棉铃虫JNKs基因的克隆及表达分析

c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)是MAPK家族(mitogen-activated protein kinases,丝裂原活化蛋白激酶)的重要成员,具有参与昆虫抗逆反应等多种功能。为明确JNK在棉铃虫Helicoverpa armigera中的表达特性及其对Bt杀虫蛋白的应激与免疫反应,本研究通过PCR克隆得到2个棉铃虫JNK基因HaJNK1和HaJNK2;生物信息学分析结果显示:HaJNK1和HaJNK2基因开放阅读框分别为1 191、1 143 bp,分别编码397、381个氨基酸。系统进化树分析结果表明棉铃虫HaJNK1与黏虫Mythimna separata聚为一支,亲缘关系较近,HaJNK2与家蚕Bombyx mori聚为一支,同源性较高。利用实时荧光定量PCR技术分析HaJNK1与HaJNK2在棉铃虫不同发育时期、不同组织中的表达量,发现HaJNK1与HaJNK2在卵中表达量最高,其次是雌成虫;HaJNK1在性腺中表达量最高,其次是唾液腺;HaJNK2在头部表达量最高,其次是性腺。取食Cry1Ac的4龄棉铃虫幼虫的中肠组织中,HaJNK1与HaJNK2的表达量均显著升高。推测HaJNKs基因可能参与棉铃虫抵御Bt杀虫蛋白伤害的应激和抗逆反应。

骨形态发生蛋白9通过JNKs激酶途径调控间充质干细胞成骨分化

前期研究发现骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)除了通过经典Smad途径外,也可通过丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPKs)中的p38激酶途径调控间充质干细胞成骨分化.本研究继续探讨MAPKs的重要成员c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases,JNKs)对于BMP9诱导间充质干细胞成骨分化的调控作用.利用BMP9重组腺病毒感染间充质干细胞,通过体外细胞实验和体内动物实验,初步分析BMP9是否可通过JNKs激酶途径调控间充质干细胞成骨分化.结果表明:BMP9可通过促进JNKs激酶磷酸化而导致其活化;JNKs抑制剂SP600125可抑制由BMP9诱导的间充质干细胞的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性、骨桥蛋白(osteocpontin,OPN)和骨钙素(osteocalcin,OCN)表达以及钙盐沉积;利用抑制剂SP600125抑制JNKs激酶活性后,BMP9诱导Runx2的表达和转录活性,以及Smad经典途径的激活也相应受到抑制;RNA干扰导致JNKs基因沉默同样也可抑制BMP9诱导的间充质干细胞成骨分化以及裸鼠皮下异位成骨.因此,BMP9可通过活化JNKs激酶途径,从而调控间充质干细胞成骨分化.

丝裂原活化蛋白激酶ERKs和JNKs在脑缺血损伤中的差异激活及其调控机制(英文)

目的 探讨丝裂原活化蛋白激酶家族 (MAPK)两成员ERK1/2和JNK1/2在全脑缺血损伤中的激活及其可能的分子机制。 方法 采用四动脉结扎模型诱导SD大鼠前脑缺血 ,免疫印迹的方法观察ERK1/2和JNK1/2蛋白激酶特异性Thr和Tyr双位点磷酸化的变化及NMDA受体选择性拮抗剂对其双磷酸化的影响。结果 缺血诱导海马脑区MAPK家族蛋白激酶两成员显著去磷酸化 ,严重缺血 (30min)ERK1/2而不是JNK1/2活性反弹 ;缺血再灌注ERK1/2活性在 15min首先升至最高而JNK1/2 1h后才逐渐升至峰值 (P <0 .0 5 ) ,2 4h再灌注能诱导两者的再次激活 ,且氯胺酮能显著抑制缺血诱导的ERK1/2而不是JNK1/2的激活。 结论 前脑缺血明显诱导ERK1/2和JNK1/2的差异激活 ,提示两者可能分享不同的分子机制 ,其中ERK1/2的激活明显与NMDA受体功能上调有关。

MKK7-mediated phosphorylation of JNKs regulates the proliferation and apoptosis of human spermatogonial stem cells

BACKGROUND Human spermatogonial stem cells(SSCs)are the basis of spermatogenesis.However,little is known about the developmental regulatory mechanisms of SSC due to sample origin and species differences.AIM To investigates the mechanisms involved in the proliferation of human SSC.METHODS The expression of mitogen-activated protein kinase kinase 7(MKK7)in human testis was identified using immunohistochemistry and western blotting(WB).MKK7 was knocked down using small interfering RNA,and cell proliferation and apoptosis were detected by WB,EdU,cell counting kit-8 and fluorescenceactivated cell sorting.After bioinformatic analysis,the interaction of MKK7 with c-Jun N-terminal kinases(JNKs)was verified by protein co-immunoprecipitation and WB.The phosphorylation of JNKs was inhibited by SP600125,and the phenotypic changes were detected by WB,cell counting kit-8 and fluorescenceactivated cell sorting.RESULTS MKK7 is mainly expressed in human SSCs,and MKK7 knockdown inhibits SSC proliferation and promotes their apoptosis.MKK7 mediated the phosphorylation of JNKs,and after inhibiting the phosphorylation of JNKs,the phenotypic changes of the cells were similar to those after MKK7 downregulation.The expression of MKK7 was significantly downregulated in patients with abnormal spermatogenesis,suggesting that abnormal MKK7 may be associated with spermatogenesis impairment.CONCLUSION MKK7 regulates the proliferation and apoptosis of human SSC by mediating the phosphorylation of JNKs.

叶酸通过JNK/p38 MAPK信号通路调节小鼠C2C12成肌细胞分化

目的:观察叶酸(folic acid,FA)对小鼠C2C12成肌细胞增殖和分化的影响并探讨其作用机制。方法:(1)在小鼠C2C12成肌细胞增殖阶段,采用不同浓度(0、2.5、5、10和20μmol/L)的FA处理C2C12细胞,显微镜下观察各组细胞的状态,MTT法检测细胞活力,EdU法检测细胞增殖情况。(2)在小鼠C2C12成肌细胞分化阶段,将细胞分为对照(control,Ctrl)组(0μmol/L FA)和FA组(10μmol/L FA),于分化的第2天和第4天,采用免疫荧光染色和Western blot检测成肌细胞分化相关蛋白成肌细胞决定蛋白1(myoblast determination protein 1,MyoD)、成肌蛋白(myogenin,MyoG)和肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MyHC)的表达水平,并统计各组细胞肌管形成情况。(3)在小鼠C2C12成肌细胞分化第4天时,加入FA处理0、1、3和6 h,采用Western blot检测各时点c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、磷酸化JNK(phosphorylated JNK,p-JNK)、p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)和磷酸化p38 MAPK(phosphorylated p38 MAPK,p-p38 MAPK)蛋白水平。(4)将分化4 d的小鼠C2C12成肌细胞分为Ctrl组、FA组、SP600125(JNK特异性抑制剂)组、SB2035805(p38 MAPK特异性抑制剂)组、FA+SP600125组和FA+SB203580组。C2C12成肌细胞先接受10μmol/L的SP600125或SB203580处理1 h,再经10μmol/L的FA处理24 h,FA组经10μmol/L FA处理24 h,Ctrl组不作处理。采用Western blot检测p-JNK、JNK、p-p38 MAPK、p38 MAPK和MyHC蛋白水平。结果:(1)与0μmol/L FA组相比,其余各浓度组的细胞数量明显增多,细胞活力显著提高(P<0.05),EdU阳性细胞率均显著增加(P<0.05)。(2)与Ctrl组相比,FA组MyoD、MyoG和MyHC的表达水平均显著提高(P<0.05),肌管融合指数显著增加(P<0.05或P<0.01)。(3)与0 h组相比,FA处理1、3和6 h后p-JNK/JNK和p-p38 MAPK/p38 MAPK的比值均显著升高(P<0.05或P<0.01),且随着处理时间的延长,p-JNK/JNK和p-p38 MAPK/p38 MAPK的比值呈现逐渐升高的趋势。(4)与Ctrl组相比,FA组p-JNK、p-p38 MAPK和MyHC蛋白水平显著升高(P<0.01);与FA组相比,FA+SP600125组p-JNK和MyHC蛋白水平显著降低(P<0.05),FA+SB203580组p-p38 MAPK和MyHC蛋白水平显著降低(P<0.05或P<0.01)。结论:FA可以通过激活JNK/p38 MAPK信号通路促进小鼠C2C12成肌细胞分化。

“脾肾相赞”理论探讨不同治法对大鼠骨髓间充质干细胞成肌分化中TNF-α、JNK含量影响

目的在“脾肾相赞”理论指导下,比较不同中医治法对大鼠BMSCs成肌分化及过程中TNF-α、JNK蛋白表达的影响,分析中医治疗骨质疏松症的机制。方法将大鼠分为正常组、诱导组、补肾组、健脾组、补肾健脾组(随机数字表法),制备含药血清,选取第4代BMSCs进行实验,运用免疫荧光法分析各组成肌分化情况,酶联免疫吸附法检测TNF-α、JNK蛋白表达量。结果①BMSCs经诱导15d后,通过免疫荧光化学染色法检测MyoG荧光平均强度,结果显示:各组均显著高于正常组(P<0.01),补肾健脾组最高。②TNF-α蛋白检测:补肾组、补肾健脾组显著低于正常组(P<0.01)。③JNK蛋白检测:各组显著低于正常组(P<0.01)。结论①各治法中,补肾健脾法对大鼠BMSCs成肌分化的促进效果最佳,为通过脾肾、肌骨双方向治疗OP提供可能。②各中医治法均对大鼠BMSCs的成肌分化存在促进作用,这可能与降低TNF-α、JNK水平有关。

基于JNK通路探讨补肾活血方对大鼠骨关节炎软骨细胞凋亡的影响

目的 探讨补肾活血方(Bushen Huoxue Formula,BSHXF)通过c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)信号通路对大鼠骨关节炎(Osteoarthritis,OA)软骨细胞凋亡的影响。方法 采用白细胞介素-1β (interleukin-1β,IL-1β)诱导体外分离培养的大鼠软骨细胞构建体外OA模型,并使用不同浓度的BSHXF干预处理。使用MTT法测定细胞活力;CCK-8法检测细胞增殖能力;流式细胞术评估细胞凋亡情况;Western bolt检测凋亡相关蛋白裂解的胱天蛋白酶-3(Cleaved Caspase-3)、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma 2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)水平和JNK、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(phosphorylated c-Jun N-terminal kinase,p-JNK)蛋白水平。试剂盒检测细胞中活性氧(reactive oxygen species,ROS)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)水平;ELISA法检测细胞上清液中促炎因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)含量。结果 (1)与对照组相比,模型组软骨细胞活力显著降低,细胞凋亡率显著升高(P<0.01);模型组Cleaved Caspase-3、Bax、p-JNK蛋白表达水平显著升高(P<0.01),Bcl-2蛋白表达水平显著降低(P<0.01)。与模型组相比,BSHXF治疗组软骨细胞活力升高(P<0.05),凋亡率显著降低(P<0.01);BSHXF治疗组Cleaved Caspase-3、Bax、p-JNK蛋白表达水平显著降低(P<0.01),Bcl-2蛋白表达水平升高(P<0.01)。(2)与对照组相比,模型组细胞中ROS和MDA的相对含量显著升高(P<0.01),GSH的相对含量显著降低(P<0.01);模型组细胞中TNF-α和IL-6的含量均显著升高(P<0.01)。与模型组相比,BSHXF治疗组细胞中ROS和MDA的相对含量显著降低(P<0.01),GSH的相对含量显著升高(P<0.01);BSHXF治疗组细胞中TNF-α和IL-6的含量均显著降低(P<0.01)。(3)与溶剂对照组相比,激活剂对照组的p-JNK、Cleaved Caspase-3、Bax蛋白水平显著上调(P<0.05),Bcl-2蛋白表达水平显著降低(P<0.01),细胞增殖能力下降(P<0.05),细胞凋亡率显著增加(P<0.01);BSHXF治疗组和溶剂对照组两组间细胞增殖、凋亡率和凋亡相关蛋白表达(Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2)情况差异均无统计学意义(P>0.05)。(4)与溶剂对照组相比,激活剂对照组的ROS和MDA水平显著升高(P<0.01),而GSH水平显著降低(P<0.01),TNF-α、IL-6含量升高(P<0.05);BSHXF治疗组和溶剂对照组两组间ROS相对含量、MDA、GSH水平差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 BSHXF通过抑制JNK信号通路激活抑制IL-1β诱导的OA软骨细胞凋亡,改善氧化应激和炎症反应。

基于JNK-p62/SQSTM1信号通路探讨糖肾煎对2型糖尿病肾病大鼠足细胞的保护作用

目的 基于c-Jun氨基末端激酶(JNK)-p62/螯合体(SQSTM1)信号通路探讨糖肾煎对2型糖尿病肾病(DN)大鼠足细胞的保护作用。方法 SD大鼠随机分成正常组、DN组、糖肾煎低、中、高[生药5、10、20 g/(kg·d)]剂量组(糖肾煎-L、M、H组)、二甲双胍组[100 mg/(kg·d)]。除正常组外,其余各组通过喂养高脂高糖饲料和腹腔注射链脲佐菌素(STZ)进行DN模型构建。药物干预结束后,检测大鼠血生化指标空腹血糖(FBG)、负荷后2 h血糖(P2 h BG)、血肌酐(SCr)、血尿素氮(BUN)水平;苏木素-伊红(HE)、六胺银(PASM)染色观察肾组织病理学变化;透射电镜(TEM)观察肾小球基底膜损伤和足细胞变化情况;Western印迹检测肾组织中微管相关蛋白1A/1B-轻链(LC)3、p-JNK、JNK、p62/SQSTM1、肾病蛋白(Nephrin)蛋白表达。结果 与正常组比较,DN组FBG、P2 h BG、SCr、BUN水平及p62/SQSTM1蛋白表达明显升高,LC3-Ⅱ、Nephrin蛋白表达和p-JNK/JNK明显降低(P<0.05);光镜下观察到肾小球缩小、管丛系膜明显扩张,并有基底膜增生增厚等现象;TEM下观察到肾小球基底膜增厚、足细胞排列紊乱、形态改变、足突融合等现象。与DN组比较,糖肾煎-L、M、H组和二甲双胍组FBG、P2 h BG、SCr、BUN水平及p62/SQSTM1蛋白表达明显降低,LC3-Ⅱ、Nephrin蛋白表达和p-JNK/JNK明显升高(P<0.05);并且肾小球基底膜增厚、足细胞足突融合等情况均获得一定程度减轻。结论 糖肾煎对2型DN大鼠足细胞具有一定保护作用,可能是通过调控JNK-p62/SQSTM1信号通路,提高足细胞自噬,从而起到肾脏保护功效。

苦杏仁苷通过抑制JNK信号通路改善卒中后抑郁

目的研究苦杏仁苷通过抑制JNK信号通路对卒中后抑郁的改善作用。方法将56只健康SD大鼠随机分为假手术组(n=8)、造模1组(n=8)、造模2组(n=40),造模1组大鼠制备卒中模型,造模2组大鼠制备卒中后抑郁模型。造模成功后,卒中后抑郁模型大鼠随机分为卒中+抑郁组、卒中+抑郁+苦杏仁苷低剂量组(40 mg·kg^(-1))、卒中+抑郁+苦杏仁苷中剂量组(80 mg·kg^(-1))、卒中+抑郁+苦杏仁苷高剂量组(120 mg·kg^(-1))、卒中+抑郁+氟西汀组(1.8 mg·kg^(-1))。随后按相应剂量给药,连续给药30 d。观察大鼠Zea Longa评分,测定蔗糖水消耗量;H&E染色观察海马组织病理变化;TUNEL染色观察海马组织神经元细胞凋亡;透射电镜观察海马组织超微结构变化;Western blot检测海马组织PSD95、SYN、BDNF及JNK、p-JNK、c-Jun、p-c-Jun、cleaved-caspase 3、Bcl-2蛋白表达。结果与假手术组比较,卒中组、卒中+抑郁组大鼠Zea Longa神经行为学评分,细胞凋亡百分率,以及海马组织p-JNK、c-Jun、p-c-Jun、cleaved-caspase 3蛋白表达明显升高(P<0.05);蔗糖水消耗量,海马组织PSD95、SYN、BDNF、Bcl-2蛋白表达明显降低(P<0.05)。与卒中+抑郁组比较,卒中+抑郁+苦杏仁苷低剂量组、卒中+抑郁+苦杏仁苷中剂量组、卒中+抑郁+苦杏仁苷高剂量组、卒中+抑郁+氟西汀组大鼠Zea Longa神经行为学评分,细胞凋亡百分率,以及海马组织p-JNK、c-Jun、p-c-Jun、cleaved-caspase 3蛋白表达明显降低(P<0.05),蔗糖水消耗量、海马组织PSD95、SYN、BDNF、Bcl-2蛋白表达明显升高(P<0.05)。与卒中+抑郁+氟西汀组比较,卒中+抑郁+苦杏仁苷高剂量组大鼠Zea Longa神经行为学评分,细胞凋亡百分率,以及海马组织p-JNK、c-Jun、p-c-Jun、cleaved-caspase 3蛋白表达明显降低(P<0.05),海马组织PSD95、SYN、BDNF、Bcl-2蛋白表达明显升高(P<0.05)。结论苦杏仁苷改善卒中后抑郁样行为,可能与抑制海马JNK信号通路有关。

酸枣仁-合欢花对抑郁模型大鼠海马内质网应激IRE1α/ASK1/JNK通路的影响

目的基于内质网应激(ERS)肌醇依赖性激酶1α(IRE1α)/凋亡信号调节激酶1(ASK1)/c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路探讨酸枣仁-合欢花对孤养结合慢性不可预见性温和应激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)抑郁模型大鼠的干预作用。方法将144只大鼠随机分为正常组、模型组及酸枣仁-合欢花高、中、低剂量组和文拉法辛组。除正常组外,其他各组进行21 d的孤养结合CUMS制备大鼠抑郁模型。用旷场实验和Morris水迷宫实验观察大鼠行为学变化;用透射电镜观察海马神经细胞超微结构变化;用TUNEL染色法观察海马神经细胞凋亡情况;用Western Blot法检测海马组织IRE1α、磷酸化(P)-IRE1α、ASK1、P-ASK1、JNK、P-JNK、B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、胱天蛋白酶3(Caspase-3)蛋白表达水平;用Real-Time PCR法检测海马IRE1α、ASK1、JNK、Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表达水平。结果与正常组比较,模型组旷场实验中水平运动和垂直运动得分下降(P<0.01);水迷宫实验中逃避潜伏期增加、跨越原平台次数减少(P<0.01);海马神经细胞凋亡数增加(P<0.01);海马P-IRE1α/IRE1α、P-ASK1/ASK1、P-JNK/JNK、Bax、Caspase-3蛋白及IRE1α、ASK1、JNK、Bax、Caspase-3 mRNA表达水平升高、Bcl-2蛋白及mRNA表达水平降低(P<0.01)。与模型组比较,酸枣仁-合欢花各组及文拉法辛组旷场实验中水平运动和垂直运动得分升高(P<0.01);水迷宫实验中逃避潜伏期缩短、跨越原平台次数增加(P<0.01);海马神经细胞凋亡数减少(P<0.01);海马P-IRE1α/IRE1α、P-ASK1/ASK1、P-JNK/JNK、Bax、Caspase-3蛋白及IRE1α、ASK1、JNK、Bax、Caspase-3 mRNA表达水平降低,Bcl-2蛋白及mRNA表达水平升高(P<0.05,P<0.01),且酸枣仁-合欢花中剂量组较高、低剂量组效果更好。结论酸枣仁-合欢花可能通过调节内质网应激IRE1α/ASK1/JNK通路发挥抗抑郁作用。

槲皮素通过介导JNK信号通路抑制线粒体凋亡途径的神经保护作用

目的研究槲皮素(quercetin,Que)通过调节JNK信号通路抑制Aβ25-35引起PC12细胞线粒体损伤的作用机制。方法培养PC12细胞,使用Aβ25-35诱导其构建阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)受损模型,Que、17β-雌二醇(17β-E2)和金雀异黄素(genistein,Gen)进行干预,并设定SP600125(JNK特异性抑制剂)预处理组。Fluo-4 AM染料荧光检测PC12细胞钙离子;Rhodamine123染色液检测PC12细胞线粒体膜电位;Caspase-3活性检测Caspase-3酶活性;免疫荧光检测p-JNK蛋白表达;Western blot法检测ERα、ERβ、p-JNK、JNK、Bcl-W、Bim和Cytochrome C蛋白表达。并使用雌激素受体α/β拮抗剂MPP/PHTPP和SP600125进行干预,探讨Que发挥神经保护介导的分子机制。结果与Aβ25-35组相比,Aβ25-35+Que组能提高线粒体膜电位(P<0.01);降低钙离子浓度(P<0.01)。免疫荧光、Caspase-3检测和Western blot结果显示,与Aβ25-35组相比,Que可以逆转Aβ25-35诱导的ERα表达降低(P<0.01),当加入MPP抑制Que与雌激素受体α结合后,Caspase-3表达增加(P<0.05);Que抑制p-JNK表达(P<0.01);降低促凋亡蛋白Bim的表达(P<0.01),减少Cyt C的释放(P<0.01),促进抗凋亡蛋白Bcl-W的表达(P<0.01),当加入SP600125后,Que对Bcl-W、Bim和Cyt C的作用和SP600125对Aβ25-35诱导PC12细胞线粒体凋亡途径的保护作用机制相同(P<0.01)。结论Que可通过介导JNK信号通路抑制线粒体凋亡,进而发挥神经保护作用。

氟暴露对大鼠心肌组织凋亡的影响

目的:探究慢性氟中毒对心肌的毒性作用及其对JNK介导的凋亡影响。方法:将Wistar大鼠随机分为4组,分别为对照组及不同浓度的氟化钠溶液(50、100、200 mg·L^(-1) NaF)处理组,各处理组大鼠自由饮用各自浓度的氟化钠溶液,对照组大鼠饮用去离子水。4个月后获得慢性氟中毒大鼠模型,通过HE染色法比较不同浓度NaF对大鼠心肌组织结构的影响,观察心肌组织的损伤情况;使用Western blot法对心肌组织凋亡相关蛋白的表达进行检测,观察NaF对凋亡蛋白表达量的影响,主要包括p-JNK、Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表达情况。结果:4个月后建立了慢性氟中毒大鼠模型,氟中毒各组大鼠心肌组织出现肌纤维结构紊乱、肌纤维断裂、肌细胞萎缩、肌间隙增宽、横纹消失等;Western blot检测的结果表明,与对照组相比,慢性氟中毒各组大鼠心肌Bcl-2蛋白表达量明显降低(P<0.05),Bax、Caspase-3和p-JNK的蛋白表达明显上调(P<0.05)。结论:慢性氟中毒可能通过激活JNK信号通路引起心肌凋亡,细胞凋亡参与了氟对心肌组织的损伤。

氟中毒大鼠脑组织中NMDA受体及内质网应激相关通路蛋白的表达

背景:前期研究发现N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDA)受体与氟相关,但其在氟诱导的内质网应激中的作用尚不明确。目的:观察实验性氟中毒大鼠脑组织中兴奋性神经递质NMDA受体及内质网应激IRE1α-ASK1-JNK通路蛋白表达变化,并应用NMDA受体抑制剂干预SH-SY5Y细胞,探讨氟中毒神经系统损伤的发病机制。方法:(1)动物模型:18只1月龄SD大鼠随机分为对照组(饮水含氟量<0.5 mg/L)、低氟组(饮水含氟量为10.0 mg/L)、高氟组(饮水含氟量为100.0 mg/L),每组6只,雌雄各半。饮水摄氟饲养6个月后,观察大鼠氟斑牙发生情况,测定24 h尿氟含量;大鼠麻醉处死后取脑组织观察组织病理变化,蛋白印迹法检测脑组织中NMDA受体及IRE1α、ASK1、JNK蛋白表达。(2)细胞模型:体外培养SH-SY5Y细胞,选择终浓度为0.3 mmol/L和3 mmol/L的氟化钠染氟处理,并用10μmol/L的NMDA受体拮抗剂Ifenprodil、MK-801对染氟细胞进行干预,观察相关蛋白改变。结果与结论:(1)高氟组大鼠氟斑牙发生率、尿氟水平显著高于对照组和低氟组(P<0.05);(2)与对照组相比,低氟组大鼠海马CA3区神经细胞胞质嗜碱性略增加,高氟组CA3区神经细胞排列紊乱,嗜碱性增加,部分细胞核固缩;(3)大鼠脑组织内,高氟组NR2A与低氟组NR2B的蛋白表达明显高于对照组(P<0.05),且高氟组NR2B、IRE1、ASK1、p-JNK蛋白表达明显高于对照组和低氟组(P<0.05);(4)SH-SY5Y细胞内,高氟组NR1、NR2A、NR2B蛋白表达明显高于对照组(P<0.05),且高氟+Ifenprodil组、高氟+MK-801组NR1、NR2A蛋白表达均明显低于高氟组(P<0.05),高氟+Ifenprodil组NR2B蛋白表达也明显低于高氟组(P<0.05);(5)SH-SY5Y细胞内,高氟组IRE1、ASK1、p-JNK蛋白表达明显高于对照组(P<0.05),且高氟+Ifenprodil组、高氟+MK-801组ASK1、p-JNK蛋白表达均明显低于高氟组(P<0.05),高氟+Ifenprodil组IRE1蛋白水平也明显低于高氟组(P<0.05);(6)提示:过量氟摄入可激活中枢神经系统NMDA受体,引起内质网应激IRE1α、ASK1、p-JNK蛋白表达增加,使用NMDA受体抑制剂对氟中毒所致内质网应激具有一定缓解作用。

基于JNK/AP-1信号通路探讨广西毛冬青在放射性脑损伤中的作用机制

目的:探讨广西毛冬青(IPH)对放射性脑损伤的改善作用及其机制。方法:将40只SPF级昆明小鼠随机分为对照组、IPH、放射组和放射+IPH组,每组10只。采用γ射线建立放射性脑损伤模型,放射前、后连续灌胃给药14 d。采用Morris水迷宫实验、避暗实验检测小鼠认知功能,苏木精—伊红(HE)染色和尼氏染色观察脑组织病理形态变化,电镜观察胶质细胞超微结构,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清白介素-6(IL-6)水平,免疫组织化学染色法检测脑组织c-Jun氨基末端激酶(JNK)、磷酸化(p-)JNK、激活蛋白-1(AP-1)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)蛋白表达,免疫荧光检测脑组织星型胶质细胞标记物GFAP和小胶质细胞标记物Iba-1蛋白表达,western blotting法检测脑组织JNK和p-JNK蛋白表达。结果:与对照组相比,放射组小鼠放射后7 d体重减低,血清IL-6含量升高,脑组织AP-1、MCP-1表达水平及p-JNK/JNK比值升高,小胶质细胞Iba-1和GFAP表达水平升高(均P<0.05)。与放射组比较,放射+IPH组小鼠放射后7 d体重增加,血清IL-6含量降低,脑组织AP-1、MCP-1表达水平及p-JNK/JNK比值降低,小胶质细胞Iba-1和GFAP表达水平降低(均P<0.05)。HE染色和尼氏染色显示,放射组大量细胞和神经元出现核固缩现象,小胶质细胞激活,呈圆形;电镜下可见细胞内溶酶体增多,星形胶质细胞细胞核及胞质肿胀;经IPH干预后,小鼠脑组织神经元变性情况和胶质细胞形态明显改善。结论:广西IPH能改善放射性脑损伤小鼠的认知功能,减少小胶质细胞和星形胶质细胞激活,其机制可能与减轻神经炎症反应、抑制JNK/AP-1信号通路有关。

扶正化瘀方对马兜铃酸Ⅰ诱导肾小管上皮细胞损伤的影响

目的探讨扶正化瘀方对马兜铃酸Ⅰ诱导的肾小管上皮细胞HK-2损伤的保护作用。方法以不同浓度马兜铃酸Ⅰ孵育HK-2细胞24 h,确定最佳造模浓度。HK-2细胞分为正常组、模型组、N-乙酰半胱氨酸组及扶正化瘀方低、高剂量组,模型组以400μmol/L马兜铃酸Ⅰ分别孵育6、12、24 h,扶正化瘀方低、高剂量组及N-乙酰半胱氨酸组分别以100、200μg/mL扶正化瘀方浸膏粉及5 mmol/L N-乙酰半胱氨酸孵育24 h。CCK8法检测细胞活力,试剂盒测定细胞上清LDH活性,RT-qPCR法检测fos mRNA表达,免疫荧光法检测细胞FOS蛋白表达,Western blot法检测细胞FOS、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK、IL-1β蛋白表达。结果HK-2细胞活力随着马兜铃酸Ⅰ处理时间延长而降低,细胞损伤逐渐加重(P<0.01)。与溶剂对照组比较,马兜铃酸Ⅰ作用后HK-2细胞fos mRNA表达及FOS、p-JNK、p-ERK、IL-1β蛋白表达升高(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,扶正化瘀方各剂量组和N-乙酰半胱氨酸组细胞活力升高(P<0.05,P<0.01),fos mRNA表达及FOS、p-JNK、p-ERK蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01),JNK、ERK蛋白表达无明显变化(P>0.05);扶正化瘀方高剂量组和N-乙酰半胱氨酸组细胞IL-1β表达降低(P<0.01)。结论扶正化瘀方可通过抑制FOS及p-JNK、p-ERK蛋白表达,抑制炎症因子释放,从而改善马兜铃酸Ⅰ诱导的HK-2细胞损伤。

姜黄素通过抑制JNK介导的炎症缓解慢性束缚应激诱导的大鼠心脏功能障碍

目的:探讨姜黄素对慢性束缚应激抑郁模型大鼠心功能障碍的影响。方法:将32只重(200±20)g的6周龄雄性Wister大鼠分为对照组、模型组、低剂量姜黄素组和高剂量姜黄素组,每组8只。模型组和给药组大鼠每天随机时段给予慢性束缚应激5 h,对照组大鼠正常条件饲养;在每天的应激结束后,低、高剂量姜黄素组大鼠分别给予100和200 mg/kg的姜黄素灌胃,对照组和模型组大鼠则给予等体积的生理盐水。上述实验操作均连续28 d。实验期间每周称量一次体重;在第14和28天进行蔗糖偏好实验和测量血清皮质酮含量来评价大鼠的抑郁状况;HE和Masson染色法观察心肌组织学变化;超声心动图检查各组大鼠心脏功能;RT-qPCR检测炎症因子和纤维化因子的mRNA表达;Western blot检测相关蛋白的表达。结果:与对照组相比,模型组大鼠体重增长显著减缓(P<0.05),蔗糖偏好率显著降低(P<0.01),血浆皮质酮水平显著升高(P<0.01);HE染色结果显示,与对照组相比,模型组大鼠心肌细胞肥大;Masson染色发现,模型组大鼠心脏纤维化显著高于对照组(P<0.01);免疫组化结果也表明,I型胶原阳性表达显著增加(P<0.01);RT-qPCR结果显示,与对照组相比,模型组大鼠心肌组织中炎症因子(肿瘤坏死因子α、白细胞介素6和白细胞介素1β)和纤维化因子(α-平滑肌肌动蛋白、I型胶原和III型胶原)表达水平均显著升高(P<0.05或P<0.01);Western blot结果显示,与对照组相比,模型组大鼠心肌组织中c-Jun氨基末端激酶(JNK)蛋白的磷酸化水平显著升高(P<0.01)。与模型组相比,低、高剂量姜黄素均可逆转上述指标。结论:姜黄素能抑制慢性束缚应激大鼠的心脏炎症和纤维化,其机制可能是通过抑制JNK信号通路实现的。

隐丹参酮通过TLR4/NF-κB/JNK信号通路减轻脂多糖对肺泡上皮细胞炎性损伤的作用研究

目的 本研究旨在探讨隐丹参酮(CTS)对脂多糖(LPS)诱导的肺泡上皮细胞(MLE-12)的影响。方法 通过CCK-8法检测细胞活力,酶联免疫吸附试验(ELISA)和实时荧光定量PCR(q-PCR)检测IL-1β、IL-6、TNF-α含量及基因表达水平,筛选出具有最佳造模效果的LPS浓度;之后通过CCK-8考察CTS对细胞的非毒性剂量范围;将试验分为对照组、LPS组和CTS+LPS组3个组,ELISA检测细胞上清中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量,qPCR检测细胞内IL-1β、IL-6、TNF-α、Bax和Bcl-2基因表达水平,Western Blot检测Bax、Bcl-2、TLR4、p-p65和p-JNK蛋白水平。结果 与对照组相比,LPS浓度≥1.0μg/mL时细胞活力显著下降(P<0.01);2.0和5.0μg/mL LPS组IL-1β、IL-6和TNF-α含量及基因表达水平显著上升(P<0.05);CTS浓度为0~5.0μM时,细胞活力无显著变化(P>0.05),即药物的无毒范围。与LPS组相比,CTS+LPS组IL-1β、IL-6和TNF-α含量及基因表达水平显著下降(P<0.05);CTS+LPS组Bax蛋白及基因表达水平显著下降(P<0.01)、Bcl-2蛋白及基因表达水平显著上升(P<0.05)。另外,与对照组相比,LPS组TLR4、p-p65、p-JNK蛋白水平显著上升(P<0.01);与LPS组相比,CTS+LPS组TLR4、p-p65、p-JNK蛋白水平显著下降(P<0.01)。结论 CTS可能通过抑制TLR4/NF-κB/JNK信号通路减轻LPS诱导的MLE-12细胞炎性损伤作用。

基于网络药理学和动物实验探讨马齿苋对变应性接触性皮炎小鼠皮肤瘙痒的作用

目的基于网络药理学结合动物实验探讨马齿苋对变应性接触性皮炎(ACD)皮肤瘙痒的作用机制。方法利用中药系统药理数据库(TCMSP)筛选马齿苋的活性成分及靶点,GeneCards、TTD、OMIM数据库获取ACD和皮肤瘙痒的靶点,Venny2.1平台获取马齿苋与ACD及皮肤瘙痒的交集靶点,STRING数据库分析交集蛋白间的相互作用关系,Cytoscape构建药物-成分-疾病靶点网络以及重要靶点相互作用图,DAVID数据库进行GO及KEGG富集分析。60只BALB/c小鼠随机分为空白组、模型组、糠酸莫米松乳膏组、空白基质乳膏组和马齿苋低、高剂量乳膏组,每组10只,除空白组外,各组运用2,4-二硝基氯苯(DNCB)构建ACD皮肤瘙痒模型,各组给予相应乳膏外涂14 d后观察小鼠背部皮损以及抓挠情况,HE染色观察皮肤病理损伤,ELISA法检测血清IL-6、CXCL8水平,Western blot法检测皮肤组织TNF-α、JNK、p-JNK、c-Jun、p-c-Jun蛋白表达。结果网络药理学分析得到马齿苋活性成分181个,ACD靶点1314个,皮肤瘙痒靶点4113个,三者相交靶点103个,核心靶点有TNF-α、c-Jun、IL-6、CXCL8等,涉及TNF-α、脂质与动脉粥样硬化、癌症等信号通路。动物实验表明马齿苋可减轻ACD小鼠背部皮损以及抓挠次数,下调血清IL-6、CXCL8水平以及皮肤组织TNF-α、JNK、p-JNK、c-Jun、p-c-Jun蛋白表达(P<0.05,P<0.01)。结论马齿苋可以通过多成分、多靶点、多通路干预ACD发生发展,其作用机制可能与抑制TNF-α/JNK/c-Jun信号通路,减少炎性介质IL-6、CXCL8释放,缓解皮肤瘙痒有关。

小黄鱼jnk1和jnk2基因克隆及响应高温应激的表达特征分析

JNKs(c-Jun氨基末端激酶)具有调节细胞凋亡的功能,可对多种细胞外信号刺激产生反应。为研究高温对小黄鱼(Larimichthys polyactis)肝脏细胞凋亡的调控机制,对细胞凋亡相关基因jnk进行研究。以NCBI中大黄鱼(Larimichthys crocea)jnk1和jnk2的CDS序列作为参照,克隆获得小黄鱼这两个基因的CDS序列。通过生物信息学分析,发现小黄鱼jnk1 ORF(开放阅读框)序列共1155 bp,编码384个氨基酸;jnk2 ORF序列共1263 bp,编码420个氨基酸。通过对结构域进行预测,发现jnk1与jnk2均有一个保守的STKc结构域和一个双磷酸化TPY催化位点。序列比对和系统进化结果分析表明,小黄鱼jnk1与jnk2均与大黄鱼亲缘关系较为接近。利用三级结构分析,发现jnk1与jnk2结构均比较保守。利用实时荧光定量方法检测jnk1与jnk2在组织中的分布情况,结果表明小黄鱼jnk1与jnk2在脑中的表达量最高。进一步分析jnk1与jnk2在高温处理不同时间的小黄鱼肝脏中的表达模式,发现随着高温处理时间的增加,jnk1表达量未发生显著变化;而jnk2在水温达到32℃时,其表达量即显著高于对照组,随着高温处理时间的增加,基因表达量逐渐下降,说明jnk2在高温胁迫过程中发挥了重要的调节作用。研究结果为探究小黄鱼肝脏响应高温胁迫及细胞凋亡的分子机制提供了分析基础。

饲料不同锌源对草鱼幼鱼肌肉锌转运和发育的影响

为了探究饲料中添加不同锌源对草鱼幼鱼肌肉发育的影响,实验以草鱼(Ctenopharyngodon idella)幼鱼为研究对象,共设置5组饲料,分别为对照组(Control,不添加任何锌源)、硫酸锌组(ZnSO_(4))、纳米氧化锌组(ZnO NPs)、乳酸锌组(Zn-Lac)和甘氨酸锌组(Zn-Gly),养殖实验共持续8周。结果表明,饲喂4种锌源饲料的草鱼肌肉肌纤维直径相较于对照组增加,其中以甘氨酸锌组草鱼肌肉直径>50μm的肌纤维频率最高。锌转运相关基因测定结果显示,硫酸锌组、纳米氧化锌组、乳酸锌组和甘氨酸锌组相较于对照组显著影响了部分锌转运相关基因mRNA的表达(P<0.05),同时硫酸锌相较于其他锌源对于锌转运相关基因表达的调控有更显著的影响(P<0.05);与对照组相比,硫酸锌组、纳米氧化锌组、乳酸锌组和甘氨酸锌组mef2d、myod和myog的mRNA表达量显著增加(P<0.05),在不同锌源组之间比较时,甘氨酸锌组myod的mRNA表达量显著高于其他组。根据MAPK/JNK信号通路关键因子基因测定结果,硫酸锌组、纳米氧化锌组、乳酸锌组和甘氨酸锌组会显著增加map2k7、map3k2和jnk基因mRNA的表达(P<0.05),其中,甘氨酸锌组map2k7基因mRNA表达显著高于其他锌源组。研究表明,以甘氨酸锌作为锌源添加到饲料中更有利于草鱼的肌肉发育,MAPK/JNK信号通路可能介导这一重要的生物学过程。研究为深入探讨甘氨酸锌对鱼类肌肉发育的作用提供了理论依据,为甘氨酸锌在鱼类饲料中的应用奠定基础。