表达质粒载体转入大肠杆菌BL21(λDE3)中表达,表达产物进行SDS-PAGE鉴定,并采用QIAexpressionistTM蛋白纯化系统纯化IpaC蛋白;用纯化的蛋白免疫动物获得抗血清,Western-blot检测抗原的免疫活性。结果诱导后的表达产物经SDS-PAGE发现有一相对分子量约为63000的条带,其含量约占总蛋白量的11%,对融合蛋白进行纯化纯度可达90%以上,抗His的抗体Western-blot分析,发现特异性区带出现在63000u处,证明该蛋白是所要表达的融合蛋白,制备的免疫血清可与IpaC发生特异免疫反应。结论pET32a-ipaC重组表达质粒转入大肠杆菌后,可稳定、高效地表达毒力蛋白IpaC,且纯化后的蛋白具有免疫活性。

利用免疫沉淀法对鸡源志贺菌IpaC蛋白受体候选蛋白的初步筛选

为筛选鸡源志贺菌IpaC蛋白的受体。利用生物素标记试剂盒标记IpaC蛋白，分离培养原代鸡肠上皮细胞和。利用ProteoExtract？天然膜蛋白提取试剂盒提取鸡肠上皮细胞的膜蛋白；应用免疫沉淀、免疫磁珠法分离富集与IpaC蛋白结合的蛋白质；利用SDS-PAGE电泳检测和Western blot鉴定。结果获得了与IpaC蛋白特异性结合的大约在34000～55000之间的蛋白条带。筛选得到的SDS-PAGE蛋白条带进行LC—MS／MS测序鉴定和生物信息学分析。初步将annexin A2，37000 Laminin receptor precursor，LIM and SH3 proteinl，ras—related protein Rab-43作为IpaC蛋白受体的候选蛋白。为研究志贺菌在鸡体内的致病机制奠定基础，而且可以为评估鸡源志贺菌在公共卫生方面的重要性提供参考依据。

痢疾志贺菌侵袭素IpaC的原核表达及纯化复性

目的为进一步研究痢疾志贺菌侵袭素IpaC蛋白的侵袭活性,必须先获得IpaC重组融合蛋白。方法将IpaC基因亚克隆至表达载体pET-24α(+)中,转化至E.coli BL21(DE3)表达宿主菌中,采用IPTG优化诱导表达,然后纯化复性重组蛋白。结果重组蛋白最佳表达条件为0.50mmol/L IPTG、30℃诱导6h,获得分子量约为33kDa的IpaC重组蛋白。Western blotting证实了重组蛋白的特异性。IpaC重组蛋白主要以包涵体形式在宿主菌中表达,通过纯化后得到单一的目的蛋白。结论成功构建IpaC原核表达体系,并获得了蛋白的高效表达及优化。初步建立了IpaC重组蛋白的纯化方案。为进一步研究IpaC的侵袭性作用奠定了基础。

鸡源志贺菌IpaC蛋白单抗制备及其受体的初步鉴定

为制备特异性的鸡源志贺菌IpaC蛋白单克隆抗体和鉴定其受体,以纯化的重组鸡源志贺菌IpaC蛋白制备多克隆抗体,Western blot和间接ELISA分析表明重组IpaC蛋白具有很好的免疫反应原性。将纯化的IpaC蛋白免疫BALB/c小鼠,通过淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体。经过杂交瘤细胞阳性孔的筛选、单克隆抗体效价测定、单克隆抗体亚型鉴定、单克隆抗体Western blot鉴定后,获得1株杂交瘤阳性细胞5A12B5。同时,通过鸡胚肠组织提取总蛋白,利用铺覆蛋白印迹技术,初步测定IpaC蛋白受体相对分子质量约为55 000。试验为IpaC蛋白检测和该蛋白与鸡肠上皮细胞之间的相互作用研究奠定基础,同时也为评估鸡源志贺菌在公共卫生等方面的重要性提供参考依据。