JC-1单标法和JC-1/PI双标法荧光探针检测山羊附睾精子线粒体膜功能的研究

为准确、全面研究超低温冷冻技术对山羊附睾精子线粒体膜电位的影响效果,本试验采用荧光探针JC-1单标和JC-1/PI双标2种荧光染色方法,通过流式细胞仪和荧光显微镜两种检测手段对精子线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,MMP)变化进行检测分析,用JC-1单独染色,能准确、快速地区分高、低MMP精子,但不能明确区分精子的存活状态,采用JC-1与碘化丙啶(Propidium iodide,PI)双标法,则能明显判定精子的存活状态。通过对绒山羊附睾精子在冷冻前和解冻后线粒体膜电位检测,结果表明,单标记后高MMP精子尾部呈橙红色,低MMP精子尾部为绿色;双标后死亡精子头部呈红色(PI+)。对两种检测手段的比较研究,结果显示,荧光显微镜能够有效地区分出高、低MMP及死精子,但对于活精子中MMP的高低检测效果不理想;流式细胞仪则能够有效地区分活精子MMP的高低,而且结果准确,速度快,敏感性高。试验表明,两种检测方法相关性很高,分析同一处理样品时用JC+%和JC+/PI-%检测结果呈显著正相关(r=0.815,r=0.982,P<0.01)。因此,对于精子线粒体MMP的分析,采用JC-1单染与JC-1/PI双染的方法,利用流式细胞仪与荧光显微镜进行联合检测,能比较全面、准确的反映出精子线粒体的功能状态。

miR-146a靶向TLR4对糖尿病所致足细胞能量代谢障碍的保护作用

目的探讨糖尿病肾病足细胞(podocyte)能量代谢的调控机制。方法购买人源肾足细胞,高糖诱导建立糖尿病体外模型,转染miR-146a mimic或pcDNA3.1-TLR4及其阴性对照物。qRT-PCR检测miR-146a与TLR4的表达。通过检测细胞外酸化率(ECAR)、检测糖酵解关键酶HK2的mRNA评估足细胞的糖酵解能力;通过JC-1荧光染色与ATP试剂盒检测了线粒体膜电位的变化以及ATP的含量。Starbase网站(https://starbase.sysu.edu.cn/)预测、双荧光素酶报告实验检测miR-146a与TLR4的靶向结合。结果高糖诱导的足细胞中miR-146a表达下调,TLR4表达上调,糖酵解能力下降,细胞膜电位下降,ATP产生减少;上调miR-146a的表达可以改善这种变化,而同时上调TLR4的表达则抑制了高表达miR-146a的改善作用。miR-146a靶向抑制TLR4的表达。结论糖尿病肾病足细胞中miR-146a低表达,促进了TLR4的表达,抑制了足细胞的糖酵解、膜电位及ATP的含量,最终导致足细胞的能量代谢障碍。

JC1系列静态爆破剂研制成功

湖北省科委、省建材局下达我院承担的《静态爆破剂切割大理石》的科研任务,在非金属矿系采矿教研室刘清荣副教授等人与硅工系有机化学教研室的同志共同努力下,经过多种配方的大量试验研究,筛选出了几种较为合理的配方及制作工艺过程,于最近研制成功了JC1系列静态爆破剂,取得了较重大的阶段性成果。七月二十七日到二十八日,湖北省建材局在武昌主持了该项成果的技术鉴定,经同行专家的评审,通过了技术鉴定。

JC-1404 HMED-1型多频大屏幕彩色显示器开关电源

一、电路组成 NEC公司生产的JC-1404HMED-1型多频大屏幕彩色显示器,其视频输入信号既可以是TTL数字信号,也可以是VGA模拟信号,采用并联型它激式单管输出开关稳压电源。该开关电源频率锁定(其他彩显电源振荡频率往往由行振荡脉冲控制),行输出电压固定在85

简易BH3分析法在血液肿瘤药敏筛选的初步探索

目的建立一种血液肿瘤BCL-2抗凋亡蛋白抑制剂药敏筛选的简易BH3分析法。方法建立基于显微镜和JC-1染色的BH3分析方法,通过BH3-only模拟肽描绘K562、NB4细胞系BCL-2家族抗凋亡蛋白依赖谱,应用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)加以验证;回溯临床治疗疗效,检验该方法对临床样本BH3药敏分析结果的符合情况。结果BH3分析结果显示NB4对抗凋亡蛋白的依赖程度依次为BCL2>MC1-1>BCL-XL;K562的依赖程度依次为BCL-XL>MC1-1>BCL2。PCR分析BCL-2家族基因表达量显示,K562抗凋亡蛋白MCL-1、BCL2、BCL-XL相对表达程度较高,BH3-only促凋亡蛋白中BIM、PUMA、NOXA高表达而HRK低表达,细胞抗凋亡能力更依赖于BCL-XL;NB4抗凋亡蛋白BCL-XL表达明显低于MCL-1与BCL-2,BH3-only促凋亡蛋白NOXA低表达,细胞抗凋亡更依赖于MCL-1与BCL-2而非BCL-XL,与BH3分析结果相符。对连续6例血液肿瘤患者骨髓进行BH3分析,结果显示6例患者均对HRK(BCL-XL抑制物)、VEN(BCL-2抑制物)不敏感;4例患者(例1~3,例5)对NOXA(MCL-1抑制物)表现为敏感,2例(例4、例6)的敏感度较低(<50%)。药敏预测结果显示6例患者均对BCL-2抑制剂耐药,例1~3、例5患者对MCL1抑制剂敏感,例4和例6对MCL1抑制剂可能耐药。回溯临床用药效果(4~6个疗程)显示例1~5患者对BCL-2抑制剂相关方案治疗无效,考虑与BCL-2抑制剂不敏感有关,例5更换西达苯胺治疗有效,例4和例6患者西达苯胺相关方案疗效不佳,考虑与MCL-1抑制物不敏感有关,上述临床结局与BH3预测结果一致。结论基于荧光显微镜和JC-1染色的BH3分析是简便可行的,可用于检测血液肿瘤细胞对不同抗凋亡蛋白的依赖性,从而为BCL-2家族相关抑制剂的选择提供证据。

沉默miR-31-5p抑制口腔鳞状细胞癌的增殖及凋亡

目的探究miR-31-5p对口腔鳞状细胞癌(OSCC)细胞增殖和凋亡的作用及与线粒体活性之间的关系。方法RT-qPCR检测OSCC组织和细胞中miR-31-5p的表达。利用Lipofectamine 2000将miR-NC、miR-31-5p mimic、miR-31-5p inhibitor分别转染至SCC-25和CAL-27细胞内,将细胞分为Control组、miR-NC组、miR-31-5p inhibitor组和miR-31-5p mimic组。克隆形成实验检测细胞增殖,微管形成实验检测微管数目,流式细胞术检测细胞凋亡,JC-1染色评估线粒体活性,ELISA检测超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量;蛋白印迹法检测Ki67、survivin、VEGF、Bcl-2、Bax和c-Myc蛋白表达水平。结果RT-qPCR检测结果显示,miR-31-5p在OSCC组织和细胞中均高表达(P<0.05);与Control组比较,沉默miR-31-5p可显著降低SCC-25和CAL-27细胞克隆形成和微管形成数目(P<0.05),并提高细胞凋亡率(P<0.05);蛋白印迹实验结果表明,沉默miR-31-5p可降低Ki67、survivin、VEGF和c-Myc蛋白表达水平及Bcl-2/Bax比率(P<0.05)。沉默miR-31-5p可显著降低SCC-25和CAL-27细胞中JC-1线粒体活性(P<0.05),抑制SOD活性并增加MDA含量(P<0.05)。结论沉默miR-31-5p通过破坏线粒体活性抑制OSCC细胞的增殖并诱导其凋亡。

一种5,5′,6,6′-四氯-1,1′-3,3′-四乙基苯并咪唑羰花青碘化物的合成方法

JC-1作为一种荧光探针,广泛应用于线粒体细胞膜的电位测定。本文以1,2,4-三氯-5-硝基苯为起始底物,经多步反应以18%的总收率获得JC-1。

基于VB/GM(1,1)/MATLAB的腐蚀管道剩余寿命预测及结构可靠度分析

以灰色理论GM(1,1)模型为基础,结合ASME B31G标准,考虑缺陷深度、缺陷长度、管道壁厚、管道直径、屈服强度、操作压力等随机性,建立腐蚀管道可靠性模型。使用VB进行腐蚀管道剩余寿命分析,利用MATLAB系统编程实现JC法计算结构可靠度,分析可靠性指标与缺陷深度、管道壁厚、管道压力的关系,为管道剩余寿命预测、复杂结构可靠性分析和腐蚀检测周期的确定提供依据。

转运蛋白在细菌吸附铜(Ⅱ)中的作用机理研究

为研究转运蛋白在细菌响应铜(Ⅱ)胁迫中发挥的作用,从Transporter Classification Database(TCDB)数据库中检索得到嗜根寡养单胞菌(Stenotrophomonas rhizophila)JC1基因组中4个参与Cu(Ⅱ)吸附、转运和外排的转运蛋白,并对其结构和功能进行分析。此外,研究菌株JC1对不同质量浓度的Cu^(2+)的吸附能力和耐受能力,并利用扫描电镜(SEM)、能量色散X射线光谱仪(EDS)和傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR)分别分析Cu^(2+)胁迫后,菌株JC1的形态学、元素组成和官能团的变化。结果显示,菌株JC1可耐受Cu^(2+)的质量浓度为160 mg/L,但对120 mg/L Cu^(2+)有最大吸附率,为72.3%。经Cu^(2+)胁迫后,菌株JC1光滑的杆状结构消失,表面褶皱、呈短杆状,且其元素组成中出现了3个Cu^(2+)吸收峰。FT-IR分析结果表明,—OH、—C—O和—C—C等官能团在菌株JC1胞外吸附Cu^(2+)中发挥了重要作用。对4个转运蛋白质的结构分析结果显示,铜稳态蛋白cutC同源物存在于细胞质中,其氨基酸序列中有多个Cu^(2+)结合位点,可为菌株JC1吸附Cu^(2+)提供条件。铜抗性蛋白A位于周质空间,其特异性负责对Cu^(2+)的吸附。CopB是一种外膜孔蛋白,其氨基酸中含有的N、O、P等元素为菌株JC1与重金属的结合提供了电子。另外,菌株JC1的铜转位P-ATPase属于P1B-ATPase,含有8个跨膜结构,其中N-端含有丰富的组氨酸残基在菌株JC1结合Cu^(2+)过程中发挥重要作用。

白藜芦醇对人黑色素瘤细胞增殖及凋亡的影响

目的研究白藜芦醇(resveratrol,Res)对人黑色素瘤细胞增殖及凋亡的影响。方法 MTT法检测不同浓度(10、20、40、80、160μmol.L-1)Res对人黑色素瘤细胞株Mel-RM和MM200增殖的抑制作用,溴化丙啶(propidium iodide,PI)单染进行流式细胞仪分析,检测Res对黑色素瘤细胞凋亡的影响。通过JC-1染色法检测Mel-RM和MM200细胞线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,△Ψm)。试剂盒检测Caspase-3的活性变化。结果随着Res的浓度的增加,对人黑色素瘤细胞株的增殖产生明显的抑制作用,80、160μmol.L-1的Res可诱导Mel-RM和MM200细胞出现明显的凋亡,JC-1染色结果显示,Res处理后Mel-RM和MM200线粒体膜电位分别降低51.0%和68.8%。Caspase-3活性检测结果显示Res对Caspase-3具有激活作用。结论 Res具有抑制黑色素瘤细胞增殖诱导其凋亡的作用,其机制可能与降低细胞线粒体膜电位及激活Caspase-3有关。

羟氯喹对人乳腺癌MDA-MB-435细胞增殖及凋亡的影响

目的观察羟氯喹(hydroxychloroquine,HCQ)对人乳腺癌MDA-MB-435细胞增殖及凋亡的影响。方法采用MTT法及克隆形成抑制实验观察HCQ对人乳腺癌MDAMB-435细胞的增殖抑制作用;采用倒置显微镜观察HCQ处理后细胞形态学变化;采用Hoechst 33258荧光染色检测HCQ对人乳腺癌MDA-MB-435细胞凋亡的作用;采用PI单染流式细胞术检测细胞晚期凋亡水平;采用线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)观察HCQ处理人乳腺癌MDA-MB-435细胞后线粒体膜电位的转变。结果不同浓度的HCQ作用于乳腺癌MDA-MB-435细胞24、48、72 h后,均能明显抑制细胞增殖;在倒置显微镜下可观察到HCQ作用于乳腺癌MDAMB-435细胞后细胞逐渐萎缩变圆,细胞密度变小,失去正常细胞形态;HCQ能明显抑制MDA-MB-435细胞克隆形成;Hoechst 33258荧光染色结果显示,HCQ可以诱导乳腺癌MDA-MB-435细胞凋亡;PI结果显示,20、40、60μmol·L-1HCQ处理细胞24 h后,晚期凋亡率分别为7.1%、15.9%、35.3%(P<0.05);HCQ作用于乳腺癌MDA-MB-435后JC-1从红色荧光到绿色荧光转变(P<0.05)。结论 HCQ可以明显抑制人乳腺癌MDA-MB-435细胞增殖及诱导凋亡。

地塞米松影响小鼠胸腺细胞线粒体膜电势变化研究

目的研究地塞米松刺激小鼠胸腺细胞过程中线粒体膜电势(△Ψm)的变化。方法以终浓度1×10-6mol/L地塞米松(DEX)刺激小鼠胸腺细胞,通过JC-1染色流式细胞术,在0、1、3、5、7、9、11、24和27h时点分别检测小鼠胸腺细胞平均J-aggregate(FL2)和平均J-monomer(FL1)含量,并计算线粒体膜电势(FL2/FL1)。结果本研究中,小鼠胸腺细胞离体后FL1所反映的线粒体质量迅速下降,至5h对照组达到平台期(913.38±70.11),然后缓慢下降到27h的(622.80±22.81)。DEX组FL1在1h和3h与对照组没有显著差异(P>0.05),而从5h(660.91±72.95)开始显著低于对照组(P<0.01),并且随培养时间延长呈下降趋势,至27h的(309.70±53.35)。对照组和DEX组FL2随培养时间延长而降低。1-9h,对照组和DEX的△Ψm没有显著差异(P>0.05)。而在11、24和27h,对照组△Ψm分别为(256.41±21.59)、(214.14±23.21)和(146.14±17.97),而DEX组△Ψm显著低于对照组(P<0.01),分别为(138.28±20.59)、(111.61±29.67)和(72.92±17.86)。结论DEX诱导小鼠胸腺细胞凋亡过程中,线粒体质量降低和△Ψm下降是早期事件,而细胞内现存线粒体△Ψm下降则是较晚期的事件。在本研究中,线粒体质量下降与现存线粒体膜电势的变化之间关系不紧密。

流式细胞术检测细胞凋亡比较研究

从三方面探讨检测细胞凋亡流式细胞术的方法。选用大鼠皮质神经元细胞,同时使用碘化丙锭(PI)An-nexin V/PI.JC-1法检测细胞凋亡率。结果显示三种方法的凋亡率分别是:2.60%,6.52%和18.56%,两两之间有显著性差异(P<0.01)。JC-1法最敏感,AV/PI次之,PI单染法不适合检测早期细胞凋亡。

菝葜皂苷元对人结肠癌细胞LoVo凋亡的影响

目的探讨菝葜皂苷元对人结肠癌细胞LoVo凋亡的影响。方法采用流式细胞仪AnnexinV/PI双染法检测LoVo细胞的凋亡率;采用流式细胞仪检测细胞周期进程;采用流式细胞仪JC-1染色法检测线粒体膜电位(ΔΨm)水平。结果菝葜皂苷元作用细胞48h后可以诱导细胞凋亡,菝葜皂苷元可阻滞细胞于G2/M期,菝葜皂苷元诱导细胞凋亡时伴随着线粒体膜电位的降低。结论菝葜皂苷元能诱导细胞凋亡,其诱导凋亡的途径可能与线粒体通路有关。

磷酸肌酸保护心肌细胞线粒体功能机制初探

目的 :探讨磷酸肌酸 (phosphocreatine ,CP)保护心肌细胞线粒体功能的机制。方法 :采用胶原酶分离成年大鼠心肌细胞 ,0 2mmol/L过氧化氢 (hydrogenperoxide,H2 O2 )刺激细胞 ,于刺激前 10min加入 1mmol/L、10mmol/LCP ,利用荧光探针JC 1结合流式细胞仪检测线粒体膜电位的变化 ;Annexin V/PI及TUNEL染色法鉴定心肌细胞的凋亡。使用 10 μmol/L鱼藤酮及 2 μmol/L碘乙酰胺分别抑制呼吸链及磷酸肌酸激酶 (CK) ,观察其对CP保护作用的影响。结果 :H2 O2 导致线粒体膜电位下降 ,细胞凋亡增加。磷酸肌酸有效地抑制了线粒体膜电位的下降 ,减少了细胞凋亡。鱼藤酮及碘乙酰胺可使其保护作用消失。结论 :CP能够抗心肌细胞氧化损伤 ,其机制可能依赖于减低线粒体膜电位的下降 ,保护线粒体正常功能。

流式细胞仪检测线粒体膜电位方法的研究

通过流式细胞仪进行检测,研究选择每种检测线粒体膜电位(Δψm)荧光染料的适用条件.选用罗丹明123、Di OC6(3)、TMRE、JC-14种荧光染料,通过对紫外线诱导后细胞的线粒体膜电位进行检测,分析每种染料的检测条件.结果表明,罗丹明123检测到的Δψm变化较大,这可能与罗丹明123适用于检测细胞急性损伤中线粒体膜电位变化相关.通过比较实验方法,为将来采用流式细胞仪检测线粒体膜电位提供更准确的实验方法.

尿激酶型纤溶酶原激活因子对小鼠获能精子线粒体膜电位的影响

目的:检测尿激酶型纤溶酶原激活因子(uPA)体外对小鼠获能精子线粒体膜电位的影响。方法:采用线粒体膜电位荧光染料JC-1,利用流式细胞仪和荧光显微镜检测分别与uPA(实验组)和BWW液(对照组)共孵育0、5、15、30、60min的小鼠获能精子线粒体膜电位状态。结果:①在uPA作用第5、15min时,精子体内平均荧光强度较作用前显著增加,高膜电位的精子数量百分率相应增加(P<0.05)。②与对照组相比,实验组在uPA作用5、15min时的高膜电位精子数量百分率,以及作用15、30、60min时的精子线粒体膜电位平均荧光强度显著增加(P<0.05)。结论:uPA在体外可以增加小鼠获能精子的线粒体膜电位,并使高膜电位状态维持一段时间,为获能精子提供充足的能量供应。

凋亡细胞线粒体膜电位的流式细胞术分析

采用流式细胞术与特异荧光探针JC 1相结合,在单细胞水平对X射线和化疗药物处理后的食管癌EC6细胞线粒体膜电位的变化进行了分析,凋亡细胞的线粒体膜电位下降,红色荧光减弱,随着剂量的增加,凋亡细胞的比例增大。

清癌汤体外抗肿瘤作用及其机制研究

目的:探讨清癌汤体外对肿瘤细胞的增殖、凋亡及p53表达的影响。方法:倒置显微镜下观察加药后细胞形态的变化,MTI法检测细胞增殖,流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡情况,JC-1检测细胞膜电位变化情况,免疫荧光法检测细胞内p53蛋白表达情况。结果:清癌汤在高浓度作用下,肿瘤细胞形态发生了明显变化,对人乳腺癌细胞(MCF-7)、人肝癌细胞(HepG2)、人胃癌细胞(MGC-803)具有明显的抑制作用,并呈浓度依赖性,而对大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞(PC12)无明显抑制作用。清癌汤可诱导MGC-803发生凋亡并呈明显的浓度依赖性,降低线粒体膜电位,从而引起细胞凋亡,并能升高p53蛋白的表达量。结论:清癌汤具有良好的体外抗肿瘤作用,且无明显神经毒性,该作用与其诱导细胞凋亡包括降低线粒体膜电位和上调p53蛋白表达有关。

检测早期细胞凋亡的流式细胞术

探讨了采用多参数流式细胞术分析氧化应激造成的心肌细胞凋亡过程中线粒体膜电位的改变 ,应用荧光探针JC 1可敏感检测到这种改变 ,是一种检测早期细胞凋亡改变的理想手段。