刚地弓形虫对HUVEC、Vero和J774A.1、THP-1侵入的比较研究*

目的探讨刚地弓形虫对不同类型传代细胞的侵入能力和致凋亡作用及其差异。方法实验中采用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、非洲绿猴肾成纤维细胞(Vero)、小鼠单核巨噬样细胞(J774A.1)和人单核细胞系(THP-1)细胞株。采用透射电镜和吉姆萨染色法,观察刚地弓形虫RH株侵入以上细胞的能力以及细胞骨架抑制剂秋水仙素、细胞松弛素D对其影响。用流式细胞术检测弓形虫引起的细胞凋亡。结果弓形虫RH株能侵入以上4种细胞,在胞内均有纳虫泡形成。其侵入率以J774A.1和THP-1略高。细胞骨架抑制剂细胞松弛素D可以明显降低速殖子对THP-1和J774A.1细胞的侵入率,对速殖子侵入HUVEC和Vero细胞的能力影响较小。弓形虫侵入HUVEC和J774A.1细胞均可不同程度地引起细胞凋亡和坏死,但前者以凋亡为主,后者以坏死为主。结论弓形虫可能通过不同的机制侵入非吞噬性细胞和吞噬性细胞。

问号钩端螺旋体诱导J774A．1细胞FasL／Fas表达上调及FasL／Fas相关细胞凋亡的研究

目的:了解FasL/Fas途径参与问号钩端螺旋体(简称钩体)诱导细胞凋亡及其FasL/Fas表达水平变化。方法:建立问号钩体黄疸出血群赖型56601株感染小鼠单核-巨噬细胞J774A.1模型。采用DAPI染色法观察问号钩体56601株感染细胞凋亡的形态学特征,流式细胞术定量检测感染细胞的凋亡率及FasL中和抗体对细胞凋亡的阻断作用。PE标记抗小鼠FasL或Fas单克隆抗体染色法,观察问号钩体56601株感染细胞FasL/Fas表达情况。采用流式细胞术定量检测感染细胞的FasL/Fas表达水平。结果:问号钩体56601株感染J774A.1细胞4h时,部分细胞出现染色质浓缩及边缘化现象;感染24h时上述病变现象更加明显且有部分细胞核裂解。问号钩体56601株感染J774A.1细胞4h和24h的凋亡率分别为53.6%和64.31%。FasL中和抗体预处理细胞后,问号钩体56601株感染细胞4h或24h的凋亡率分别为10.27%和15.90%。J774A.1细胞被问号钩体56601株感染后4和24h,FasL表达率分别从感染前的4.19%上升至21.69%和65.70%,Fas表达率分别从感染前的12.88%上升至91.96%和88.01%。结论:诱导细胞凋亡是问号钩体56601株损伤J774A.1细胞的重要机制。问号钩体可上调靶细胞FasL/Fas表达水平,并通过FasL/Fas途径诱导J774A.1细胞凋亡。

低剂量X射线照射对J774A.1细胞IL-12和p38MAPK表达的影响

通过检测低剂量辐射 (LDR)对J774A .1细胞株中白细胞介素 12 (IL - 12 )及 p38丝裂原活化蛋白激酶 (p38MAPK)的影响 ,以研究LDR辐射免疫效应的机制。分别采用流式细胞术和ELISA检测了p38MAPK、IL - 12蛋白水平的变化。结果表明 ,75mGyX射线照射后 ,J774A .1细胞分泌IL - 12量在照射后 2、4、8h升高 (p <0 .0 5 ) ,随后即开始下降至恢复假照射水平 ;而 p38MAPK也于照射后 2h出现升高 ,两者在发生时间上呈现一致性。结果显示LDR引起IL - 12表达增加 ,而p38MAPK传导通路可能在其中发挥作用 ,为低剂量辐射增强细胞免疫功能提供了实验依据。

问号钩端螺旋体诱导的Vero和J774A.1细胞的凋亡和超微结构病变

目的 :探讨不同毒力的钩体黏附和侵入宿主细胞能力及其病理变化。方法 :建立 Fontana镀银染色法用于观察问号钩体黄疸出血群赖型 5 6 6 0 1株、波摩那群波摩那型 5 6 6 0 8株和双曲钩体三堡隆群 patoc型 Patoc 株黏附 Vero和 J774 A.1细胞的能力 ;采用电镜技术观察感染细胞的超微结构病变 ;采用 FITC- Annexin V/PI荧光标记流式细胞术 ,检测紫外线灭活前后的上述钩体菌株诱导 Vero和 J774 A.1细胞凋亡或坏死的情况。结果 :问号钩体 5 6 6 0 1和 5 6 6 0 8株对 Vero细胞的黏附率分别为 2 4 .2 %和 2 2 .9% (P>0 .0 5 ) ;对 J774 A.1细胞的黏附率分别为4 9.0 %和 4 6 .9% (P>0 .0 5 ) ;双曲钩体 Patoc 株不能黏附细胞。两株问号钩体侵入细胞后形成含有钩体的特殊吞噬泡 ,并引起相似的细胞超微结构病变 ,如细胞核染色质浓缩或溶解、细胞空泡变性、线粒体肿胀及线粒体嵴消失、内质网肿胀和膜旁核糖体消失等。灭活前的 5 6 6 0 1和 5 6 6 0 8株引起的 Vero细胞凋亡率分别为 84 .4 %和 82 .8% ,灭活后则分别为 77.9%和 86 .1%。灭活前后的 5 6 6 0 1株均以诱导 Vero细胞晚期凋亡为主 ,其凋亡率分别 6 8.0 %和5 2 .9%。灭活前后的 5 6 6 0 8株均以诱导 Vero细胞早期凋亡为主 ,其凋亡率分别为 6 4.1%和 5 0 .1%

左归降糖舒心方含药血浆调控NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路抑制ox-LDL诱导J774A.1巨噬细胞焦亡的机制

目的基于NOD样受体蛋白3(NLRP3)/半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1(Caspase-1)/Gasdermin D(GSDMD)通路探讨左归降糖舒心方含药血浆对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导J774A.1巨噬细胞焦亡的调控机制。方法将分化完全的J774A.1巨噬细胞分为空白血浆组、模型组、左归降糖舒心方含药血浆组、MCC950(NLRP3特异性抑制剂)组,每组6个复孔。除空白血浆组外,其余各组以100 mg·L^(-1)ox-LDL诱导细胞,构建细胞焦亡模型。空白血浆组、模型组、MCC950(50μmol·L^(-1))组以含10%空白血浆进行培养,左归降糖舒心方含药血浆组用10%含药血浆培养细胞24 h。采用CCK-8法测定各组细胞增殖情况,计算细胞增殖抑制率;采用LDH释放实验检测细胞膜完整性及细胞焦亡水平;采用ELISA法及免疫荧光法检测细胞白细胞介素(IL)1β、IL-18含量及蛋白表达情况;采用Western Blot法检测NLRP3、Caspase-1及GSDMD蛋白表达。结果与空白血浆组比较,模型组细胞的IL-18、IL-1β含量及LDH释放率明显增高(P<0.01),IL-1β、IL-18及NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表达明显上调(P<0.01)。与模型组比较,左归降糖舒心方含药血浆组细胞的IL-18、IL-1β含量及LDH释放率明显下降(P<0.01),IL-1β、IL-18及NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表达明显下调(P<0.01)。结论左归降糖舒心方含药血浆能够抑制ox-LDL诱导的J774A.1巨噬细胞焦亡状态及炎性反应,其作用机制可能与调控NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路,下调细胞炎性因子IL-18、IL-1β表达有关。

白及醇提物对PM_(2.5)诱导J774a.1细胞损伤的保护作用

目的:研究白及醇提物对PM_(2.5)所致J774a.1细胞损伤的保护作用,并探讨其作用机制。方法:采用MTS检测不同浓度PM_(2.5)(0、25、50、100、200、400μg/mL)和不同浓度白及醇提物(0、1.25、2.5、5、10、20μg/mL)对J774a.1细胞活力的影响,确定合适的造模浓度和给药浓度。以PM2.5诱导J774a.1细胞损伤,将细胞分为空白对照组、模型组及白及醇提物组物低、中、高浓度组,采用DCFH-DA荧光探针检测活性氧水平;NO试剂盒检测NO的表达量;实时荧光定量PCR法测定促炎介质iNOS、IL-18 mRNA水平;流式细胞术检测炎症因子TNF-α、IL-6水平;Western blot检测TLR4、COX2蛋白表达及NF-κBp65蛋白磷酸化水平。结果:PM_(2.5)浓度为200μg/mL,白及醇提物浓度为5~20μg/mL时,未见明显细胞毒性。与模型组比较,各浓度白及醇提物均可显著降低细胞上清中NO、IL-6、TNF-α释放量及细胞内活性氧水平(P<0.01),5、10μg/mL白及醇提物可显著抑制细胞中iNOS、IL-18 mRNA表达(P<0.05或P<0.01),低浓度白及醇提物可显著抑制胞内TLR4、COX2蛋白表达及NF-κBp65蛋白的磷酸化(P<0.05或P<0.01)。结论:白及醇提物对PM_(2.5)染毒J774a.1细胞损伤有显著的保护作用,其作用机制可能与TLR4/NF-κB通路相关,通过减轻细胞炎症损伤及氧化应激发挥药效。

巨噬细胞J774A.1外泌体促进结直肠癌细胞系MC38和CT26的增殖和迁移

目的探讨巨噬细胞J774A.1分泌的外泌体对小鼠结直肠癌细胞系MC38和CT26增殖和迁移的影响及作用机制。方法应用流式细胞术对J774A.1细胞进行表型鉴定;应用透射电镜、纳米颗粒跟踪分析(NTA)和Western blot分别检测J774A.1细胞外泌体的形态特征、大小和表面标志物;荧光显微镜下观察MC38和CT26细胞对外泌体的摄取情况;应用CCK8法检测外泌体对MC38和CT26细胞增殖作用的影响;细胞划痕实验检测MC38和CT26细胞的迁移能力;Western blot检测增殖相关通路的磷酸化蛋白p-MEK1/2和p-ERK1/2的表达变化。结果J774A.1细胞为表达细胞表面标志分子CD68和CD206的M2型巨噬细胞。J774A.1细胞的外泌体均能被结直肠癌细胞MC38和CT26摄取,而且能够促进它们增殖(P<0.05)、迁移及MEK-ERK信号通路激活。结论巨噬细胞J774A.1的外泌体能够促进结直肠癌细胞系MC38和CT26的增殖及迁移,这可能与MEK-ERK信号通路的磷酸化增加有关。

脂肪间充质干细胞对J774.1细胞的免疫调控

背景:近期研究发现脂肪间充质干细胞针对T细胞、B细胞和树突状细胞均有抑制免疫反应的能力,但对于其是否可以对巨噬细胞起到相应的免疫调控能力还不清楚。目的:观察脂肪间充质干细胞与J774.1细胞共培养后白细胞介素6和肿瘤坏死因子α的表达。方法:将脂肪间充质干细胞按照2×107/孔分别接种于transwell的上层小室和24孔板中,再利用含1 mg/L脂多糖的培养液重悬J774.1细胞,将J774.1细胞接种到含脂肪间充质干细胞的transwell下层小室和24孔板中,同时设立未激活J774.1细胞阴性对照组和脂多糖激活J774.1阳性对照组。培养48 h收集细胞样,提取RNA样本,荧光定量PCR法检测白细胞介素6、肿瘤坏死因子αmRNA水平。结果与结论:相对于单纯脂多糖激活的阳性对照组J774.1细胞,脂肪间充质干细胞与J774.1细胞的接触型混合培养可以明显降低J774.1细胞的白细胞介素6和肿瘤坏死因子α的表达量,而非接触共培养组中,只有白细胞介素6 mRNA水平发生了明显的降低。以上结果表明脂肪间充质干细胞具有抑制脂多糖激活J774.1细胞的免疫反应的能力。

二仙丸加减方含药血清抑制巨噬细胞焦亡的物质基础和作用机制

背景:课题组前期研究发现二仙丸加减方可以缓解胶原诱导性关节炎大鼠炎症反应,但其作用机制尚需进一步验证。目的:分析二仙丸加减方入血成分,观察二仙丸加减方含药血清对J774A.1巨噬细胞焦亡的影响。方法:①二仙丸加减方入血成分分析:采用超高效液相色谱-高分辨质谱(UHPLC-HRMS)对二仙丸加减方及入血成分进行检测和鉴定。②二仙丸加减方含药血清对J774A.1巨噬细胞焦亡的影响:采用分子对接技术对二仙丸加减方入血成分倍半萜类化合物与NLRP3进行初步验证。将J774A.1巨噬细胞随机分为空白对照组、脂多糖+三磷酸腺苷组及脂多糖+三磷酸腺苷+二仙丸加减方含药血清低(2.5%)、中(5%)、高(10%)剂量组。根据试剂盒说明书检测各组细胞上清液中乳酸脱氢酶释放情况;ELISA检测各组细胞上清液中白细胞介素1β、白细胞介素18水平;Hoechst/PI染色法检测各组细胞膜受损情况;Western blot检测各组细胞中NLRP3、Caspase-1、GSDMD及GSDMD-N蛋白表达水平。结果与结论:①共鉴定出二仙丸加减方药效成分32个,入血成分21个,其中入血成分主要包括多种倍半萜类化合物;②分子对接结果显示3-O-Acetyl-13-deoxyphomenone、Incensol oxide、Atractylenolide Ⅲ、Rupestonic acid、3,7-Dihydroxy-9,11-eremophiladien-8-one与NLRP3之间结合活性较好;③与空白对照组相比,脂多糖+三磷酸腺苷组细胞上清中乳酸脱氢酶活性及白细胞介素1β、白细胞介素18水平均显著升高(P<0.001),Hoechst/PI染色可见PI阳性细胞数量显著增加。脂多糖+三磷酸腺苷+二仙丸加减方含药血清各组上述指标均显示不同程度降低;④与空白对照组相比,脂多糖+三磷酸腺苷组NLRP3、Caspase-1、GSDMD及GSDMD-N蛋白表达显著升高(P<0.05);与脂多糖+三磷酸腺苷组相比,脂多糖+三磷酸腺苷+二仙丸加减方含药血清各组细胞中NLRP3、Caspase-1、GSDMD及GSDMD-N蛋白表达均有不同程度降低(P<0.05),且具有一定的剂量依赖性。结果表明:二仙丸加减方含药血清可能通过调控NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路抑制J774A.1巨噬细胞焦亡。

Essential Gene(s) Targeted by Peptide Nucleic Acids Kills <i>Mycobacterium smegmatis</i>in Culture and in Infected Macrophages

Background: Antisense peptide nucleic acids (PNAs) exhibit growth inhibitory effects on bacteria by inhibiting the expression of essential genes and could be promising therapeutic agents for treating bacterial infections. A study was carried out to determine the efficacy of several antisense PNAs in inhibiting extracellular and intracellular growth of Mycobacterium smegmatis. Methods: Six PNAs obtained from a commercial supplier were tested to evaluate the inhibitory effect on bacterial growth by inhibiting the expression of the following essential genes: inhA (a fatty acid elongase), rpsL (ribosomal S12 protein), gyrA (DNA gyrase), pncA (pyrazinamidase), polA (DNA polymerase I) and rpoC (RNA polymerase β subunit) of M. smegmatis. Each PNA was tested at 20 μM, 10 μM, 5 μM and 2.5 μM concentrations to determine whether they caused a dose dependent killing of M. smegmatis cultured in Middlebrook 7H9 broth or in a J774A.1 murine macrophage cell line. Results: In Middlebrook broth, the strong growth inhibitory effect against M. smegmatis was observed by PNAs targeting the inhA and rpsL genes at all four concentrations. The PNAs targeting the pncA, polA and rpoC genes were found to exhibit strong growth inhibition against M. smegmatis but only at 20 μM concentration. No growth inhibition of M. smegmatis was seen in pure culture when treated with PNAs targeting gyrA and a mismatch PNA targeting dnaG (DNA primase). All six PNAs showed killing of M. smegmatis in J774A.1 macrophage cell line that were statistically significant (p < 0.05). Conclusion: It may be concluded from this study that PNAs could be potential therapeutics for mycobacterial infections.

A549细胞对单硬脂酸甘油酯固体脂质纳米粒的摄取作用

目的 考察单硬脂酸甘油酯固体脂质纳米粒 (monostearinsolidlipidnanoparticles ,MSLN)经PEG2 0 0 0修饰后 ,对A5 4 9细胞摄取MSLN及J774A1细胞吞噬MSLN的影响。方法 采用溶剂扩散法制备MSLN ,测定其粒径和zeta电位 ;以罗丹明B(RhodamineB)为荧光标记物 ,研究A5 4 9细胞对MSLN的摄取作用和J774A1细胞对MSLN的吞噬作用。结果 MSLN的细胞毒性较低 ,A5 4 9细胞对MSLN的摄取可快速接近饱和 ,其摄取百分率与MSLN在细胞外的浓度呈负相关。结论 MSLN经PEG2 0 0 0修饰 ,可显著抑制J774A1细胞对MSLN的吞噬 ,但可增加A5 4 9细胞对MSLN的摄取。

不同剂量X射线照射对小鼠巨噬细胞表达CD80和CD86的影响

采用免疫组织化学法观察了X射线全身照射对小鼠腹腔巨噬细胞及体外照射对培养的小鼠巨噬细胞株J774A .1细胞表达CD80和CD86的影响。结果表明 ;全身照射和体外照射时 2GyX射线诱导CD80表达增高均较 0 .0 75Gy为早 ,而CD86对两种剂量的反应无明显区别。剂量效应关系的研究表明 ,CD80和CD86的表达无论全身照射或体外照射时均在 0 .0 75Gy剂量点出现峰值 ,而在较大剂量照射时出现第二个峰值的剂量则全身照射高于体外照射。实验结果显示 。

辐射对EL-4、J774A.1细胞CD2、CD48表达的影响

目的 通过时程及量效研究观察不同剂量X射线照射对EL 4和J774A 1细胞株中表面分子CD2、CD4 8的影响。方法 采用荧光免疫流式细胞术检测蛋白表达的变化。结果 (1)EL 4细胞CD2分子表达结果显示 ,0 0 75GyX射线照射后CD2合成在照射后 4h即开始升高 ,至 8～ 16h达峰值 (P <0 0 5～ 0 0 1) ,2Gy照射后则从照射后 4h开始下降 ,至 8h达最低点 (P <0 0 1) ,一直持续较低至 4 8h恢复 ;8h量效结果显示 ,在低剂量区 0 0 5 0 ,0 0 75Gy使CD2表达上调 ,而高剂量范围中 1,2Gy使CD2表达下调。 (2 )J774A 1细胞CD4 8分子表达结果显示 ,0 0 75GyX射线照射后CD4 8合成在照射后 2h即开始升高 ,至 4h达峰值 (P <0 0 5 ) ,随后急剧下降 ,8h恢复至假照射水平 ,16～4 8h下降明显低于假照射水平 (P <0 0 5 ) ,2Gy照射后则从照射后 2h开始下降 ,至 8h达最低点(P <0 0 1) ,随后有所恢复 ,但直至 4 8h仍未能恢复至假照射水平。 4h量效结果显示 ,在低剂量区0 0 5 0 ,0 0 75 ,0 10 0Gy使CD4 8表达上调 ,而高剂量范围中 1～ 6Gy均使CD4 8表达下调 (P <0 0 5～0 0 1)。结论 X射线照射可引起CD2、CD4 8不同的辐射效应 ,两者的相互作用体现出低剂量辐射具有不同于高剂量辐射的兴奋效应。

问号钩端螺旋体磷脂酶C的活性及其内化时细胞内游离Ca^(2+)水平的变化

目的 :了解不同毒力的钩端螺旋体 (简称钩体 )对细胞内游离 Ca2 + 水平的影响及其磷脂酶 C(PL C)活性与细胞内游离 Ca2 + 水平的关系。方法 :建立问号钩体 Vero和 J774 A.1细胞感染模型。采用 fluo- 3/ AM胞内 Ca2 +特异荧光标记激光共聚焦技术 ,检测强毒力的问号钩体黄疸出血群赖型 5 6 6 0 1株和弱毒力的波摩那群波摩那型5 6 6 0 8株及无毒力的双曲钩体 Patoc 株作用的 Vero和 J774 A.1细胞胞内游离 Ca2 +水平。以 [3 H]PIP2 为底物 ,采用同位素法检测上述 3株钩体培养物上清、胞浆和胞膜中 PLC的活性。结果 :正常 Vero和 J774 A.1细胞胞内游离Ca2 + 基础值分别为 (10 2 .3± 8.2 ) %和 (10 5 .9± 7.3) % ,在观察时间内 Patoc 株钩体作用细胞的荧光强度变化百分数一直波动于 (10 2 .3± 8.2 ) %～ (10 2 .2± 8.3) %。问号钩体 5 6 6 0 1株感染的 Vero和 J774 A.1细胞胞内游离Ca2 +浓度呈双峰型增高 ,第一峰荧光强度变化百分数分别为 (430 .5± 35 .7) %和 (74 7.5± 18.5 ) % ,第二峰荧光强度变化百分数分别为 (380 .6± 17.4 ) %和 (80 4 .6± 2 2 .4 ) %。问号钩体 5 6 6 0 8株感染 Vero和 J774 A.1细胞 ,其胞内游离 Ca2 +浓度均呈缓慢的单一坡型升高 ,其最大荧光强度变化百分数分别为 (2 35 .

党参对鼠J774巨噬细胞吞噬活性的增强效应

验证党参对机体免疫功能的增强效应并探索其作用机理。方法 :用党参水提液加入鼠 J774巨噬细胞培养液中作微量细胞培养 ,以自动微量荧光分析仪直接检测其对细胞吞噬活性的影响。结果 :显示党参水提液对巨噬细胞的吞噬活性有明显的增强作用 ,在浓度 5 0 0～ 3 0 0 0 μg/m l时 ,与无药对照组 ( O)比较都有显著性差异 ( P<0 .0 5 ) ,分别增强 1.3 3～ 1.70倍。结论 :巨噬细胞是重要的免疫活性细胞之一 ,对机体免疫反应的各个环节都起关键性作用 ,党参能增强机体免疫的效应 ,可能是通过其增强巨噬细胞的免疫活性而实现的。

左归降糖舒心方含药血浆对ox-LDL诱导J774A.1巨噬细胞焦亡及凋亡的影响

目的研究左归降糖舒心方含药血浆对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导巨噬细胞焦亡及凋亡状态的影响,探讨该方治疗糖尿病动脉粥样硬化斑块的新靶点。方法 SD大鼠随机分成3组,连续5 d灌胃相应的药物制备含药血浆:空白组(灭菌超纯水)、左归降糖舒心方组(25.92 g/kg)、西药联合用药组(二甲双胍0.83 g/kg+阿托伐他汀钙12.45 mg/kg)。应用ox-LDL诱导细胞焦亡及凋亡状态。通过CCK-8法比较各组J774A.1细胞增殖情况,计算细胞存活率,筛选含药血浆及ox-LDL干预浓度。将分化完全的J774A.1巨噬细胞随机分为空白血浆组、模型组、左归降糖舒心方含药血浆组、西药联合含药血浆组,每组6个复孔。诱导及给药24 h后,LDH释放实验检测细胞膜完整性及细胞焦亡水平;流式细胞仪检测细胞凋亡率;Western blot法检测焦亡相关蛋白NOD样受体蛋白3(NLRP3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1(Caspase-1)、gasdermin D(GSDMD)蛋白、凋亡相关蛋白半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)及B细胞白血病淋巴瘤相关蛋白基因(Bax)蛋白的表达水平。结果含药血浆及空白血浆在浓度为10%水平对细胞增殖无明显抑制作用,作为含药血浆实验干预浓度。ox-LDL在100 mg/L浓度下,可明显降低细胞存活率,故考虑以100 mg/L ox-LDL为诱导细胞焦亡及凋亡的造模浓度。与空白组比较,模型组细胞存活率明显降低,LDH释放率增高(P<0.01);同时细胞凋亡明显增多(P<0.01);模型组在ox-LDL诱导下,细胞焦亡相关蛋白NLRP3、Caspase-1、GSDMD表达上调,促进凋亡相关因子Caspase-3及Bax表达增强(P<0.01)。与模型组比较,左归降糖舒心方含药血浆组细胞存活率增高,LDH释放率及细胞凋亡率明显降低(P<0.01);左归降糖舒心方含药血浆可显著抑制ox-LDL所致的NLRP3、Caspase-1、GSDMD、Caspase-3及Bax表达水平上调(P<0.01)。而且,左归降糖舒心方含药血浆组阻断ox-LDL引起的焦亡过程细胞膜破坏及凋亡的作用效应优于西药联合含药血浆组(P<0.01)。结论在体外左归降糖舒心方含药血浆可有效维持巨噬细胞正常功能状态,其作用机制可能与调控NLRP3、Caspase-1、GSDMD、Caspase-3及Bax表达,抑制细胞内焦亡及凋亡过程有关。

左归降糖舒心方含药血浆对ox-LDL诱导小鼠巨噬细胞泡沫化和凋亡的影响

目的探讨左归降糖舒心方含药血浆对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导巨噬细胞泡沫化和凋亡的影响及其作用机制。方法将巨噬细胞J774A.1随机分为正常组、模型组、牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)组、左归降糖舒心方含药血浆组、西药联合含药血浆组,每组5个复孔。除正常组外其余各组以ox-LDL(100 mg/L)处理构建巨噬细胞泡沫化模型。正常组和模型组正常培养,其余各组分别用10%相应含药血浆培养24 h。CCK-8法比较各组J774A.1细胞增殖情况,计算细胞抑制率;油红O染色检测细胞内脂质蓄积水平;Western blot检测双链RNA样内质网激酶(PEPK)、活化转录因子4(ATF4)、真核翻译起始因子2α(eIF2α)、C/EBP环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白(CHOP)及半胱氨酸蛋白酶蛋白-12(Caspase-12)的表达水平。结果与正常组比较,模型组细胞抑制率增高,在ox-LDL浓度为100 mg/L时细胞抑制率为(50.06±0.09)%,有明显的脂质颗粒蓄积(P<0.01)。与模型组比较,各药物干预组细胞抑制率降低,可有效阻断ox-LDL的摄入及脂质堆积,其中左归降糖舒心方含药血浆组优于西药联合含药血浆组,与TUDCA组作用效应相当。ox-LDL可诱导细胞内质网应激相关蛋白p-PERK、p-eIF2α、ATF4、CHOP与Caspase-12表达上调。左归降糖舒心方含药血浆可显著抑制100 mg/L ox-LDL所致的p-PERK、p-eIF2α、ATF4的上调,降低内质网相关凋亡蛋白CHOP与Caspase-12的表达(P<0.01),和TUDCA组作用相当(P>0.05),其效果较西药联合含药血浆组明显(P<0.01)。结论左归降糖舒心方含药血浆能有效改善ox-LDL诱导的巨噬细胞泡沫化、细胞凋亡及内质网应激状态,其作用机制可能与调控内质网应激信号通路PERK/eIF2α/ATF4通路,降低细胞内CHOP与Caspase-12表达有关。

炭疽致死毒素中和试验检验标准

提出了一种毒素中和试验的操作细节标准。此实验室试验，测量含炭疽致死毒素抗体抗血清的特异性保护J774A．1细胞抗炭疽芽胞杆菌致死毒素的细胞毒性作用的能力，其比色试验建立在活细胞降解MTT的基础上，用炭疽吸附疫苗(AVA)制备的人和家兔抗血清验证这个试验结果。试验结果显示高水平的重复性和复现性。

基于TLR4/MyD88/NF-κB信号通路介导的巨噬细胞焦亡探讨黄芩黄连药对治疗动脉粥样硬化的作用机制

目的:基于Toll样受体4(TLR4)/髓样分化因子88(MyD88)/核因子κB(NF-κB)信号通路介导的巨噬细胞焦亡探讨黄芩黄连药对(芩连药对)治疗动脉粥样硬化(AS)的作用机制。方法:体外培养J774A.1细胞,SD大鼠灌胃芩连药对后制备含药血清,MTT法筛选芩连药对含药血清最佳干预浓度。采用不同浓度的含药血清预处理J774A.1细胞后,给予脂多糖(LPS)+三磷酸腺苷(ATP)诱导焦亡。光学显微镜下观察细胞形态变化,MTT法检测细胞活力,乳酸脱氢酶(LDH)释放法及Hoechst 33342/碘化丙锭(PI)染色用于检测细胞的损伤情况,酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定细胞上清液中白细胞介素(IL)-1β、IL-18的水平。Western Blot法检测通路及焦亡相关蛋白TLR4、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65、NLRP3、ASC、Caspase-1、Cleave-Caspase-1、GSDMD、GSDMD-NT的表达。TLR4基因过表达后,检测通路相关蛋白表达水平及细胞焦亡情况。结果:芩连药对含药血清可改善造模后J774A.1的形态;提高造模后J774A.1细胞的活力、降低LDH释放率及PI细胞阳性率(P<0.05);降低细胞上清液中IL-1β及IL-18的水平(P<0.05);显著下调TLR4/MyD88/NF-κB信号通路及焦亡相关蛋白的表达(P<0.05);同时过表达TLR4可逆转芩连药对对J774A.1细胞焦亡的保护作用(P<0.05)。结论:芩连药对可通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路降低巨噬细胞焦亡水平,从而发挥抗AS的作用。