Regulatory Effect of Estrogen, Progestin and HB-EGF on the Expression of HOXA10 Gene in Ishikawa Cells

HOXA10 gene plays an essential role in differentiation of the endometrium and in human reproduction. The aim of this study was to investigate the regulatory effect of sex steroids and HB-EGF on HOXA10 gene in Ishikawa cells. Ishikawa cells were incubated with 17-beta estradiol （10-8 mol/L）, medroxyprogesterone acetate （MPA） （10^-6 tool/L）, RU486 （10^-5 mol/L） or HB-EGF （10 ng/mL） for 48 h respectively. The expression of HOXA10 gene was detected by immunofluorescence reverse transcriptase-polymerase chain reaction （RT-PCR） and Western blotting. Our results showed that either estrogen alone, progestin alone or progestin combined with estrogen could significantly increase the expression of HOXA10 gene 48 h after the treatment （P〈0.05）. But estrogen combined with progestin and RU486 could inhibit the up-regulation by estrogen and progestin. HB-EGF could elevate the expression of HOXA10 gene 48 h after the treatment （P〈0.05）. It is concluded that both estrogen and progestin can up-regulate the expression of HOXA10 gene in lshikawa cells, but RU486 can inhibit the effect and HB-EGF can elevate the expression level of HOXA10 gene.

氧化苦参碱抑制子宫内膜癌细胞株Ishikawa的实验研究

目的:观察不同浓度氧化苦参碱(oxymatrine,Oxy)对人子宫内膜癌细胞株Ishikawa增殖抑制及诱导凋亡作用。方法:培养人子宫内膜癌细胞株Ishikawa,通过细胞形态学观察、CCK-8比色法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期人工重组基底膜侵袭小室(transwell)观察细胞的侵袭力。结果:Oxy明显抑制Ishikawa增殖,并呈时效和量效关系,24h、48h、72h的IC50分别为8.07,4.62,3.22mg/ml;细胞周期发生明显改变。随着药物浓度增高,G1期细胞比例增加,S期细胞减少;流式细胞仪可检测到细胞凋亡现象,当Oxy浓度为10mg/ml时,细胞凋亡率65.4%;荧光显微镜可见细胞凋亡形态学变化;Ishikawa细胞侵袭基底膜的能力明显被抑制。结论:Oxy可抑制Ishikawa增殖,诱导Ishikawa细胞凋亡,有可能成为治疗子宫内膜癌的有效药物。

雌、孕激素及肝素结合生长因子对Ishikawa细胞HOXA10基因表达的调节

目的通过体外实验研究雌激素、孕激素、肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)对Ishikawa细胞中HOXA10基因表达的调节,探讨HOXA10基因在胚胎种植中的意义。方法体外培养高分化子宫内膜癌细胞Ishikawa,按实验目的分别加入雌激素、孕激素、雌孕激素联合、雌孕激素RU486联合、HB-EGF刺激48 h后,采用免疫荧光、逆转录聚合酶链反应、免疫印迹三种方法测定各个条件下Ishikawa细胞中HOXA10基因的表达。结果雌、孕激素单独或联合作用48 h后都可以显著提高Ishikawa细胞中HOXA10基因的表达(P<0.05),同时加RU486后HOXA10基因表达的上调趋势减弱。加HB-EGF刺激48 h后HOXA10基因的表达量增高(P<0.05)。结论雌、孕激素、HB-EGF对HOXA10基因的表达具有上调作用,RU486能够抑制孕激素的上调作用。

紫杉醇脂质体对子宫内膜癌Ishikawa细胞的体外杀伤作用

目的探讨注射用紫杉醇脂质体对人子宫内膜癌细胞系的体外杀伤作用。方法以不同浓度含紫杉醇脂质体的培养基作用于人子宫内膜癌细胞系Ishikawa细胞，并设对照（普通培养基），通过MTT、倒置显微镜观察细胞增殖状况及形态，流式细胞分析技术检测该药对细胞生长的影响。结果经不同浓度紫杉醇脂质体作用24～96h，细胞存活率显著下降（P〈0．05）；镜下观察显示部分细胞皱缩变形，崩解坏死，细胞脱壁悬浮；流式细胞术结果显示细胞凋亡率逐渐增加，细胞周期各时相中，S期比例减少。结论紫杉醇脂质体可抑制子宫内膜癌Ishikawa细胞的生长。

雌、孕激素和肝素结合生长因子对Ishikawa细胞金属蛋白酶组织抑制物-1表达的调节

目的通过体外实验研究雌激素、孕激素、肝素结合生长因子(HB-EGF)对Ishikawa细胞中基质金属蛋白酶-9 (MMP-9)、金属蛋白酶组织抑制物-1(TIMP-1)蛋白表达的调节及其在胚胎种植中的意义。方法体外培养高度分化的子宫内膜癌细胞Ishikawa,按实验目的分别加入雌激素、孕激素、雌孕激素联合、雌孕激素与米非司酮(RU486)联合、HB-EGF刺激48 h后,采用免疫细胞化学、Western blot两种方法测定各种条件下Ishikawa细胞中MMP-9、TIMP-1蛋白的表达。结果雌、孕激素单独或联合作用48 h后都可以显著降低Ishikawa细胞中TIMP-1蛋白的表达(P<0．05),同时加RU486后 TIMP-1蛋白的下降趋势减弱。相反,加HB-EGF刺激48 h后TIMP-1蛋白的表达增高(P<0．05)。各种因素处理48 h后, Ishikawa细胞中MMP-9蛋白均没有阳性表达。结论雌、孕激素对TIMP-1蛋白的表达具有下调作用,RU486可抑制孕激素的下调作用;HB-EGF对TIMP-1蛋白的表达具有上调作用;MMP-9蛋白在Ishikawa细胞中无表达。

AT1-R siRNA对雌激素诱导的Ishikawa细胞生物学行为的影响

目的:通过转染小干扰RNA(siRNA)沉默血管紧张素受体1(angiotensin receptor 1,AT1R)的表达来研究其对雌激素诱导的Ishikawa细胞增殖和细胞周期及凋亡的影响。方法:免疫荧光检测AT1R在子宫内膜癌Ishikawa细胞中的表达,转染AT1-R siRNA,Western blot检测转染前后Ishikawa细胞中AT1R蛋白的表达。MTT检测雌激素诱导Ishikawa细胞的增殖及雌激素诱导的雌激素受体抑制剂作用下转染前后Ishikawa细胞的增殖,Western blot检测细胞外调节蛋白激酶(extracellular signal-regulatedkinases 1/2,ERK1/2)表达。结果:免疫荧光检测AT1R表达于Ishikawa细胞,转染AT1-R siRNA 72 h后AT1R蛋白表达降低最显著,降低82.40%(P<0.05),为此检测转染72h后细胞增殖周期及凋亡,MTT结果显示,雌激素能诱导Ishikawa细胞增殖,封闭雌激素受体后雌激素诱导的Ishikawa细胞增殖受到抑制,封闭雌激素受体后雌激素诱导的转染组细胞增殖较未转染组受到明显抑制;流式细胞周期结果显示,雌激素受体封闭后雌激素诱导的转染组细胞较未转染组S期减少,凋亡增多(P<0.05),其ERK1/2表达较未转染组明显降低(P<0.05)。结论:AT1R可促进雌激素诱导的Ishikawa细胞增殖,其机制可能与ERK1/2表达下降有关。

Tie2-siRNA表达载体对子宫内膜癌Ishikawa细胞株化疗敏感性的研究

目的:研究Tie2表达对子宫内膜癌细胞株化疗敏感性的影响,探索子宫内膜癌辅助治疗新方法。方法:将表达Tie2-siRNA的碱基片段插入含有CMV启动子、新霉素抗性基因及绿色荧光蛋白报告基因的质粒中,应用脂质体包涵体技术将质粒转染入子宫内膜癌Ishikawa细胞株,以减少Tie2基因表达,采用逆转录PCR及蛋白印迹方法鉴定。DAPI染色检测各组细胞凋亡。不同浓度卡铂处理细胞,检测各组细胞的化疗敏感性。结果:成功转染后,Ishikawa细胞中Tie2 mRNA及蛋白表达水平的抑制率分别为75.5%及56.4%,Tie2-siRNA组细胞凋亡增加,化疗敏感性增加。Tie2-siRNA组的卡铂IC50为(29.95±0.68)μg/ml,低于空白对照组(80.55±1.05)μg/ml。结论:降调Tie2基因的转录及表达可促进子宫内膜癌细胞凋亡,增加子宫内膜癌细胞对化疗药物的敏感性。

雌激素及其阻滞剂对Ishikawa细胞中ETS-1和VEGF调控的研究

目的:探讨雌激素及其阻滞剂对子宫内膜癌细胞系Ishikawa细胞中转录因子ETS-1和血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达的调控机制。方法:用RT-PCR法检测分别使用不同浓度雌激素、雌激素受体阻滞剂氟维司群处理后Ishikawa细胞中ETS-1基因表达水平的变化;用细胞爬片免疫组化法检测分别使用这两种不同浓度药物后Ishikawa细胞中ETS-1与VEGF表达的差别;采用ELISA法检测分别使用两种不同浓度的药物后Ishikawa细胞培养液中VEGF蛋白表达量的变化。结果:(1)随着雌激素浓度增加,ETS-1基因表达上调(FP=3.84,P<0.05);随着氟维司群浓度增加,ETS-1基因表达下调(FP=7.01,P<0.01);(2)随着雌激素浓度增加,ETS-1(FP=3.72,P<0.05)和VEGF(FP=3.68,P<0.05)蛋白质水平表达都增加;随着氟维司群浓度增加,ETS-1(FP=4.37,P<0.05)和VEGF(FP=4.09,P<0.05)蛋白质水平的表达都减少;(3)随着雌激素浓度增加,分泌型VEGF蛋白表达量上升(FP=3.91,P<0.05);随着氟维司群浓度增加,分泌型VEGF蛋白表达量下调(FP=7.34,P<0.01)。结论:雌激素可促进Ishikawa细胞中ETS-1和VEGF的表达,VEGF表达与ETS-1表达呈正相关。

吉非替尼对子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨EGFR酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼(Gefitinib)对子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖和凋亡的影响,并探讨其内在作用机制。方法:MTT法检测不同浓度吉非替尼作用后细胞的增殖抑制率。采用流式细胞术检测吉非替尼作用48h后的细胞凋亡率及细胞周期分布,并用倒置显微镜对细胞进行形态学观察。Western blot法检测不同浓度吉非替尼作用细胞48h后细胞内p-Akt、CyclinD1蛋白水平表达的变化。结果:吉非替尼能显著抑制Ishikawa细胞的增殖,促进细胞凋亡,且呈时间-剂量依赖性(P<0.05),并使细胞周期中G0/G1期比例升高(P<0.05),而对S期和G2/M期比例无明显影响(P>0.05)。吉非替尼作用48h后,Ishikawa细胞中p-Akt、CyclinD1蛋白表达随着吉非替尼浓度的增加逐渐下降(P<0.05)。结论:吉非替尼对人子宫内膜癌细胞Ishikawa的体外生长具有明显的抑制作用,并能诱导Ishikawa的凋亡,导致G0/G1期细胞阻滞,其分子机制可能与吉非替尼下调p-Akt蛋白及CyclinD1蛋白的表达有关。

四种人子宫内膜癌细胞系中IGFBP-rP1的定位及表达

目的:检测不同子宫内膜癌细胞系中胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1(IGFBP-r P1)的定位及表达情况。方法:体外培养子宫内膜癌细胞Ishikawa、RL95-2、HEC-1B和HEC-1A,细胞免疫荧光法检测IGFBP-r P1在4种子宫内膜癌细胞中的定位;实时荧光定量PCR法与Western blot法检测4种子宫内膜癌细胞中IGFBP-r P1 mRNA及蛋白的表达水平。结果:细胞免疫荧光染色示IGFBP-r P1主要定位于4种子宫内膜癌细胞的胞浆。子宫内膜癌Ishikawa、RL95-2细胞中IGFBP-r P1 mRNA及蛋白表达水平明显高于HEC-1A、HEC-1B细胞(P<0.001)。HEC-1A细胞中IGFBP-r P1 mRNA及蛋白表达量最低,Ishikawa细胞中表达量最高(P均<0.05)。结论:4种子宫内膜癌细胞系中均表达IGFBP-r P1。

MMP-9/TIMP-1在子宫内膜细胞中的多因素调节

目的 通过体外实验研究E2、MPA、HB -EGF对Ishikawa细胞中MMP - 9/TIMP - 1mRNA表达的调节,探讨其在胚胎种植中的意义。方法 体外培养Ishikawa细胞,分别加入E2、MPA、E2 +MPA、E2 +MPA +RU4 86、HB -EGF刺激4 8h后,采用原位杂交、RT -PCR测定各种条件下MMP - 9、TIMP - 1mRNA的表达。结果 雌、孕激素单独或联合作用均可以显著降低TIMP - 1mRNA的表达(P <0 .0 5 ) ,同时加RU4 86后TIMP - 1mRNA的下降趋势减弱。相反HB -EGF使TIMP - 1mRNA的表达增高(P <0 .0 5 )。Ishikawa细胞中MMP - 9mRNA均没有阳性表达。结论 (1)雌、孕激素对TIMP - 1mRNA具有下调作用,RU4 86可以抑制孕激素的作用。(2 )HB -EGF对TIMP - 1mRNA的表达具有上调作用。(3)MMP - 9mRNA在Ishikawa细胞中没有表达。

敲低ACTL8基因对子宫内膜癌细胞增殖与迁移的影响

目的探讨采用携带shRNA特异序列的载体转染子宫内膜癌细胞敲低肌动蛋白样蛋白8(ACTL8)基因对细胞增殖、侵袭迁移能力的影响及其机制。方法选取人子宫内膜癌Ishikawa细胞株进行实验研究,以携带shRNA特异序列的载体及空载质粒分别转染Ishikawa细胞株,形成敲低ACTL8基因的shACTL8组和以空载质粒转染的对照组。荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测两组细胞中ACTL8 mRNA表达,Western blot法检测两组细胞ACTL8蛋白表达,Transwell迁移和侵袭实验分析Ishikawa细胞侵袭和迁移能力,CCK8细胞增殖实验及平板克隆实验检测细胞的增殖情况,Western blot法检测两组细胞的E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、P21蛋白的表达情况。结果shACTL8组的ACTL8 mRNA、ACTL8蛋白相对表达强度均低于对照组(P<0.05);shACTL8组的Ishikawa细胞侵袭、迁移水平均低于对照组(P<0.05);在细胞培养后1天、2天、3天,shACTL8组的Ishikawa细胞数目测定OD值显著低于对照组(P<0.05);平板克隆实验培养3天,可见shACTL8组培养皿中细胞生长数目明显少于对照组(P<0.05);shACTL8组E-cadherin蛋白、P21蛋白表达强度高于对照组(P<0.05);shACTL8组N-cadherin蛋白、MMP-9蛋白表达强度低于对照组(P<0.05)。结论敲低ACTL8基因抑制子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖、迁移、侵袭。

小檗碱对与肿瘤相关巨噬细胞共培养的人子宫内膜癌Ishikawa细胞株的作用

目的研究小檗碱对与肿瘤相关巨噬细胞(TAM)共培养的人子宫内膜癌Ishikawa细胞的作用,以及对炎性因子白细胞介素-8(IL-8)和细胞核转录因子-κBp65(NF-κBp65)表达的影响。方法 MTT法检测小檗碱抑制人子宫内膜癌Ishikawa细胞株增殖的有效浓度和时间,以及小檗碱对与TAM共培养的人子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖的抑制率;ELISA法检测细胞培养上清液中IL-8的浓度变化;应用W estern印迹法检测经小檗碱干预该细胞48 h后,NF-кBp65的变化。结果小檗碱可显著抑制Ishikawa细胞生长,呈时间剂量依赖性。40 mg/L小檗碱也能够抑制与TAM共培养的人子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖。细胞培养上清液中IL-8的浓度随着干预时间延长而减少(P<0.01)。小檗碱作用48 h后,细胞中NF-кBp65表达明显下降(P<0.01)。结论小檗碱能够抑制与TAM共培养的人子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖,抑制细胞产生IL-8,并能够阻断NF-кB信号通路,从而抑制子宫内膜癌的转移。

白花蛇舌草黄酮和多糖对与肿瘤相关巨噬细胞共培养的人子宫内膜癌Ishikawa细胞的影响

目的研究白花蛇舌草黄酮和多糖对与肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macro-phages,TAMs)共培养的人子宫内膜癌Ishikawa细胞的作用。方法噻唑蓝比色法(MTS)检测白花蛇舌草黄酮及多糖对人子宫内膜癌Ishikawa细胞株的作用;酶联免疫吸附法(ELISA)测定最佳量效时间药物作用后细胞上清液中白介素-10(IL-10)水平;流式细胞仪检测TAMs特殊表型标志物的表达;蛋白印迹法(Western blot)检测共培养体系核转录分子-κB p65(NF-κB p65)的表达。结果白花蛇舌草多糖无抑制Ishikawa细胞增殖的作用(P>0.05)。白花蛇舌草黄酮可显著抑制Ishikawa细胞的增殖,抑制作用呈剂量依赖性,以800μg/mL抑制作用最佳(P<0.05),而24、48h比较,差异无统计学意义(P>0.05);并能降低细胞培养上清液中IL-10的水平(P<0.01)及下调TAMs细胞中NF-κB p65的表达(P<0.01)。结论白花蛇舌草抗人子宫内膜癌Ishikawa细胞作用主要依赖于白花蛇舌草黄酮,它能减少细胞产生IL-10和阻断细胞NF-κB p65信号通路的表达,从而抑制与TAMs共培养的Ishikawa细胞的增殖。

siRNA干扰的DKK1低表达对子宫内膜癌Ishikawa细胞侵袭、迁移的影响及机制研究

目的探讨DKK1 siRNA干扰的DKK1低表达对子宫内膜癌Ishikawa细胞侵袭、迁移能力的影响及作用机制。方法瞬时转染DKK1 siRNA至培养的子宫内膜癌Ishikawa细胞;应用实时定量PCR和蛋白免疫印迹方法分别检测转染前后细胞中DKK1的mRNA和蛋白表达;应用Transwell实验检测癌细胞侵袭、迁移能力。应用荧光显微镜观察转染前后Wnt/β-catenin信号通路中活性β-catenin、MMP14表达情况。结果转染DKK1 siRNA至Ishikawa细胞使细胞中DKK1基因表达水平降低21.00%(t=3.05,P<0.05),DKK1蛋白表达降低39.35%(t=40.97,P<0.01)。侵袭实验中DKK1 RNAi组的细胞均数140.8±4.733,高于空白对照组的细胞均数123.7±6.700,癌细胞的侵袭能力增强13.82%。迁移实验中DKK1 RNAi组细胞均数(152.0±3.528)高于空白对照组(130.6±4.061),癌细胞的迁移能力增强16.39%。DKK1 siRNA处理后,细胞中活性β-catenin、MMP14荧光增强,提示表达水平上升。结论 DKK1具有抑制子宫内膜癌Ishikawa细胞侵袭、迁移的作用。Wnt/β-catenin信号通路参与了DKK1这一作用过程。DKK1不失为抑制子宫内膜癌转移的有效治疗靶点。

Tie2-siRNA表达载体对子宫内膜癌Ishikawa细胞株生物学行为的影响

目的探讨Tie2-siRNA表达载体对子宫内膜癌Ishikawa细胞株生物学行为的影响。方法将表达Tie2-siRNA的碱基片段插入含有巨细胞病毒启动子、新霉素抗性基因及绿色荧光蛋白报告基因的质粒中,应用脂质体包涵体技术将质粒转染入子宫内膜癌Ishikawa细胞株,以减少Tie2基因的表达,并采用逆转录PCR及Western blot方法鉴定。用MTT实验描绘各组细胞增殖曲线,流式细胞术检测各组细胞凋亡率。结果成功转染后Tie2基因的mRNA转录水平及蛋白表达水平抑制率分别为75.5%及56.4%,Ishikawa细胞增殖72-h抑制率为73.9%,凋亡率为35.9%。结论体外下调Tie2基因的转录及表达可抑制肿瘤生长,促进细胞凋亡。

高、低浓度金雀异黄素对Ishikawa细胞生长及ERα/ERβ蛋白比值的影响

目的研究高、低浓度金雀异黄素对雌激素受体(ER)阳性人子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖、集落形成及ERα/ERβ蛋白表达比值影响的差异。方法以ER阳性人子宫内膜癌Ishikawa细胞为研究对象,正式实验前用Opti-MEM无酚红减血清培养基培养24 h,然后分为金雀异黄素低浓度组、高浓度组及溶剂对照组,依次加入由2%DCS-FBS的Opti-MEM无酚红减血清培养基配置所需浓度的金雀异黄素药液及含0. 5‰DMSO的培养液。应用CCK-8法检测高浓度(10、25、50μmoL/L)和低浓度(0. 001、0. 01、0. 1、1μmoL/L)的金雀异黄素干预Ishikawa细胞24、48、72 h对增殖的影响。平板集落形成实验检测高浓度(25、50μmoL/L)和低浓度(0. 01、0. 1μmoL/L)金雀异黄素干预1周对集落形成的影响。用Western blot法检测高浓度(25、50μmoL/L)和低浓度(0. 01、0. 1μmoL/L)金雀异黄素干预48 h后对ERα/ERβ蛋白表达比值的影响。结果低浓度(0. 001、0. 01、0. 1μmoL/L)范围内金雀异黄素促进Ishikawa细胞增殖,在干预48 h后最明显,0. 1μmoL/L浓度促增殖作用达到最强(P <0. 01);高浓度时(10、25、50μmoL/L)抑制细胞增殖(P <0. 05),且呈时间和浓度的依赖性,50μmoL/L浓度下干预72 h后抑制作用达到最强(P <0. 01)。低浓度金雀异黄素的集落形成率分别为14. 60%和15. 13%,和溶剂对照组(12. 20%)相比有统计学差异(P<0. 05);高浓度集落形成率分别为6. 07%、4. 27%,显著低于溶剂对照组(P <0. 01)。高浓度和低浓度下ERα蛋白表达均上调,且在0. 1μmoL/L时达到最高; ERβ蛋白表达均下降,在25、50μmoL/L时达到最低; ERα/ERβ蛋白比值均明显上调,在0. 1μmoL/L时达到最高。结论低浓度金雀异黄素具有促ER阳性Ishikawa细胞生长的作用,可能通过上调ERα/ERβ蛋白表达比值实现;高浓度金雀异黄素虽然也可以上调ERα/ERβ蛋白表达比值,但可能存在其他非ER依赖机制主导发挥抑制Ishikawa细胞生长的作用。

人子宫内膜癌裸鼠皮下移植瘤模型的改良

目的探讨通过Matrigel与高浓度Ishikawa肿瘤细胞混合接种的方法优化改良人子宫内膜癌裸鼠皮下移植瘤模型的可行性。方法培养Ishikawa人子宫内膜癌细胞系,制备高浓度肿瘤细胞与Matrigel等体积悬液,裸鼠右侧肩胛部皮下注射。观察接种后裸鼠的存活状况及成瘤情况。石蜡包埋肿瘤组织切片,HE染色观察肿瘤组织病理学特征。结果 10只裸鼠均成功建立肿瘤模型,建模成功率100%。接种28 d内出现1例裸鼠瘤体破溃,9只裸鼠均存活,移植瘤瘤体表面皮肤完整。肿瘤最长径可达15. 1~17. 9 mm,瘤重0. 83~1. 59 g。所有移植瘤组织经病理学证实均符合人子宫内膜癌的特点。结论采用将高浓度Ishikawa细胞与Matrigel混悬法可在短时间内成功构建人子宫内膜癌裸鼠皮下移植瘤模型,且移植瘤组织和细胞保留了人子宫内膜癌的病理特征,适用于实验研究的开展。