4′-甲醚-黄芩素诱导绒毛膜癌JAR细胞凋亡的实验研究

目的探讨4′-甲醚-黄芩素(4-MS)对人绒毛膜癌JAR细胞的增殖抑制作用及诱导凋亡的相关机制。方法应用MTT法、激光共聚焦扫描显微镜、流式细胞术和实时定量PCR法,体外观察4-MS对JAR细胞的影响。结果不同质量浓度(10、20、40mg/L)的4-MS对JAR细胞均有增殖抑制作用,呈剂量依赖,作用72h后其增殖抑制率分别为(14.14±0.75)%、(34.34±2.99)%、(61.11±2.99)%(P<0.01);4-MS作用72h后细胞内Ca2+浓度分别为81.3±6.7、103.3±5.9、120.7±11.0,与对照组相比差异有显著性(P<0.05)。40mg/L4-MS作用12、24、36h后其早期凋亡率分别为(2.36±0.19)%、(4.22±2.44)%、(7.34±0.56)%,明显高于对照组(P<0.01)。20、40mg/L4-MS作用48h后hTERT mRNA的表达量为0.05±0.01和0.02±0.01,明显低于对照组(P<0.01)。结论4-MS能抑制人绒毛膜癌JAR细胞的增殖,诱导凋亡,其机制与提高细胞内Ca2+浓度、降低hTERT mRNA的表达有关。

4’-甲醚-黄芩素对绒毛膜癌JAR细胞c-myc表达的影响

目的探讨4’-甲醚-黄芩素(4-MS)诱导人绒毛膜癌JAR细胞凋亡的分子机制。方法应用透射电镜、流式细胞术、实时定量PCR法和Western blotting方法,体外观察4-MS对JAR细胞的影响。结果电镜下可见用药后JAR细胞凋亡的形态学改变;流式细胞术显示,随着作用时间和药物剂量的增加,早期凋亡细胞和坏死细胞增加,明显高于对照组(P<0.01)。20、40 mg.L-1 4-MS作用48 h后c-myc mRNA的表达量为0.87±0.12和0.45±0.08;c-myc蛋白的表达量是0.37±0.02和0.25±0.02,均低于对照组(P<0.01)。结论 4-MS诱导JAR细胞凋亡,其机制与降低c-myc的表达有关。

ApoE基因型对JAR细胞系芳香化酶mRNA转录的影响

载脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)和雌激素之间的相互作用机理被认为与阿尔兹海默氏病(Alzheimer’s disease,AD)的病理过程密切相关.芳香化酶是体内雌二醇合成的限速酶.为了检测ApoE不同亚型对芳香化酶表达的影响,在JAR细胞系中转染不同ApoE基因型的质粒,在转染效率没有差异的情况下,利用RT-PCR技术检测芳香化酶的表达情况,结果发现E2组的芳香化酶mRNA表达(118.37±26.46%)显著高于E3(95.25±23.21%)和E4(92.20±14.69%)组(p<0.05),而E3组和E4组之间没有显著差异(p=0.771).该结果提示不同亚型的ApoE可能通过调节芳香化酶的表达来影响雌激素的分泌,从而参与AD的发病机制.

阴离子交换蛋白2在人正常绒毛细胞和绒癌JAR细胞中的差异表达

目的探讨阴离子交换蛋白2在人正常绒毛细胞和绒癌JAR细胞中的表达差异,以及该通道蛋白的表达改变与绒癌发生的关系。方法人正常绒毛滋养细胞的原代培养、纯化及鉴定;人绒毛膜癌JAR细胞株的培养。将原代纯化培养的人正常绒毛细胞设为正常组,人绒毛膜癌JAR细胞株设为绒癌组。以免疫组织化学法检测人正常绒毛滋养细胞和绒毛膜癌细胞株JAR细胞膜上AE2的表达。以RT-PCR技术检测人正常绒毛滋养细胞及绒癌JAR细胞中AE2mRNA的表达水平。结果在正常组中,原代培养的人正常绒毛滋养细胞上仅能从显微镜中肉眼观察到AE2的极低表达,以致摄影效果不佳。而在绒癌组中,绒癌JAR细胞膜上AE2的阳性细胞率为(91.59±12.10)%,远高于正常组。在正常人绒毛滋养细胞与人绒癌JAR细胞株中,均检测到AE2mRNA的表达。绒癌组AE2的OD值为(0.85±0.21);正常组AE2的OD值分别为(0.19±0.01)。绒癌组AE2的OD值明显高于正常组(P<0.05)。结论 AE2表达异常上调,滋养细胞内、外的水电解质平衡将被破坏,可能是导致绒癌发生的原因之一。

促肝细胞再生磷酸酶-3蛋白在5株癌细胞中的表达

目的研究促肝细胞再生磷酸酶-3(phosphatase of regenerating liver-3,PRL-3)在5株癌细胞(HO-8910PM、CNE-2Z、A549、JAR和BEL-7402)中的表达情况,为选择合适的细胞株克隆PRL-3基因奠定基础。方法用Western blot分析PRL-3在5株癌细胞(HO-8910PM、CNE-2Z、A549、JAR和BEL-7402)中的表达。结果PRL-3蛋白在5株癌细胞中都有表达:在HO-8910PM与CNE-2Z中呈高度表达,在A549和BEL-7402中呈中等程度表达,而在JAR中呈低度表达。结论PRL-3在5株癌细胞中均有表达,可选择高表达的HO-8910PM或CNE-2Z细胞克隆PRL-3基因。

人绒毛膜癌裸鼠原位移植模型的建立

目的建立人绒毛膜癌裸鼠原位移植瘤模型。方法培养人绒毛膜癌细胞系JAR,制备JAR单细胞悬液,给5只8周龄BALB/c裸鼠经皮下注射建立皮下移植瘤模型。待裸鼠皮下成瘤后,无菌条件下取瘤组织并切成1 mm^3组织块,通过手术方式植入10只10周龄BALB/c裸鼠子宫腔内,裸鼠濒死状时4%水合氯醛(10 g/kg)腹腔注射麻醉处死,观察子宫成瘤及腹腔转移情况。解剖取子宫原位移植瘤、腹腔内转移瘤、腹腔淋巴结及其他脏器组织标本,通过组织病理学检查进行鉴定。结果10只BALB/c裸鼠中共有7只裸鼠子宫内可见移植瘤肿块形成,其中2只可同时观察到子宫移植瘤和腹膜转移瘤。在病理学形态和结构上,皮下移植瘤模型、原位移植模型和腹膜转移瘤的瘤细胞与人绒毛膜癌细胞系JAR一致。结论成功建立人绒毛膜癌JAR细胞的BALB/c裸鼠原位移植瘤模型。

RT-PCR及激光共聚焦检测人绒毛和绒癌细胞中AE2的表达

目的探讨在人正常绒毛细胞和绒癌JAR细胞中阴离子交换蛋白2(AE2,Anion Exchanger 2)的表达差异及意义。方法以RT-PCR技术及免疫荧光激光共聚焦技术检测人正常绒毛滋养细胞和绒毛膜癌细胞株JAR细胞膜上AE2的表达。结果①在人绒毛滋养细胞与人绒癌JAR细胞株中,均检测到AE2mRNA的表达。绒癌组AE2的OD值为(0.85±0.21);正常组AE2的OD值分别为(0.19±0.01)。绒癌组AE2的OD值明显高于正常组(P<0.05)。②免疫荧光激光共聚焦实验证实AE2在绒癌组呈红色阳性表达,在正常组中未见红光,当加强激发强度后,仍可探及AE2在正常组的表达。结论 AE2在绒癌中表达异常升高,可能引起滋养细胞内水电解质平衡紊乱,导致绒癌发生。

人绒癌耐药细胞株JAR/MTX蛋白质组双向凝胶电泳图谱的建立

目的:建立人绒癌耐药细胞株JAR/MTX蛋白质组双向凝胶电泳图谱。方法:用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液培养JAR/MTX细胞,胰酶消化后收集细胞,加入细胞裂解液使细胞充分裂解,离心后取上清液进行双向凝胶电泳和考马斯亮蓝染色,应用PDQuest图像分析系统进行凝胶图谱分析,从凝胶图中选取1个分离较好的蛋白质点,应用四极杆-飞行时间质谱(Q-TOF-MS)和数据库搜索鉴定蛋白质。结果:获得了背景清晰、分辨率和重复性较好的双向凝胶电泳图谱;在17cmpH3～10IPG胶条上可分离到(810±45)个重复性及分辨率均较好的蛋白位点,蛋白斑点的匹配率为80.2%;1个蛋白点通过质谱分析和数据库检索得到了初步的鉴定。结论:建立了人绒癌耐药细胞株JAR/MTX双向凝胶电泳参考图谱,为其蛋白质组学的进一步研究奠定了基础。

人绒毛癌细胞JAR中ERCC2的表达

目的:以人正常绒毛组织和人绒毛癌细胞JAR为研究对象,探求ERCC2表达与人绒毛癌细胞JAR发生的关系。方法:分别取人正常绒毛组织100mg,人绒毛癌细胞JAR108,提取组织中总RNA,采用RT-PCR的方法分析细胞中ERCC2表达水平。结果:ERCC2在人绒毛癌细胞JAR中表达显著低于人正常绒毛组织。结论:ERCC2在人绒毛癌细胞JAR中低表达可能是人绒毛癌细胞JAR恶变形成的基础。

4'-甲醚-黄芩素诱导人绒毛膜癌细胞凋亡的信号转导机理研究

目的:探讨4'-甲醚-黄芩素(4'-methyl ether-scutellarein,4-MS)诱导人绒毛膜癌JAR细胞凋亡的信号传导机制。方法:光镜、电镜观察细胞形态、超微结构,RT-PCR技术检测Survivin、Caspase 9、Caspase 3、p38 MAPK基因的表达,Western blot检测Survivin、Caspase 9、Caspase 3、p38 MAPK、Bax和cytochrome C蛋白水平的表达差异。结果:光镜和电镜下可见凋亡细胞的形态学改变;RT-PCR结果显示,不同质量浓度(20、40μg/ml)的4-MS作用24h后,JAR细胞中Survivin mRNA表达显著下降,而Caspase 9、Caspase 3及p38 MAPK mRNA表达显著上升。Western blot证实,JAR细胞的Survivin蛋白表达量显著下降,Bax、cytochrome C蛋白表达量及p38磷酸化水平升高,Caspase 3与Caspase 9被明显激活。结论:4-MS通过上调Bax、cytochrome C、Caspase 9、Caspase 3表达,激活p38 MAPK信号通路及抑制Survivin表达,对JAR细胞内源性细胞凋亡信号转导通路进行正向调节而诱导细胞凋亡。