JS-K对HBV阳性肝癌鸡胚移植瘤生长影响的实验研究

目的:在乙型肝炎病毒(HBV)阳性肝癌鸡胚移植模型中,探讨一氧化氮供体JS-K对肿瘤细胞生长的影响。方法:将HBV阳性肝癌细胞HepG2.2.15接种于9日龄受精鸡胚中,按照处理方式不同分为5组:阴性对照组,JS-K低、中、高剂量组(1、5、10μg/个),索拉非尼(Sora)组(400μg/个),每组各3只。2 d后按分组给药,给药采用直接滴加于移植瘤上的方式,1次/d,连续8 d。实验结束后取出鸡胚移植瘤,观察各组移植瘤大小,拍照并称重,采用HE染色法观察各组JS-K对肿瘤细胞的影响;采用免疫印迹法检测肿瘤组织中迁移相关蛋白Vimentin及N-Cadherin的表达情况。结果:与对照组相比,不同剂量JS-K作用后,鸡胚移植瘤体积均明显减小,其中JS-K高剂量组肿瘤体积最小(P<0.05);HE染色可见JS-K作用后瘤细胞数量明显减少;JS-K低剂量组鸡胚移植瘤波形蛋白Vimentin表达水平高于其他组,N-cadherin表达水平低于其他组(P<0.05)。结论:JS-K对HBV阳性肝癌鸡胚移植瘤具有抑瘤作用,该效应可能与抑制鸡胚移植瘤细胞迁移有关。

JS-K对口腔鳞状细胞癌H157和CAL-27细胞增殖与凋亡的影响及机制实验研究

目的:探讨一氧化氮(NO)前体化合物(JS-K)对口腔鳞状细胞癌(OSCC)H157和CAL-27细胞增殖与凋亡的影响,并分析相关机制。方法:采用细胞活力与平板克隆实验检测JS-K对OSCC细胞增殖能力的影响。采用流式细胞术检测细胞周期与细胞凋亡,以及半胱氨酸蛋白酶3/7(Caspase-3/7)活性测定评估JS-K对OSCC细胞周期与凋亡的影响。检测JS-K干预后OSCC细胞中ROS生成情况。采用亚细胞分离技术与Western blot探索JS-K诱导OSCC细胞周期停滞与细胞凋亡的机制。结果:JS-K通过p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路抑制OSCC细胞的增殖,诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞。此外,JS-K激活的p38 MAPK信号通路导致OSCC细胞中ROS增加,并诱导细胞周期阻滞在G_(2)/M期。结论:JS-K通过p38 MAPK信号通路调控ROS,诱导OSCC细胞周期阻滞在G_(2)/M期并凋亡,最终抑制OSCC细胞增殖。JS-K可能为一种治疗OSCC的潜在药物。

偶氮鎓二醇盐衍生物JS-K通过MEK/ERK通路抑制肝纤维化抗大鼠肝癌

目的探讨偶氮鎓二醇盐衍生物O2(2,4-二硝基苯基)1-((4-乙氧羰基)哌嗪-1-yl)偶氮-1-鎓-1,2-二醇(JS-K)对大鼠原发性肝癌的影响。方法Wistar雄性大鼠40只,随机分为正常对照组(ip,生理盐水10 mL·kg^-1,连续16周)、模型组(ip,二乙基亚硝胺(DEN)50 mg·kg^-1,前4周每周2次,4周后每周1次,连续16周)、JS-K 0.25和0.50 mg·kg^-1组((ip,DEN 50 mg·kg^-1)+(尾静脉注射,JS-K 0.25或0.50 mg·kg^-1),每周2次,在DEN注射后第2天给药,连续16周)。计数大鼠肝肿瘤结节数并称量瘤质量;比色法测定血清γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)和碱性磷酸酶(AKP)活性及羟脯氨酸含量;HE染色观察肝组织病理变化;ELISA检测血清甲胎蛋白(AFP)、甲胎蛋白异质体3(AFP-L3)和异常凝血酶原(APT)含量;Gomori银染法检测肝组织网状纤维水平;免疫组化法检测肝组织中磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK)蛋白的表达;Western印迹法检测肝组织中促细胞丝裂原细胞外激酶(MEK)/细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路相关蛋白表达水平。结果给药16周后,与正常对照组相比,模型组肝肿瘤结节数和瘤质量显著增加,血清γ-GT和AKP活性及羟脯氨酸含量明显升高(P<0.01);肝小叶结构破坏区域增加,细胞出现多核、核固缩、核内空泡等现象;AFP,AFP-L3和APT水平明显升高(P<0.05,P<0.01);网状纤维塌陷、融合、包裹形成假小叶;肝组织ERK,MEK和P90RSK磷酸化水平均明显升高(P<0.01)。与模型组相比,JS-K各给药组大鼠肝肿瘤结节数和瘤质量显著减少(P<0.05,P<0.01);血清中γ-GT和AKP活性及羟脯氨酸含量明显降低(P<0.01);肝小叶结构相对较好,癌细胞分化程度高;AFP,AFP-L3和APT含量明显降低(P<0.05,P<0.01);网状纤维阳性表达区显著减少(P<0.01),大鼠肝组织ERK,MEK和P90RSK蛋白磷酸化水平显著降低(P<0.01)。结论偶氮鎓二醇盐衍生物通过抑制MEK/ERK通路干预肝纤维化进程,从而对大鼠原发性肝癌具有一定的抑制作用。

NO前体药物JS-K体外对乙肝病毒HBsAg和HBeAg的影响

目的观察一氧化氮前体药物JS-K体外对乙肝病毒HBs Ag和HBe Ag的影响。方法以携带有HBV基因组的Hep G2.2.15细胞作为研究工具,MTT法检测JS-K(0、1、2、5、10μM)对细胞的毒性作用;荧光染色检测JS-K作用于细胞后一氧化氮的释放情况;ELISA及免疫荧光结合激光共聚焦显微镜检测的方法,检测不同浓度JS-K对细胞中HBs Ag和HBe Ag表达的影响。结果包括最高浓度组(10μM)在内的各浓度JS-K对细胞均无统计学意义(P>0.05);JS-K作用于细胞24 h后,细胞内一氧化氮的释放明显增多;随着JS-K浓度的增高,HBs Ag的表达明显降低,HBe Ag的表达有一定的减少。结论一氧化氮前体药物JS-K在体外对乙肝病毒的抗原有一定的抑制作用。

一氧化氮供体JS-K通过蛋白磷酸酶2A调控磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路诱导人肝癌HepG2细胞凋亡

目的研究一氧化氮(NO)供体JS-K经蛋白磷酸酶2A(PP2A)调控磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的机制。方法设立细胞对照组(二甲亚砜<0.01%)、JS-K 2.5,5.0和10.0μmol·L^(-1)组、LY294002(PI3K抑制剂)10μmol·L^(-1)组、冈田酸(OA)(PP2A抑制剂)1 nmol·L^(-1)组、2-(4-羧苯基)-4,4,5,5-四甲基咪唑烷-1-氧-3-氧化钾(羧基-PTIO)50μmol·L^(-1)组、JS-K10.0μmol·L^(-1)+LY294002 10μmol·L^(-1)组、JS-K 10.0μmol·L^(-1)+OA 1 nmol·L^(-1)组和JS-K 10.0μmol·L^(-1)+羧基-PTIO 50μmol·L^(-1)组,处理HepG2细胞24 h,DAPI染色观察细胞形态学变化;流式细胞仪检测细胞凋亡率;Western印迹法检测PP2A蛋白磷酸化水平及PI3K、Akt和雷帕霉素靶蛋白(mTOR)蛋白磷酸化水平。结果DAPI染色结果显示,与细胞对照组相比,JS-K 2.5~10.0μmol·L^(-1)组、JS-K 10.0μmol·L^(-1)+LY294002 10μmol·L^(-1)组、JS-K 10.0μmol·L^(-1)+OA 1 nmol·L^(-1)组和JS-K 10.0μmol·L^(-1)+羧基-PTIO50μmol·L^(-1)组具有细胞染色质浓缩、核碎裂等凋亡特征的细胞数增加。与JS-K 10.0μmol·L^(-1)组相比,JS-K 10.0μmol·L^(-1)+LY294002 10μmol·L^(-1)组凋亡特征的细胞数增加,JS-K 10.0μmol·L^(-1)+OA 1 nmol·L^(-1)组和JS-K 10.0μmol·L^(-1)+羧基-PTIO 50μmol·L^(-1)组凋亡特征的细胞数减少。流式结果显示,与细胞对照组相比,JS-K 2.5~10.0μmol·L^(-1)、JS-K 10.0μmol·L^(-1)+LY294002 10μmol·L^(-1)组、JS-K 10.0μmol·L^(-1)+OA1 nmol·L^(-1)组和JS-K 10.0μmol·L^(-1)+羧基-PTIO 50μmol·L^(-1)组细胞凋亡率明显增加(P<0.01)。与JS-K10.0μmol·L^(-1)组相比,JS-K 10.0μmol·L^(-1)+LY294002 10μmol·L^(-1)组细胞凋亡率显著升高(P<0.05),JS-K10.0μmol·L^(-1)+OA 1 nmol·L^(-1)组、JS-K 10.0μmol·L^(-1)+羧基-PTIO 50μmol·L^(-1)组细胞凋亡率显著下降(P<0.01)。Western印迹法结果显示,与细胞对照组相比,OA 1 nmol·L^(-1)组PP2A蛋白磷酸化水平显著升高(P<0.05),JS-K 2.5,5.0和10.0μmol·L^(-1)组、JS-K 10.0μmol·L^(-1)+LY294002 10μmol·L^(-1)组、JS-K 10.0μmol·L^(-1)+OA 1 nmol·L^(-1)组和JS-K 10.0μmol·L^(-1)+羧基-PTIO 50μmol·L^(-1)组PP2A蛋白磷酸化水平显著降低(P<0.05,P<0.01);PI3K,Akt和mTOR蛋白磷酸化水平均显著降低(P<0.05,P<0.01)。与JS-K 10.0μmol·L^(-1)组相比,JS-K 10.0μmol·L^(-1)+OA 1 nmol·L^(-1)组和JS-K 10.0μmol·L^(-1)+羧基-PTIO 50μmol·L^(-1)组PP2A蛋白磷酸化水平显著增加(P<0.01);JS-K 10.0μmol·L^(-1)+LY294002 10μmol·L^(-1)组PI3K、Akt和mTOR蛋白磷酸化水平显著降低(P<0.05),JS-K 10.0μmol·L^(-1)+OA 1 nmol·L^(-1)组、JS-K 10.0μmol·L^(-1)+羧基-PTIO50μmol·L^(-1)组细胞PI3K,Akt和mTOR蛋白磷酸化水平均显著升高(P<0.05,P<0.01)。结论 NO供体JS-K通过在HepG2细胞内释放NO,降低PP2A磷酸化水平而活化PP2A,进一步降低PI3K,Akt和mTOR蛋白磷酸化水平,抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路而诱导肝癌细胞凋亡。

JS-K的抗肿瘤作用研究进展

肿瘤已经成为当今社会的重大健康问题,作为抗肿瘤药物开发的一氧化氮供体药JS-K在这方面引人注目,其具有广谱的抗肿瘤活性。到目前为止,已有研究表明JS-K在白血病、多发性骨髓瘤、肝癌、肺癌和乳腺癌等多种肿瘤细胞中有良好的抗肿瘤作用,也有研究表明JS-K具有对正常细胞几乎没有杀伤作用的特点,本课题组前期研究发现JS-K也具有抗病毒的作用,并对乙肝病毒转染的HepG2.2.15细胞有很好的生长抑制作用。本文通过查阅国内外相关文献,对JS-K的抗肿瘤研究进展作一综述,以期为JSK对抗病毒引起的肝肿瘤的研究提供一定的参考和借鉴。

一氧化氮前体药JS-K安全性的初步观察

目的一氧化氮前体药,JS-K体内外均具有良好的抗肿瘤效应,但其毒性研究却鲜有报道。本文初步观察了小鼠长期口服和短期皮下注射JS-K的毒性,旨在为JS-K的后续研究提供毒性方面的实验依据。方法雄性昆明小鼠40只,随机分为溶酶(等容量羧甲基纤维素钠,CMC)对照组、JS-K低(2.5 mg/kg)、中(5 mg/kg)和高剂量(10 mg/kg)组。连续口服给药3个月,观察小鼠的生长状况、体重,计算肝肾脏器指数,检测肝肾功能及肝肾组织病理学。另10只小鼠随机分为生理盐水对照组和JS-K 5 mg/kg组,每天皮下注射给药,连续5 d,检测小鼠骨髓和外周血造血干细胞的比率。结果 JS-K口服或皮下注射给药与对照组小鼠比较,给药和对照组动物在试验期间均生长状态良好、体重增加;肝和肾脏指数及肝肾功能与对照组之间无明显差异(P>0.05),均在正常范围;HE染色没有发现JS-K产生明显肝肾毒性;小鼠骨髓造血干细胞中阳性细胞的比率,对照组2.19%,JS-K组1.98%;外周血造血干细胞中阳性细胞比率,对照组为0.110 6%,JS-K组0.128 3%,两组间无明显差异(P>0.05)。结论小鼠连续口服JS-K 3个月(最高剂量10mg/kg)没有发现对肝肾产生明显的毒性,对小鼠的生长未见明显影响;小鼠连续皮下注射JS-K(5 mg/kg)5 d,对骨髓造血功能没有明显的影响。

一氧化氮供体JS-K联合阿司匹林促进人肝细胞癌细胞凋亡

目的研究一氧化氮供体(JS-K)与阿司匹林联合用药协同诱导人肝细胞癌(肝癌)HepG2和SMMC7721细胞凋亡的作用。方法人肝癌HepG2和SMMC7721细胞分别设立细胞对照组(只加等量二甲亚砜,终浓度<0.01%)、JS-K 5μmol·L^(-1)组、阿司匹林5,10和20 mmol·L^(-1)组、JS-K 5μmol·L^(-1)+阿司匹林5,10,20 mmol·L^(-1)组。MTT法检测细胞增殖抑制率并计算联合用药指数(CI);倒置显微镜下观察细胞形态;AnnexinⅤ-FITC/PI双染法测定细胞凋亡率。2种细胞分为6组:细胞对照、JS-K 5μmol·L^(-1)、阿司匹林20 mmo·L^(-1)、Z-VAD-FMK 50μmol·L^(-1)、JS-K+阿司匹林和JS-K+阿司匹林+Z-VAD-FMK组,给药后处理24 h。DAPI染色观察细胞核形态变化;Western印迹法检测活化胱天蛋白酶9、活化胱天蛋白酶3和活化多腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)蛋白表达。结果与JS-K 5μmol·L^(-1)组比较,JS-K 5μmol·L^(-1)+阿司匹林5,10和20 mmol·L^(-1)组HepG2和SMMC7721细胞增殖抑制率显著升高(P<0.05,P<0.01),且具有一定的协同作用(CI<1)。JS-K 5μmol·L^(-1)组、阿司匹林5,10和20 mmol·L^(-1)组、JS-K 5μmol·L^(-1)+阿司匹林5,10和20 mmol·L^(-1)组细胞扁圆,生长迟缓,形态不规则,脱落并悬浮于培养液中。与JS-K 5μmol·L^(-1)组比较,JS-K 5μmol·L^(-1)+阿司匹林5,10,20 mmol·L^(-1)组细胞凋亡率显著升高(P<0.05,P<0.01)。DAPI染色结果显示,与JS-K 5μmol·L^(-1)单药组或阿司匹林20 mmol·L^(-1)单药组比较,JS-K 5μmol·L^(-1)+阿司匹林20 mmol·L^(-1)组细胞核染色质高度凝聚、边缘化,核碎裂等凋亡样特征更加明显,活化胱天蛋白酶9、活化胱天蛋白酶3和活化PARP蛋白表达显著上调(P<0.05,P<0.01)。与JS-K 5μmol·L^(-1)+阿司匹林20 mmol·L^(-1)组比较,JS-K 5μmol·L^(-1)+阿司匹林20 mmol·L^(-1)+Z-VAD-FMK 50μmol·L^(-1)组细胞核染色质高度凝聚、边缘化,核碎裂等凋亡特征减少,活化胱天蛋白酶9、活化胱天蛋白酶3和活化PARP蛋白表达水平显著降低(P<0.05,P<0.01)。结论JS-K与阿司匹林联用具有协同抑制HepG2和SMMC7721细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用,其作用机制与激活胱天蛋白酶诱导的凋亡级联反应有关.

NO前药JS-K对HL-60细胞增殖、分化的影响

目的观察一氧化氮前体药物JS-K对白血病HL-60细胞增殖分化的影响。方法体外传代培养HL-60细胞,用不同浓度的JS-K处理HL-60细胞24～96h,MTT法测定细胞活力,观察细胞生长情况。流式细胞仪检测细胞分化的表面分子变化。结果按对数浓度差0.5的间距加入JS-K0.3～10μmol.L-1,处理24～96h,随着JS-K浓度的增加和作用时间的延长,MTT法检测所得各组的光密度值呈剂量依赖性和时间依赖性降低,细胞生长抑制率增高,JS-K作用96h抑制HL-60细胞增殖的IC50为(1.025±0.23)μmol.L-1。JS-K3和10μmol.L-1处理96h后,显微镜下可见细胞数量明显减少,细胞皱缩、细胞碎片明显增加。JS-K3μmol.L-1作用96h后,表达CD11b阳性和CD14阳性细胞的百分率明显提高。结论JS-K可明显抑制HL-60细胞的增殖,促进HL-60细胞分化。

NO供体药JS-K对HepG2.2.15细胞的增殖抑制研究

目的一氧化氮(NO)供体药JS-K对多种肿瘤细胞生长有抑制作用,但尚无见对HBV(乙肝病毒)阳性肝癌细胞报道。病毒感染是肝癌发生的一个关键因素,故本实验研究了JS-K对HBV转染的Hep G2.2.215细胞增殖的抑制作用及可能涉及的机制。方法以不同浓度的JS-K处理Hep G2.2.15细胞,并在不同时间下用显微镜从形态学上观察JS-K作用于Hep G2.2.15细胞后形态学的变化;CCK-8法检测JS-K对Hep G2.2.15细胞的增殖抑制作用;流式细胞术检测JS-K作用于Hep G2.2.15细胞后细胞凋亡及细胞周期的变化;Western蛋白印迹法检测细胞凋亡相关蛋白(BAD,cleaved caspase-7和cleaved PARP)和DNA损伤相关蛋白(p-H2AX,p-CHK1和p-CHK2)的含量变化。结果通过显微镜观察加药后的Hep G2.2.15细胞,发现明显的抑制作用,细胞皱缩变圆,有浓度(0,1,10和20μmol·L-1)依赖性。CCK8结果显示,JS-K能明显抑制Hep G2.2.15细胞的增殖,具有时间(24,48和72 h)及浓度(0,1,3,10和30μmol·L-1)依赖性。流式细胞术结果显示JS-K浓度为5μmol·L-1时就引起G1期细胞比例从62.38%下降至27.27%,G2期细胞比例从9.50%上升至52.07%,将细胞阻滞在G2期。双染AV和PI结果显示,JS-K能明显诱导细胞凋亡,在浓度为30μmol·L-1时,细胞凋亡率高达70.83%。而且,JS-K(0,1,10和20μmol·L-1)使凋亡相关蛋白BAD、cleaved caspase-7和cleaved PARP及DNA损伤相关蛋白p-H2AX,p-CHK1和p-CHK2的蛋白表达上调。结论 JS-K抑制Hep G2.2.15细胞增殖的效应与细胞凋亡和DNA损伤有关。

JS-K对Hela细胞、A375细胞和HL-60细胞增殖的影响

目的探讨JS-K对人白血病HL-60细胞、黑色素瘤A375细胞以及宫颈癌Hela细胞增殖的影响。方法采用MTT法检测细胞生长情况,观察JS-K在0.3～10.0μmol/L浓度范围内对Hela细胞、A375细胞和HL-60细胞生长的影响,计算其抑制率;在倒置显微镜下观察细胞的形态学变化。结果MTT法检测发现,JS-K在0.3～10.0μmol/L处理HL-60细胞24-96h,反映活细胞数量的OD值呈时间依赖性和剂量依赖性的降低;JS-K对HL-60细胞的生长的抑制率则明显增高;显微镜下也可见,3.0和10.0μmol/L的JS-K作用96h后,HL-60细胞的数量明显减少,细胞碎片增加;96hJS-K对于HL-60的IC50为0.58±0.01μmol/L。与空白组比较,0.3～10.0μmol/LJS-K作用Hela细胞、A375细胞24-96h,反映活细胞数量的OD值和镜下所见细胞数量和形态未见明显改变。结论JS-K对Hela细胞、A375细胞的增殖则无明显作用,而对HL-60细胞增殖具有明显的抑制作用,其作用机制值得进一步深入研究。

一氧化氮前体药JS-K促进肿瘤凋亡的研究进展

一氧化氮(nitric oxide,NO)在机体的生理和病理过程中以及不同的环境下可作为信号分子、毒物和抗氧化剂而发挥作用。NO前体药JS-K{O2-(2,4-dinitrophenyl)-1-[(4-ethoxycarbonyl)piperazin-1-yl]diazen-1-ium-1,2-diolate}是一种二醇二氮烯翁类药物,能被谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transfarase,GST)激活而释放高浓度NO,通过激活丝裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路、活化caspase级联反应、抑制泛素化系统、抑制β-catenin/T细胞因子(T cell factor,TCF)途径和诱导DNA损伤等方式促进肿瘤细胞发生凋亡。随着研究的深入,JS-K作用于肿瘤的方式不断创新,其对肿瘤治疗将更加高效、安全和精确。本文主要对JS-K与肿瘤细胞凋亡之间的关系进行综述。