三株异菌脲高效降解菌株的筛选、鉴定及其降解特性分析

为筛选适宜青藏高原地区的异菌脲高效降解菌株资源,采用富集培养法从西藏自治区蔬菜大棚土壤中分离得到Y-20、Y-29和Y-32三株异菌脲高效降解菌株,通过形态特征、生理生化特性和16S rRNA基因序列分析对上述菌株进行初步鉴定,探讨NaCl浓度(m/V)、温度、pH值、接种量(V/V)和异菌脲初始浓度等因素对其异菌脲降解速率的影响,采用气相色谱法和PCR技术分析了上述菌株的异菌脲代谢途径及降解基因(ipaH)。结果表明,菌株Y-20、Y-29和Y-32为微杆菌属(Microbacterium)的3个不同种;在1.0%NaCl(m/V)、pH 7.0、25-30℃、5%的接种量(V/V)和100 mg/L初始异菌脲浓度的最佳条件下,上述菌株能够在8-12 h内完全降解100 mg/L的异菌脲;上述菌株能够将异菌脲降解为N-(3,5-二氯苯基)-2,4-二氧代咪唑烷和异丙基氨基甲酸,且含有高度相似的ipaH基因序列(99.14%-99.69%)。本研究为高原地区异菌脲污染环境的生物修复提供了菌株资源和理论依据。

PCR检测与细菌培养方法在细菌性痢疾监测中的应用比较

目的通过与PCR检测比较,确定细菌培养方法对细菌性痢疾疾病负担的低估程度。方法从2002年细菌性痢疾监测研究获得的10105份腹泻标本中随机选取337份,采用针对ipa H基因的PCR方法检测其志贺菌感染,并同传统细菌培养方法进行比较。结果337份腹泻标本中检测到ipa H基因212份,检出率为62.9%;而粪便培养阳性为39份,检出率为11.6%(P<0.001)。Logistic回归分析显示影响PCR检出的因素依次为细菌培养结果(OR=15.5;95%CI:2.0-119.0),具有发热症状(OR=2.8;95%CI:1.2-6.2),菌痢流行季节的腹泻(OR=2.4;95%CI:1.4-4.3)及女性病例(OR=1.8;95%CI:1.1-3.0)。结论与PCR检测相比,传统细菌培养方法使得菌痢的发病率在相当大的程度上被低估。

PCR快速检测腹泻患者粪中痢疾杆菌致病基因ipaH和ial

目的:建立一种快速、特异、敏感的分子生物学诊断方法对腹泻患者粪中痢疾杆菌致病基因ipaH及ial进行检测.方法:分别应用常规培养生化血清学鉴定方法、普通PCR、巢氏PCR(nested-PCR)方法,对71例腹泻患者粪标本进行检测.痢疾杆菌致病基因ipaH及ial的扩增产物经电泳分离.结果:在71例腹泻患者粪标本中,常规培养生化血清学鉴定方法分离出福氏痢疾杆菌24例,宋内痢疾杆菌23例,志贺痢疾杆菌1例,沙门菌23例.采用普通PCR法检测痢疾杆菌粪标本48例,ipaH基因均阳性(100%);ial基因阳性34例(70.8%),余14例为阴性.对该14例粪标本进而采用巢氏PCR法进行ial基因扩增,其中12份标本阳性.48例痢疾杆菌粪标本中46例ipaH和ial基因为双阳性(46/48).沙门菌粪标本23例中ipaH及ial基因表达均为阴性.以上两种方法的诊断一致性检验Kappa=0.937,差异有统计学意义(P<0.05).71例腹泻患者粪标本采用PCR和巢氏PCR法扩增得到的ipaH和ial基因特异片段与基因库中发表的标准菌株序列比较,一致性为100%.结论:建立了快速诊断腹泻患者粪中痢疾杆菌致病基因ipaH和ial的PCR检测方法,具有简便、快速、特异和敏感的特点.

乳中志贺氏菌的荧光定量PCR检测方法的建立

为了快速、有效的检测乳中的志贺氏菌,建立一种特异性强、灵敏度高的荧光定量PCR方法。根据GenBank公布的志贺氏菌ipaH基因的保守序列设计特异性引物,对提取的志贺氏菌DNA模板进行PCR扩增,对目的基因进行克隆和测序,然后利用荧光定量PCR方法,对志贺氏菌进行检测,确定其扩增条件。建立的方法特异性强,检测的灵敏度可达到10-6 ng/μL。利用建立的方法可检测乳中2.84 cfu/mL的志贺氏菌。该方法为快速、准确检测乳中的志贺氏菌提供了参考。

志贺氏菌实时荧光PCR检测试剂的研制

根据志贺氏菌ipaH基因序列设计了特异引物和探针,并对Taq酶、Mg2+和引物探度等反应条件进行了优化。结果表明用实时荧光PCR法检测志贺氏菌具有特异性强、灵敏度高等突出的优点,可应用于进出口检验检疫、食品安全检测、疾病控制等领域。

动物源性食品中志贺氏菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

根据志贺氏菌属高度保守的ipaH基因序列,设计探针和引物,通过优化反应条件,建立检测动物源性食品中志贺氏菌实时荧光定量PCR方法,应用于动物源性食品中志贺氏菌的快速检验。结果表明,该法灵敏度约为2.8 cfu·mL-1,经对205份肉类、蛋、奶及其制品和动物腹泻物、人工污染样品等进行检测,共检出13份阳性样本,与国标(GB 4789.5-2012)方法的检测结果一致。表明建立的荧光PCR方法操作简便、特异性强、灵敏度高,具有良好实用性。

志贺氏菌实时荧光单引物等温扩增方法的建立及应用

以志贺氏菌ipa H基因特异序列为靶序列,设计RNA-DNA组合引物和链终止序列,优化反应体系,建立实时荧光单引物等温扩增检测志贺氏菌的方法,反应时间为44 min。通过对4株不同群志贺氏菌和12株其他食源性致病菌进行实时荧光单引物等温扩增检测,结果表明,除4株志贺氏菌外,其他细菌均未扩增出荧光曲线。进一步研究表明,采用普通热裂解法提取DNA,实时荧光检测福氏志贺氏菌DNA的灵敏度为1.16 fg/μL,纯培养菌液的灵敏度为1.3 CFU/m L;对牛奶模拟样品中福氏志贺氏菌的检出限是1.8 CFU/m L。研究结果表明,实时荧光单引物等温扩增检测志贺氏菌灵敏度高、特异性强、耗时短、方法简便。

肠侵袭性大肠杆菌DPO-PCR检测方法的建立与应用

目的为建立肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）的DPO-PCR快速检测方法。方法本研究以EIECipaH基因为靶基因设计了一对双启动寡核苷酸（DPO）引物,建立了EIEC DPO-PCR检测方法。结果退火温度范围在47℃~67℃内都能有效地扩增出目的基因,表明该检测方法对退火温度不敏感;该DPO引物仅与EIEC的扩增反应呈阳性,而与其他菌株无非特异性扩增反应,表明该方法特异性强;该方法的灵敏度为1.17×102 cfu/mL。利用该检测方法对采集的230份样品进行检测,共计检出3份EIEC阳性样品,与国标法（GB 4789.6-2003）检测结果一致,显示了良好的实用性。结论该DPO-PCR方法设计简单、特异性强,具有良好的实用性。

大鼠4.5SsnRNA的cDNA序列对荧光素酶基因表达的影响

利用脂质体转染法将大鼠 4.5SsnRNAcDNA重组载体转染小鼠肾离体培养细胞 ,连续培养 48h、96h和 144h检测荧光素酶活性发现 ,4.5SsnRNAcDNA插入表达载体的方向不同对荧光素酶基因表达的影响无差异 ;重组体转化的细胞中荧光素酶基因表达的活性与对照组相比提高 2 - 2 .2倍 ;4.5SsnRNAcD NA对荧光素酶基因表达的影响 ,随转染细胞培养时间的延长而表达活性迅速下降 ,其下降速度实验组比对照组要快得多 .

志贺菌ipaH基因PCR检测方法的建立及应用

为了掌握青海省4种食源性动物体内志贺菌的分布情况,针对志贺菌属侵袭性质粒抗原H基因(invasive plasmid,ipaH)设计1对特异性引物,建立志贺菌的PCR检测方法,优化反应体系,检测该方法的敏感性和特异性,并将该方法应用于临床样本检测。结果表明,建立的PCR方法能特异性扩增志贺菌ipaH基因,而沙门氏菌、大肠杆菌、葡萄球菌、枯草杆菌、变形杆菌等均未扩增出条带;最低检测限值为1.8 pg/μL。在临床样本检测中,100株疑似菌株的阳性率为62.00%,其中牦牛源75.00%(3/4),鸡源35.29%(12/34),羊源44.44%(8/18),猪源88.64%(39/44);新鲜鸡粪和羊粪的阳性率分别为91.67%(11/12)和90.91%(10/11)。这说明试验所建立的PCR方法具有良好的敏感性和特异性,可应用于志贺菌的实验室诊断;4种动物体内均不同程度带菌,在临床诊断和治疗时不可忽视该菌的致病作用。

志贺氏菌属环介导恒温扩增快速检测方法的建立及初步应用

为建立快速检测志贺氏菌属的方法,本研究针对其ipaH基因,建立了志贺氏菌属环介导恒温护增(LAMP)快速检测方法。利用该方法对50株细菌进行检测,结果显示7株志贺氏菌均为阳性,其它菌均为阴性,表明该方法具有高度特异性。灵敏度试验显示,对志贺氏菌纯培养菌的检测灵敏度为28cfu/mL,对污染食品中志贺氏菌的检测灵敏度为35cfu/mL。利用该方法对195份涉及肉类、奶类、豆制品及人工污染样品进行检测,共检出29份阳性样品,与细菌分离鉴定检测结果一致。该LAMP方法操作简便、特异性强、灵敏度高且成本低廉,具有良好的应用前景。

应用DPO-PCR方法特异性检测志贺氏菌

本研究利用一种高特异性PCR引物设计方法——双启动寡核苷酸引物（dual-primingoligonucleotide，DPO），以志贺氏菌属侵袭性质粒抗原（ipaH）基因为靶基因，设计DPO引物，建立了特异性检测志贺氏菌属的DPO—PCR方法。结果显不，所建立的DPO-PCR方法检测灵敏度为1．65×10^2CFU／mL；与常规PCR引物相比，DPO引物设计简易，简化了PCR引物设计；DPO引物退火温度范围宽，在50-70℃退火温度内均可对靶基因进行高效扩增；DPO引物结构特殊，具有比常规PCR引物更高的特异性，反应中无非特异性扩增产生。实践检测结果显示，利用该方法对133份冻／鲜肉类、果蔬类、鲜牛奶、鸡蛋和熟食样本进行检测，共检出15份志贺氏菌阳性样本，经国标法（GB／T4789．5-2012）复检，两者检测结果一致，显示出良好的实用性和可靠性，为志贺氏菌快速、准确的检测提供了新手段。

志贺氏菌福氏2a 301株ipaH4.5突变株的构建及生物学功能分析

利用λ-Red重组系统对福氏2a志贺氏菌301株ipaH4.5基因进行缺失突变,构建了福氏2a志贺氏菌301株ipaH4.5基因缺失突变株?ipaH4.5,利用低拷贝质粒构建ipaH4.5缺失突变株的回复突变株△ipaH4.5HF。PCR方法证实了ipaH4.5基因的缺失和回复。对野生株、突变株和回复突变株的生长代谢及细胞侵袭能力进行比较;ELISA方法检测3株菌侵袭鼠J774巨噬细胞后培养上清中炎性因子的水平。生长代谢实验表明缺失和回复ipaH4.5不影响志贺氏菌的生长速度,侵袭实验表明缺失和回复ipaH4.5也不影响志贺氏菌对HeLa细胞和鼠J774巨噬细胞的侵袭能力,表明ipaH4.5基因与志贺氏菌的生长代谢和侵袭能力无关;鼠J774巨噬细胞培养上清中细胞因子水平的改变提示该基因在志贺氏菌侵入细胞后抑制宿主细胞炎症反应。

LAMP和PCR法检测痢疾志贺菌的特异性和灵敏性比较

目的建立环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测痢疾志贺菌,并对其特异性、灵敏度与传统PCR进行比较。方法以痢疾志贺菌侵袭性质粒抗原H基因(ipaH)为靶序列,设计6条特异性引物(内引物、外引物和环引物各2条),优化LAMP反应体系及反应条件,检测LAMP反应的灵敏度、特异性及模拟样品,同步与PCR进行比较。结果 LAMP法和PCR均能特异性地扩增出志贺菌靶DNA,而其他非志贺菌均未扩增出特有条带。检测细菌纯培养物和模拟食品的灵敏度LAMP法分别为5.3×101cfu/ml、6.8×101cfu/ml,PCR法分别为5.3×102cfu/ml和6.8×102cfu/ml。结论利用LAMP技术,可快速、灵敏、简便地检测痢疾志贺菌,与PCR方法比较,特异性强、操作简便、检测成本低、耗时短,有望发展成为快速检测痢疾志贺菌的有效手段。

福氏志贺菌Ⅲ型分泌系统效应子IpaH4．5功能的初步研究

目的:IpaH家族是福氏志贺菌Ⅲ型分泌系统(T3SS)效应子的成员,但功能不清,特别是对IpaH4.5的研究未见报道。本研究拟探讨IpaH4.5的功能。方法:克隆了福氏志贺菌2a 301株的IpaH4.5基因,构建了带Flag和GFP标签的IpaH4.5真核表达载体。通过Western印迹和共聚焦确定IpaH4.5在真核细胞293T中的表达和定位,通过报道基因的方法观察IpaH4.5对宿主细胞NF-κB途径的影响。结果:Western印迹证实IpaH4.5在真核细胞中有表达,激光共聚焦确定IpaH4.5在真核细胞中定位于细胞膜和细胞核,通过报道基因观察到它可以抑制宿主细胞的NF-κB途径。结论:发现IpaH4.5可以抑制NF-κB途径,为进一步研究IpaH4.5的功能奠定了基础。

城市生活污水中志贺氏菌ipaH毒力基因的定量PCR检测

基于ipaH毒力基因的实时荧光定量PCR检测,建立适合城市污水中志贺氏菌的定量检测方法。使用从临床分离出的志贺氏菌构建重组质粒作为实时荧光定量PCR的标准品。在ipaH基因模板量2.58×100～2.58×106copy范围内具有良好的线性关系,每100 mL水样中含有2.58×101copy以上的ipaH基因即可被检出。从西安市生活污水分离得到2株野生型志贺氏菌,分析ipaH基因数量和菌体数量的关系,从而确定ipaH基因定量检测志贺氏菌的可行性。该方法灵敏、快速、特异性好,适用于城市生活污水中志贺氏菌的检测。

环介导恒温核酸扩增技术快速检测志贺菌研究

目的:建立一种快速检测志贺菌的环介导恒温核酸扩增(LAMP)技术,为志贺菌食源性疾病监测、诊断提供技术支撑。方法:在对志贺菌基因序列进行分析、对比基础上,根据志贺菌ipaH基因序列保守区域设计6条特异性引物;通过对LAMP技术反应条件优化,实现对志贺菌的快速检测;用不同来源志贺菌及沙门菌、大肠杆菌、副溶血性弧菌、柠檬酸杆菌、金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌等菌株验证方法的敏感性和特异性。结果:当25μl反应体系中含1.6μmol/L内引物(FIP、BIP)、0.2μmol/L外引物(F3、B3)、0.2μmol/L环引物(LF、LB)、1 mmol/L dNTP、6 mmol/L Mg-SO4,0.8 mol/L甜菜碱、1×反应缓冲液、DNA模版,8 U Bst DNA聚合酶,扩增条件为60℃,60 min时,LAMP技术对志贺菌最低检测浓度为200 CFU/ml,经8 h增菌,最低检测浓度可达到20 CFU/ml。对32株不同来源的志贺菌检测结果,所有反应管内肉眼观察有混浊,为阳性,而13种139株其它非志贺菌株反应结果均呈透明为阴性。对50件食品检测结果与常规培养方法及实时荧光PCR方法相比无显著性差异(P>0.05,χ2=0.27)。结论:本研究建立的志贺菌LAMP检测方法具有特异性强、灵敏度高、方便快捷、成本低等特点,适合在基层、小型实验室以及无条件购买荧光定量PCR仪的病原微生物检验检测机构推广使用。

粪便样本中志贺菌分离培养方法的优化

目的优化从腹泻患者粪便标本中分离培养志贺菌的方法。方法使用EC肉汤和志贺菌增菌液对129份粪便样本进行增菌培养,采用普通PCR方法检测ipaH基因,使用木糖赖氨酸去氧胆酸钠琼脂(XLD)培养基、麦康凯琼脂(MAC)以及沙门志贺菌培养基(SS)等选择性培养基分离培养志贺菌。使用志贺菌参考菌株,进行模拟增菌培养,利用荧光定量PCR方法分析不同增菌液的增菌效果。结果利用志贺菌增菌液在厌氧条件下增菌后的样本,ipaH基因阳性率(55.81%vs.38.76%,P<0.01)和菌株分离率(26.36%vs.37.21%,P>0.05)均高于EC肉汤。除了XLD培养基,使用MAC以及SS等选择性培养基,能够提高菌株分离率。福氏志贺菌在厌氧条件下增菌,能提高菌的含量(Ct值降低),但对宋内志贺菌的影响不明显。结论对腹泻患者粪便样本进行选择性增菌,结合分子生物学方法,使用2~3种不同选择性培养基进行分离培养,可能是提高志贺菌分离率的有效方法。

LAMP技术应用于志贺菌及侵袭性大肠埃希菌ipaH基因快速检测

目的:建立一种适合基层实验室快速检测志贺菌及侵袭性大肠埃希菌(EIEC)的实验方法。方法:根据志贺菌及EIEC共同含有的侵袭性质粒抗原ipaH基因序列设计4条引物,应用环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal am-plification)方法,分别对8株背景明确的不同血清型志贺菌标准株、34株志贺菌地方分离株、1株EIEC实验标准株、7株大肠埃希菌本室保存标准株、3株大肠埃希菌暴发株、10株其他肠道实验对照株进行检测,验证该方法的特异性及最低检测限,通过肉眼目测与电泳检测比较结果。结果:本方法中共计42株志贺菌、1株EIEC及1株44147大肠埃希菌,经用LAMP方法检测,均为绿色并电泳有相应阶梯状条带为阳性结果,而9株其他大肠埃希菌及10株其他肠道实验对照株均呈橙色并电泳无相应阶梯状条带为阴性结果。至于1株44147大肠埃希菌为何也检测出ipaH基因,我们怀疑该菌株要么是EIEC中的一种,要么是在长期进化过程中从别处获得该基因,这尚待今后做进一步探讨。本方法具有较好的特异性,其最低检测限为53 cfu/反应,自然光下通过肉眼即可判断结果,从菌株核酸的提取至检测完成仅需1.5 h左右。应用本方法对24份不同临床病人样本进行实际考核,3份痰液、1份胸积水、2份粪便及18份尿样经检测ipaH基因均为阴性,该结果与分离培养/普通PCR检测结果相符。结论:本次建立的LAMP方法,能快速、特异地检测志贺菌/EIEC,较适合基层实验室应用。

环介导等温扩增技术快速检测志贺菌

目的建立能快速、特异检测志贺菌的环介导等温扩增技术。方法针对志贺菌侵袭性质粒抗原H基因(ipaH)设计4条引物,建立环介导等温扩增检测方法,优化反应体系,测定特异性和灵敏度,与PCR法进行比较,并进行了猪肉模拟样品和实际样品检测。结果环介导等温扩增技术特异性高。灵敏度高于PCR法,对细菌纯培养物的检测灵敏度为101cfu/ml,对猪肉模拟样品检测灵敏度102cfu/g。而PCR法的灵敏度分别为102cfu/ml和104cfu/g。采用环介导等温扩增技术在34份实际样品中检测出5份ipaH基因阳性。结论初步建立能快速、灵敏、特异地检测志贺菌的环介导等温扩增技术。其在食源性疾病监测和应急检测中具有重大意义,值得推广应用。