健脾补肾、清肠化湿方联合BMSCs对溃疡性结肠炎模型大鼠肠屏障的修复作用

目的:观察健脾补肾、清肠化湿方联合骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)对溃疡性结肠炎模型大鼠结肠黏膜的修复作用.方法:SD大鼠随机分为空白组、模型组、BMSCs组、干预BMSCs组和联合组.TNBS法建立溃疡性结肠炎大鼠模型,空白组、模型组大鼠尾静脉分别注射1 mL生理盐水,BMSCs组大鼠尾静脉注射BMSCs,干预BMSCs和联合组大鼠分别注射体外中药共培养的BMSCs,联合组再予中药13.6 g/kg灌胃10 d.分别于第5天和第10天每组各处死5只大鼠,留取标本.电子显微镜观察大鼠结肠组织杯状细胞数量,实时定量PCR检测(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)和Western blot法分别检测大鼠结肠组织Muc2mRNA和蛋白的表达,Western blot法检测Muc2相关因子Math1和KLF-4蛋白的表达.结果:与模型组相比,各治疗组肠黏膜杯状细胞数量增多,各治疗组Muc2 mRNA水平升高,联合组优于干预BMSCs组和BMSCs组(P<0.05).随着时间延长,治疗效果越明显.治疗第10天,与正常组相比,模型组Muc2、Math1和KLF-4蛋白表达量明显下降,经治疗后,各治疗组蛋白表达量均上高,联合组升高最明显.结论:静脉移植BMSCs的同时给予健脾补肾、清肠化湿方能提高黏蛋白Muc2表达水平,增多杯状细胞数量,修复肠屏障,联合灌胃持续给药效果更佳,其机制可能和提高Math1和KLF-4因子表达有关.

健脾补肾、清肠化湿方对溃疡性结肠炎模型大鼠炎症及肠道菌群的影响

目的:基于微生物组学方法对溃疡性结肠炎模型大鼠粪便菌群进行研究,探讨健脾补肾、清肠化湿方对溃疡性结肠炎模型大鼠肠道菌群的影响。方法:66只健康SPF级SD大鼠依据随机数字表随机分为空白对照组,模型组,健脾补肾、清肠化湿方组,补肾组,健脾组和清肠组等6组。各给药组依照成人用药浓度灌胃治疗,隔日称量大鼠体质量,10 d后处死大鼠并制作病理切片,计算各组病理评分;酶联免疫吸附法检测血清IL-1β、TNF-α和IL-10水平;基于16S rRNA扩增与高通量测序技术检测大鼠粪便菌群构成及丰度。结果:健脾补肾、清肠化湿方及其拆方明显改善了溃疡性结肠炎组织的病理评分,缓解了结肠黏膜的组织病理学损伤,减少了黏膜杯状细胞的破坏,显著降低了血清IL-1β和TNF-α水平,提高了血清IL-10的水平;通过16S rRNA序列分析验证,发现健脾补肾、清肠化湿方及其拆方有效改善了SD大鼠肠道菌群失调的情况。结论:健脾补肾、清肠化湿方可改善溃疡性结肠炎模型大鼠的肠道炎症反应和组织病理学损伤,并对溃疡性结肠炎模型大鼠的肠道菌群有显著的调节作用。

健脾补肾清肠化湿方对静脉移植MSCs向溃疡性结肠炎大鼠结肠迁移分化的影响

目的:观察健脾补肾清肠化湿方对静脉移植的大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向溃疡性结肠炎模型大鼠结肠迁移归巢的影响。方法:体外分离培养SD大鼠MSCs,传至第3代,制备细胞悬液,加入0.78 mg·L-1健脾补肾清肠化湿方共培养,并以4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)荧光标记备用。大鼠分为空白组,模型组,MSCs组,干预MSCs组和联合组。2,4,6三硝基苯磺酸(TNBS)法建立溃疡性结肠炎大鼠模型,空白组、模型组大鼠尾静脉分别iv 1 m L生理盐水,MSCs组大鼠,iv 1 m L MSCs(1×106个),干预MSCs和联合组大鼠分别尾静脉iv体外中药干预的MSCs(1×106个),联合组再予健脾补肾清肠化湿方13.6 g·kg-1,ig 10 d。第5,10天每组各处死5只大鼠,结肠标本进行大体形态和组织学评估,共聚焦显微镜观察各组DAPI标记MSCs在结肠内迁移情况,免疫组化检测肠干细胞标记物神经细胞RNA结合蛋白(Musashi-1)的表达。结果:与正常组比较,模型组大鼠结肠可见广泛充血水肿,伴糜烂,肉眼可见溃疡形成,提示造模成功。除模型组和正常组外,各移植组结肠组织均能检测到DAPI标记的MSCs,且数量随时间的延长而逐渐增加;各治疗组均能改善大鼠结肠组织大体形态和组织病理,且第10天联合组优于MSCs组(P<0.05);各移植组能提高Musashi-1的表达,第10天联合组和干预MSCs组优于MSCs组(P<0.05)。结论:健脾补肾清肠化湿方能促进MSCs向结肠溃疡部位的迁移和分化,并能修复受损的结肠黏膜。

健脾补肾、清肠化湿复方及其拆方对骨髓间充质干细胞增殖趋化的影响及机制研究

目的:观察健脾补肾、清肠化湿复方及其拆方对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖趋化的影响及可能的作用机制,并探究其促增殖趋化最佳的功效药物配伍。方法:4~5周龄SD大鼠提取BMSCs,分别加入健脾补肾、清肠化湿复方及其拆方,CCK-8法检测BMSCs增殖情况,Transwell法检测BMSCs趋化能力,qRT-PCR法检测SDF-1和CXCR4基因表达水平,并以选择性CXCR4拮抗剂AMD3100为对照,进一步观察影响BMSCs增殖趋化的可能机制。结果:健脾补肾、清肠化湿方能够促进BMSCs增殖和趋化,拆方促增殖趋化作用依次为复方组>健脾清肠组>健脾补肾组>健脾组,且复方组能够上调趋化因子SDF-1和CXCR4基因表达,加入AMD3100后能够抑制促增殖趋化能力。结论:健脾补肾、清肠化湿方能够促进BMSCs的增殖和趋化,其机制可能与SDF-1/CXCR4信号轴有关。

健脾补肾、清肠化湿方对骨髓间充质干细胞增殖迁移的影响

目的观察健脾补肾、清肠化湿方对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖迁移的影响。方法贴壁筛选法体外分离培养BMSCs,制备细胞悬液,空白对照组不予任何药物干预,健脾补肾、清肠化湿方低、中、高剂量组(简称复方低、中、高剂量组)分别加入含有0.39、0.78、1.56μg/mL复方共同孵育。采用CCK-8法检测BMSCs增殖能力;采用Transwell法检测BMSCs迁移趋化能力。另设复方各剂量组联合细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase,ERK)激酶抑制剂U0126作为对照,采用Western blot法检测ERK和环磷腺苷效应元件结合蛋白(CAMP responsive element-binding protein,CREB)蛋白磷酸化水平。结果与空白对照组比较,复方低、中、高剂量组均能促进BMSCs增殖和BMSCs迁移数目增多(P<0.05),且复方中、高剂量组促BMSCs增殖作用优于复方低剂量组(P<0.05)。与空白对照组比较,复方各剂量组ERK和CREB蛋白磷酸化水平升高(P<0.05),且能被U0126抑制(P<0.01);与复方低剂量组比较,复方中、高剂量组ERK磷酸化水平升高(P<0.05)。结论健脾补肾、清肠化湿方能促进BMSCs的增殖迁移,其机制可能与ERK/CREB信号通路有关。