TGF-β_1对绒毛膜癌JEG-3细胞基质金属蛋白酶-9基质金属蛋白酶抑制剂-1蛋白表达的影响

目的:观察转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)对绒毛膜癌JEG-3细胞系基质金属蛋白酶-9(matrixmetalloproteinases,MMP-9)、基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)蛋白表达的影响。方法:体外培养人绒毛膜癌JEG-3细胞,分别给予不同浓度及不同作用时间的TGF-β1进行诱导,Western Blotting法检测MMP-9、TIMP-1蛋白的表达变化。结果:与对照组相比,100、200μg/L TGF-β1作用后,检测各组细胞MMP-9及TIMP-1蛋白的相对表达量均增加(P<0.01);与0h比较,12、24、48、72h各组细胞MMP-9及TIMP-1蛋白的相对表达量均增加(P<0.05),且各组MMP-9/TIMP-1大于1。结论:绒癌的浸润转移与MMP-9及TIMP-1的表达变化密切相关。

RNA干扰技术抑制JEG-3细胞中HLA-G的表达

目的:以人类白细胞抗原G基因(HLA-G)为靶基因,采用RNA干扰(RNAi)技术特异性地抑制JEG-3细胞中HLA-G的表达。方法:针对HLA-G基因设计一段小干扰RNA(siRNA),由Ambion公司化学合成,用脂质体lipofectamine2000将该siRNA转染JEG-3细胞,采用RT-PCR、流式细胞术和Westernblot分别从mRNA和蛋白质水平检测该siRNA对HLA-G表达的影响。结果:针对HLA-G的siRNA能够明显下调JEG-3细胞中HLA-G的表达水平,并具有良好的特异性。结论:在JEG-3细胞系中采用RNAi技术特异性下调了HLA-G基因的表达,为进一步研究HLA-G在人类的母胎免疫耐受、正常妊娠的维持及助孕技术应用等方面的作用奠定了实验基础。

5-杂氮脱氧胞苷对JEG-3细胞及印迹基因H19效应的初步研究

目的:研究甲基化酶抑制剂5-杂氮脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,ADC)对人绒毛膜上皮癌细胞株JEG-3细胞的生物学作用,观察JEG-3细胞H19表达变化与滋养细胞增殖、分化和侵袭等行为的相关性,从表观遗传学角度探讨滋养细胞侵袭行为的调控。方法:应用MTT法检测不同浓度5-杂氮脱氧胞苷在不同时相下对JEG-3细胞增殖的影响。体外小室迁移实验观察5-杂氮脱氧胞苷对JEG-3细胞迁移的影响。荧光定量RT-PCR检测5-杂氮脱氧胞苷作用下JEG-3细胞H19mRNA表达的变化。结果:5-杂氮脱氧胞苷对JEG-3细胞增殖起抑制作用,在一定范围内与时间和剂量呈正相关。经100μmol/L5-杂氮脱氧胞苷作用24h后的JEG-3细胞迁移能力明显受限,迁移细胞数较对照组差异显著(P<0.01)。经5-杂氮脱氧胞苷作用后JEG-3细胞中H19mRNA表达增高,在一定范围内与时间和剂量呈正相关。结论:甲基化酶抑制剂5-杂氮脱氧胞苷可致H19mRNA过量表达,并进一步抑制滋养细胞的增殖和迁移能力。H19印迹基因表达上调与滋养细胞增殖抑制和迁移能力降低有关。

天花粉蛋白对绒癌细胞JEG-3体外增殖和HLA-G、HLA-E表达的影响

目的探讨天花粉蛋白对绒癌细胞JEG-3体外增殖及对HLA-G、HLA-E表达的影响,为临床应用天花粉蛋白抗肿瘤治疗提供理论依据。方法体外培养高表达HLA-G、HLA-E的绒癌细胞株JEG-3,采用MTT法检测天花粉蛋白对细胞增殖的影响,通过RT-PCR技术和流式细胞分析技术观察其对该细胞中HLA-G、HLA-EmRNA和蛋白水平表达的影响。结果实验组不同浓度天花粉蛋白对JEG-3细胞均表现出一定程度的抑制作用,呈浓度依赖性。同100μg/ml组和对照组相比,1000μg/ml组天花粉蛋白能明显下调JEG-3细胞中HLA-GmRNA和蛋白水平(均P<0.01)。各组之间HLA-EmRNA和蛋白水平有统计学差异(分别为P=0.014,P=0.028)。进一步组间比较,1000μg/ml组HLA-EmRNA和蛋白水平明显低于对照组(分别为P=0.004,P=0.009)。结论天花粉蛋白能显著抑制绒癌JEG-3细胞的增殖,并能下调该细胞系HLA-G、HLA-EmRNA和蛋白水平,提示天花粉蛋白抗肿瘤的另一机制可能是其可以打破机体对肿瘤的免疫耐受,从而遏制肿瘤的生长。

人绒毛膜促性腺激素诱导JEG-3细胞TGF-β_3的表达

目的:探讨人绒毛膜促性腺激素（hCG）对绒癌细胞系表达转化生长因子（TGF-β3）的影响。方法:以绒癌细胞来源的JEG-3细胞系为研究对象,采用半定量逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）方法,观察HCG对JEG-3细胞表达TGF-β3 mRNA的影响响。结果:分别用0、50、500、5000、25000 mU/ml hCG处理48h后,JEG-3细胞中TGF-β3 mRNA的含量逐渐被诱导增多,并表现出一定的浓度效应——随hCG作用浓度增高而显著;另外,分别检测受25 000mU/ml hCG处理0、6、12、24、30、36、48h的JEG-3细胞中TGF-β3 mRNA的表达情况,发现TGF-β3表达受hCG的诱导在30h时最强,之后逐渐减弱。结论:hCG可能通过调节TGF-β3在滋养细胞或滋养细胞来源的绒癌细胞中的表达,进而影响细胞的浸润转移。

葡萄胎病理相关新基因F10与绒癌细胞系JEG-3成瘤性的关系

目的：探讨葡萄胎病理相关新基因F10与绒癌细胞系JEG-3裸鼠皮下成瘤的关系。方法通过细胞转染技术及RNA干扰技术，分别建立和筛选出F10基因稳定过表达及沉默的绒癌细胞系JEG-3。取SPF级裸鼠（4~5周龄）30只，随机均分为JEG-3 F10过表达组、JEG-3 F10沉默组、JEG-3未处理组（n=10），分别接种F10基因过表达的JEG-3细胞、F10基因沉默的JEG-3细胞和未处理的JEG-3细胞株5×107个于颈背部皮下。接种后每3~4 d称量裸鼠质量观察，记录肿瘤发生时间，观察皮下肿瘤的生长情况。绘制在体肿瘤生长曲线，计算各组裸鼠的成瘤率。结果3组的成瘤率均为100%（10/10）。JEG-3 F10过表达组、JEG-3 F10沉默组、JEG-3未处理组的成瘤时间分别为6.2±0.78、7±2.49、6.3±0.67 d，组间比较无统计学差异（F=0.781，P=0.468）。JEG-3 F10过表达组肿瘤的在体生长速度较JEG-3 F10沉默组、JEG-3未处理组增快，差异有统计学意义（P〈0.05），JEG-3 F10未处理组肿瘤的在体生长速度较JEG-3 F10沉默组快（P〈0.05）。细胞接种5周后处死小鼠，取瘤组织称重，JEG-3 F10过表达组、JEG-3 F10沉默组、JEG-3未处理组肿瘤重量分别为571.1±221.10 mg、136.2±66.25 mg、354.5±116.23 mg，组间比较存在统计学差异（F=21.199，P=0.000）。结论 F10基因与绒癌细胞系JEG-3的增殖调节有关，可增强JEG-3细胞系在裸鼠体内的致瘤性。

过表达和抑制miR-133a对JEG-3中HLA-G表达的影响

目的研究微小miR-133a在人绒癌细胞株(JEG-3)中对人类白细胞抗原G(HLA-G)的表达调控作用。方法用脂质体包裹化学合成的miR-133a前体分子并转染JEG-3,从而过表达及抑制miR-133a,逆转录-聚合酶链反应技术(RT-PCR)检测转染后miR-133a及HLA-G在mRNA水平的表达情况。Western blot法检测转染miR-133a后细胞中HLA-G蛋白水平的表达。结果 JEG-3细胞中抑制miR-133a后HLA-G在mRNA及蛋白水平均表达增加;在JEG-3细胞中过表达miR-133a后HLA-G在mRNA及蛋白水平均表达下降,差异有统计学意义(P<0.05)。结论在JEG-3细胞中miR-133a能够负性调控HLA-G的表达,进一步验证了miR-133a与自然流产、子痫前期等疾病的相关性,并为进一步探索相关疾病机制及临床诊治提供了一定的实验基础。

印迹基因H19对人绒毛膜上皮癌细胞JEG-3侵袭能力的影响

目的探讨印迹基因H19对滋养细胞侵袭能力的影响,以期从分子遗传学角度来阐明滋养细胞侵袭行为的调控机制。方法含人全长H19 cDNA重组真核表达质粒pRc/CMV经测序鉴定正确后,转染滋养细胞株JEG-3,观察其H19 mRNA表达和细胞侵袭力的变化。结果质粒转染JEG-3细胞的转染效率>50%,转染目的基因H19后mRNA表达较对照组显著升高;转染目的基因后JEG-3细胞穿膜细胞数明显少于未转染组和空载体转染组。结论H19基因过表达可抑制JEG-3的侵袭能力,为H19调控滋养细胞侵袭行为提供了直接的实验证据。

转化生长因子-β_1对绒癌JEG-3细胞MMP-9 mRNA及TIMP-1 mRNA表达的影响

目的探讨转化生长因子-β1(TGF-β1)不同浓度和作用时间对绒癌JEG-3细胞基质金属蛋白酶-9基因(MMP-9 mRNA)及基质金属蛋白酶抑制剂-1基因(TIMP-1 mRNA)表达的影响。方法先分别用TGF-β10、100、200 ng/ml作用于绒癌JEG-3细胞,48 h收获细胞;再以TGF-β1100 ng/ml分别与JEG-3细胞作用0、12、24、48、72h;最后用RT-PCR技术检测TGF-β1不同浓度和作用时间收获JEG-3细胞的MMP-9 mRNA及TIMP-1 mRNA表达。结果随TGF-β1浓度升高和作用时间延长,各收获细胞的MMP-9 mRNA及TIMP-1 mRNA表达均明显升高,且MMP-9 mRNA与TIMP-1 mRNA比值均>1(P<0.01或<0.05)。结论在一定浓度和作用时间内,外源性TGF-β1可促进绒癌JEG-3细胞MMP-9 mRNA及TIMP-1 mRNA表达。

5-杂氮脱氧胞苷对JEG-3细胞侵袭力的影响及相关机制探讨

目的研究甲基化酶抑制剂5-杂氮脱氧胞苷(5-aza-2-′deoxycytidine,ADC)对人绒毛膜上皮癌细胞株JEG-3细胞侵袭能力及其对JEG-3细胞H19甲基化状态的影响,从表观遗传学角度探讨滋养细胞侵袭行为的相关调控机制。方法Matrigel侵袭小室模型观察ADC处理JEG-3细胞24h后细胞侵袭能力的变化。亚硫酸氢盐修饰后测序法检测ADC对JEG-3细胞中H19基因甲基化的影响。结果经100μmol/L ADC作用24h后的JEG-3细胞侵袭能力明显降低,较对照组差异有统计学意义(P<0.01)。经ADC作用后的JEG-3细胞中H19基因甲基化程度降低。结论甲基化酶抑制剂ADC可降低H19基因甲基化程度,并抑制滋养细胞侵袭能力。H19甲基化状态改变可能参与调控滋养细胞侵袭能力。

RNA干扰技术抑制EMMPRIN表达对人绒癌细胞JEG-3侵袭性的实验研究

目的研究RNA干扰技术抑制人绒癌JEG-3细胞EMMPRIN的表达,探讨EMMPRIN在滋养细胞侵袭行为中的作用。方法设计、体外化学合成靶向EMMPRIN的短发夹状双链RNA(shRNA),分别与脂质体LipofectamineTM2000结合后转染体外培养的人绒癌细胞系JEG-3。分为A实验组:每组中加入1μg重组质粒和5μl阳离子脂质体Metafectene;B阴性对照组:只加5μl脂质体转染试剂;C无关对照组(无关dsRNA对照组,载体试剂盒自带)。三组细胞孵育48h后,Western blot和RT-PCR技术检测EMMPRIN蛋白和mRNA的表达,明胶酶谱测定MMP2,9的表达。结果RNA干扰技术可以显著的靶向抑制EMMPRIN基因在人绒癌细胞中的表达,与B组和C组相比,A组细胞EMMPRIN蛋白和EMMPRINmRNA表达分别减少了75.2%和62.3%(P<0.01);B、C组EMMPRIN蛋白和EMMPRIN mRNA表达分别减少了3.3%、2.4%和3.2%、1.8%(P>0.05);A组细胞在转染后的12,24,36,48小时MMP2的分泌分别下降了13.5%,29.6%,58.3%和66.6%;MMP9的分泌分别下降了10.7%,33.8%,47.5%和62.6%,相邻组间比较差异显著(P<0.05)。结论EMMPRIN与滋养细胞的侵袭功能密切相关,抑制滋养细胞中EMMPRIN的表达可以抑制滋养细胞的侵袭。

不同剂量IL-12对绒毛膜癌JEG-3细胞增殖的影响

目的观察不同剂量白细胞介素-12(IL-12)对绒毛膜癌JEG-3细胞增殖能力的影响。方法体外培养人绒毛膜癌JEG-3细胞,分别给予不同剂量的IL-12进行诱导,四甲基氮唑(MTT)比色法检测细胞增殖能力的变化。结果 5 ng/ml、10 ng/ml、25 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml IL-12作用后,细胞增殖率显著降低(P<0.01)。且绒毛膜癌JEG-3细胞对IL-12的诱导作用表现为良好的浓度效应。结论外源性IL-12能够抑制绒毛膜癌JEG-3细胞的增殖,具有良好的浓度依赖效应。其相关机制有待进一步探讨。

人绒毛膜促性腺激素对JEG-3细胞表达VEGF的影响

目的 :揭示人绒毛膜促性腺激素 (hCG)对滋养层细胞表达血管内皮生长因子 (VEGF)的影响。方法 :以滋养层细胞来源的JEG - 3细胞系为研究对象 ,采用半定量逆转录多聚酶链反应 (RT -PCR)方法检测VEGFmRNA的表达。结果 :分别用 (0、50、50 0、5 0 0 0、2 5 0 0 0 )U/LhCG处理 48h后 ,JEG - 3细胞中VEGF的表达被诱导增高 ,且包括VEGF1 2 1 、VEGF1 6 5、VEGF1 89在内的VEGF亚型均受到诱导。另外 ,观察VEGF在 2 5 0 0 0U/LhCG处理的JEG - 3细胞中表达的时间变化 ,结果发现VEGF在JEG - 3细胞中的表达在经过短暂的诱导后略降低。结论 :hCG可能通过调节VEGF在滋养层细胞或滋养层细胞来源的绒癌细胞中的表达 ,进而影响细胞的增殖。

hCG对JEG-3滋养细胞系表达细胞因子的影响

目的 揭示人类绒毛膜促性腺激素 (hCG)是否通过改变细胞因子的生成而影响滋养细胞的侵袭性。方法 以永生化的滋养细胞系JEG 3为研究对象 ,采用逆转录多聚酶链反应 (RT PCR)方法 ,观察了hCG对JEG 3细胞与细胞侵袭力调节有关的多种细胞因子表达的影响。结果 JEG 3细胞表达HGF、IGF II、VEGF和TGF β3,且VEGF的表达以VEGF12 1和VEGF16 5为主 ,而不表达IGFTGF 1β、TGF β2、IL β1。 2 5U/mLhCG处理 5 0h可显著降低JEG 3细胞中HGF的表达 ,同时强烈诱导VEGF12 1和VEGF16 5的表达 ,而其它基因的表达未发生明显变化。结论 HGF对滋养细胞的侵入起促进作用 ,而VEGF则具有抑制效应。说明 。

RNA干扰技术抑制JEG-3细胞中HMGA1的表达

目的:以人类高迁移率蛋白A1(HMGA1)为靶基因,采用RNA干扰(RNAi)技术特异性地抑制JEG-3细胞中HMGA1的表达。方法:针对HMGA1基因设计、合成一段小干扰RNA(siRNA),用脂质体lipo-fectamine2000将该siRNA转染JEG-3细胞,采用RT-PCR和Western blot分别从mRNA和蛋白质水平检测该siRNA对HMGA1表达的影响。结果:针对HMGA1的siRNA能够明显下调JEG-3细胞中HMGA1的表达水平,并具有良好的特异性。结论:在JEG-3细胞系中采用RNAi技术特异性下调了HMGA1基因的表达,为研究HMGA1基因在肿瘤细胞中的作用奠定实验基础,也为进一步研究HMGA1在治疗人类绒毛膜细胞癌的临床应用提供了有益帮助。

泛素结合酶E2-EPF高表达质粒的构建及对绒癌细胞JEG-3生长功能的初步探讨

目的:构建泛素结合酶E2-EPF高表达质粒,初步探讨E2-EPF在绒癌细胞增殖中的作用。方法:基因克隆技术构建pcDNA(3.1+)-E2-EPF高表达质粒,通过瞬时转染将质粒导入绒癌细胞JEG-3中,使E2-EPF高表达;流式细胞仪检测及细胞增殖实验初步研究E2-EPF高表达对绒癌细胞生长速率的影响。结果:E2-EPF高表达质粒构建成功,瞬时转染后细胞E2-EPFmRNA升高约8.4倍,JEG-3细胞的生长速率显著高于对照组(P<0.05),处于G2-M期和S期细胞显著增加。结论:E2-EPF参与细胞的生长调控,促进E2-EPF表达可以加速绒癌细胞JEG-3的生长速率。

17β-雌二醇调节JEG-3细胞的microRNA表达研究

目的:探讨17β-雌二醇(E2)调节人绒毛癌细胞系JEG-3的microRNA的表达.方法:定量PCR检测E2对microRNA的表达.结果E2能够促进JEG-3 miR16、miR126、miR335、miR451、miR491-5p、miR-520g和miR612的表达,降低miR-26b和miR-29b的表达.结论:E2能够对JEG-3细胞的microRNA表达产生调节作用,提示我们在妊娠过程中E2可以通过调节microRNA来影响滋养层细胞增殖、迁移、浸润和血管重塑等功能,并可能为探讨子痫前期等的发病机制提供线索.

IL-6干预后人绒毛膜癌JEG-3细胞侵袭能力及MMP-2表达的变化

目的:观察IL-6干预后人绒毛膜癌JEG-3细胞侵袭能力的变化,并探讨其是否通过STAT3信号通路调控MMPs的表达实现该作用。方法:体外培养JEG-3细胞,实验1分为抑制剂组(5μmol/L STAT3活性抑制剂SD-1008)和空白对照组,处理24 h后,采用Western blot和荧光定量PCR检测2组细胞中p-STAT3蛋白与基质金属蛋白酶(MMP-2、MMP-9)蛋白和mRNA的表达水平。实验2分为IL-6组(10μg/L IL-6)和空白对照组。采用Western blot检测2组细胞处理10、30、60 min p-STAT3的表达水平,采用MTT实验和Transwell实验检测处理36 h后2组细胞的增殖能力和侵袭能力,同时检测MMP-2、MMP-9蛋白和mRNA的表达水平。结果:①与空白对照组相比,抑制剂组的p-STAT3蛋白、MMPs mRNA及蛋白水平均下降(P<0.05)。②与空白对照组相比,IL-6组JEG-3细胞的增殖能力无明显改变,但侵袭能力增强(P<0.05),细胞中p-STAT3、MMP-2和MMP-9的表达量差异无统计学意义(P>0.05),但细胞中活化形式的MMP-2蛋白的表达水平升高(P<0.05)。结论:STAT3可能是调控滋养细胞中金属基质蛋白酶表达信号通路中的上游分子;IL-6可通过上调MMP-2的活化水平来促进JEG-3细胞的侵袭能力,但并非通过STAT3信号通路,其机制有待进一步阐明。

转化生长因子-β_1对人绒癌JEG-3细胞增殖及基质金属蛋白酶抑制剂-1的作用研究

目的观察转化生长因子(TGF)-β1不同作用时间对绒癌JEG-3细胞增殖及基质金属蛋白酶抑制剂(TIMP)-1的影响。方法以100μg/LTGF-β1处理JEG-3细胞,分别于不同时间收获细胞,采用MTT法于0、12、24、48h检测细胞的增殖活力,采用Western Blotting及RT-PCR技术于0、12、24、48、72h分析TIMP-1在蛋白和转录水平的表达情况。结果随着100μg/LTGF-β1作用时间的延长,各实验组的细胞增殖率逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.05);TIMP-1蛋白和TIMP-1 mRNA的表达随着100μg/LTGF-β1作用时间的延长均呈明显的增加趋势(P<0.05)。结论绒癌JEG-3细胞对外源性的TGF-β1有良好的反应性并呈时间依赖性,100μg/LTGF-β1可促进JEG-3细胞增殖及TIMP-1蛋白及其mRNA的表达。

17β-雌二醇和富含半胱氨酸蛋白61对JEG-3细胞增殖作用的机制研究

目的探讨17β-雌二醇(E2)和富含半胱氨酸蛋白61(Cyr61)影响人绒毛膜癌细胞系JEG-3细胞增殖的机制。方法定量PCR检测Cyr61和microRNA 195(miR-195)的表达,羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)染色法检测细胞增殖。结果 E2能够提高Cyr61 mRNA的表达;Cyr61能够降低miR-195的表达和促进JEG-3的细胞增殖。结论 E2通过增强Cyr61和降低miR-195的表达影响JEG-3细胞的增殖,可能为探讨子痫前期的发病机制提供线索。