Cloning and Transcriptional Activity of Follicle-Stimulating Hormone Receptor Promoter in the Jintang Black Goat

[ Objective] To clone follicle-stimulating hormone receptor （FSHR） promoter in the Jintang black goat, study its transcriptional activity, and provide a basis for alternative splicing of FSHR gene. [Method] The total DNA were extracted from the womb of Jintang black goat, and one pair of primers were designed for amplification of FSHR promoter fragments, then the sequences and homology were analyzed. The FSHR promoter fragment was inserted into the pcFSHRB1 expression vector to substitute the CMV promoter and construct the pcFSHRB2 expression vector. The pcFSHRB1 and pcFSHRB2 expression vectors were transformed into HEK293 cells, respectively. Then these cells were collected after 24 and 48 h treatment with 2 mlU/ml follicle-stimulating hormone （FSH）, and the cAMP levels were detected. [Result] The FSHR promoter sequence of Jin- tang black goat had 34.2% homology to that of chicken and 41.6% to that of rat, respectively. The transcription initial site of FSHR was at -576 bp and its upstream sequences contained two TATA-boxes, four CAAT-boxes, one E-box and one Wl-box. After treating for 24 and 48 h, the cAMP levels of pcFSHRB2 were respectively 299.581 3 and 125.528 1 pmol/L; and that of pcFSHRB1 were respectively 120.057 1 and 109.940 7 pmoVL. [Conclusion] The FSHR promoter of Jintang black goat is a typical type 2 eukaryotic promoter, and it is also a strong promoter.

多胎和单胎山羊品种促性腺素基因及其受体基因的克隆、序列分析及组织表达研究

以多胎的金堂黑山羊和单胎的藏山羊为研究对象,通过RT-PCR技术,对金堂黑山羊和藏山羊FSHβ、LHβ、FSHR和LHR基因进行克隆,采用Real-time PCR技术测定FSHR和LHR基因在发情前期母羊卵巢中的表达量,采用酶联免疫法测定血浆中FSH和LH的浓度.结果表明:金堂黑山羊和藏山羊FSHβ、LHβ、FSHR和LHR基因的CDS区长度分别为390bp、426bp、2088bp、2103bp,同源性分别为99.74%、100%、99.95%、99.57%;发情前期两山羊品种之间卵巢FSHR和LHR基因的mRNA相对表达量差异不显著(P>0.05),血浆中FSH浓度无显著差异(P>0.05),LH的浓度差异显著(P<0.05).提示FSHβ和LHR基因序列及血浆中LH浓度在两个品种间的差异可能是品种间产羔数性状差异的重要原因.

山羊INHA和INHBA基因的cDNA克隆、序列分析及组织表达研究

分别提取处于同一发情周期的5只低繁藏山羊和5只高繁金堂黑山羊的卵巢、垂体的总RNA,并通过RT-PCR技术对INHA、INHBA基因cDNA进行克隆、序列分析,以Real-time PCR技术对其进行组织表达研究.结果表明:藏山羊和金堂黑山羊INHA基因编码区均长1083bp,编码360个氨基酸,两品种基因编码区有7处碱基不同,并导致3处氨基酸的差异;INHBA基因编码区均长1278bp,编码425个氨基酸,两品种基因编码区有4处碱基不同,并导致1处氨基酸的差异.藏山羊INHA基因编码区核苷酸序列与金堂黑山羊、绵羊、牛、野猪、小鼠、褐家鼠、人的同源性分别为:99.4%、98.9%、95.8%、88.6%、81.0%、79.5%和84.8%;藏山羊INHBA基因编码区核苷酸序列与金堂黑山羊、绵羊、牛、野猪、小鼠、褐家鼠、人的同源性分别为:99.7%、99.4%、98.1%、91.7%、88.0%、88.5%和91.2%.INHA和INHBA基因mRNA在两个山羊品种的卵巢、垂体中均有表达,但两品种间无显著性差异(P>0.05).说明INHA和INHBA基因在动物进化中比较保守,与山羊多羔性状的相关性有待进一步研究.

金堂黑山羊FSHR启动子克隆及转录活性分析

[目的]分析金堂黑山羊FSHR启动子的克隆和转录活性,为分子水平研究金堂黑山羊FSHR的可变剪接提供基础。[方法]从金堂黑山羊子宫中提取总的DNA,设计1对引物用于扩增FSHR启动子片段,并进行测序和同源性分析。将克隆得到的FSHR启动子片段替换CMV启动子构建pcFSHRB2表达载体,分别将pcFSHRB1和pcFSHRB2表达载体转染到HEK293细胞中,用2mIU/mlFSH处理细胞,在处理后24、48h分别检测环磷酸腺苷(cAMP)的产量,用以分析FSHR的转录活性。[结果]克隆得到的FSHR启动子序列与鸡和家鼠的同源性分别为34.2%和41.6%,推测其转录起始位点为-576bp处,其上游含有2个TATA-box、4个CAAT-box、1个E-box和1个W1-box。所构建的pcFSHRB2和pcFSHRB1表达载体转染细胞后用FSH处理24和48h时产生的cAMP的量分别为299.5813、125.5281pmol/L和120.0571、109.9407pmol/L。[结论]金堂黑山羊的FSHR启动子是一个典型的Ⅱ型真核启动子,是一个强启动子。

川中黑山羊(金堂类群)和藏山羊PRLR基因cDNA克隆及序列分析

根据GenBank中绵羊的PRLR基因序列设计引物,以川中黑山羊(金堂类群)和藏山羊垂体总RNA为模板,通过RT-PCR技术对川中黑山羊(金堂类群)和藏山羊PRLR基因cDNA克隆及进行序列分析,以期为进一步研究该基因与山羊的繁殖性能奠定理论基础.结果表明:川中黑山羊(金堂类群)和藏山羊PRLR基因编码区均长1746bp,均编码581个氨基酸.川中黑山羊(金堂类群)PRLR基因编码区与藏山羊、绵羊、牛、牦牛野猪和人的同源性分别为99.71%、99%、95%、95%、83%和80%.以核苷酸序列构建分子系统进化树,川中黑山羊(金堂类群)先与藏山羊聚为一类,再与绵羊聚为一类,后与牛和牦牛聚为一类,然后与野猪聚为一类,最后与人聚为一类.

金堂黑山羊FSH信号调节对卵巢基因表达谱影响的研究

【目的】本研究旨在搞清楚金堂黑山羊FSH信号调节机制的作用模式。【方法】将10只生殖周期相同的健康空怀的金堂黑山羊成年母羊随机分成2组,一组为对照组,一组为试验组。在发情后的第2天对试验组金堂黑山羊进行FSH肌肉注射100IU,并在注射24 h后,摘取金堂黑山羊的卵巢;对照组发情后的第3天摘取卵巢。分别提取它们的总RNA,进行表达谱测序。【结果】经测序分析:对照组和试验组分别得到有效序列30 906 038和27 763 272条;经统计分析后,得到归一化序列30 216 946和27 124882条,与山羊基因组的符合率分别达85.30%和86.13%。比对后发现239个基因出现显著性差异表达,其中139个基因上调了表达,100个基因下调了表达。GO功能分类发现在86个生物学过程、细胞组分、分子功能出现了显著性差异。KEGG功能分类发现有6个调节途径发生了显著性改变。【结论】FSH信号强度变化作用在卵巢上主要通过调节卵巢激素分泌、调节卵巢上FSH信号传导通路、调节脂代谢来响应,从而调节了动物的繁殖性能。

金堂黑山羊FSH信号调节对下丘脑基因表达谱的影响

【目的】本研究旨在搞清楚金堂黑山羊FSH信号调节机制的作用模式。【方法】将10只生殖周期相同的健康空怀的金堂黑山羊成年母羊随机分成2组,一组为对照组,一组为试验组。在发情后的第2天对试验组金堂黑山羊进行FSH肌肉注射100IU,并在注射24 h后,摘取金堂黑山羊的下丘脑;对照组发情后的第3天摘取下丘脑,分别提取他们的总RNA,进行表达谱测序。【结果】经测序分析:对照组和试验组分别得到有效序列26004442和25041098条;经统计分析后,得到归一化序列25338808和24413890条,与山羊基因组的符合率分别达85.31%和85.32%。比对后发现152个基因出现显著性差异表达,其中117个基因上调了表达,35个基因下调了表达。GO功能分类发现1个生物学过程出现了显著性差异。KEGG功能分类没发现调节途径发生了显著性改变。结果显示FSH信号通过负反馈调节的方式对下丘脑进行调节,除了少量的基因表达随着FSH信号强度的变化外,其主要的生物学过程,调节途径均无显著性变化,这说明FSH信号的负向调节要轻微很多。【结论】FSH信号通过负反馈调节的方式对下丘脑进行调节,相比正向调节,FSH信号的负向调节要轻微很多。

金堂黑山羊LHR基因片段的克隆及序列分析

采用RT-PCR法从刚断奶健康金堂黑山羊卵巢组织中扩增出促黄体素受体(LHR)基因部分序列,序列长度分别为1799和1724个碱基。2个序列与牛相比,中间都缺失266 bp;与猪变体B有相同的终止密码,初步确定2个序列为山羊LHR的2个变体。2个序列蛋白没有7个跨膜结构,但有N连接糖基化位点。结果表明:金堂黑山羊LHR RNA中存在一种替代剪接机制,采用不同的相位导致读码框的终止。

川中黑山羊(金堂型)产业发展现状及对策

从品种资源、疾病防控、饲料饲草、屠宰加工、产业发展模式等方面阐述了川中黑山羊(金堂型)产业现状,分析了产业存在的问题,并提出了发展对策,以期为川中黑山羊(金堂型)产业发展提供参考。

金堂黑山羊数量性状主基因的研究(一)

以偏离正态分布检测法分析了金堂黑山羊体重、体高、体长、胸围、胸深、胸宽和管围七个数量性状．结果表明:体重、体高、体长、胸围和胸深五个数量性状有主基因的作用．

山羊MSH4和MSH5基因的cDNA克隆、序列分析及组织表达

以低繁藏山羊和高繁金堂黑山羊为研究对象,分别提取处于发情期的5只藏山羊和5只金堂黑山羊的卵巢、子宫、输卵管、垂体的总RNA,并通过RT-PCR技术对MSH4、MSH5基因c DNA进行克隆、序列分析,以Real-time PCR技术对其进行组织表达研究。结果表明,藏山羊和金堂黑山羊MSH4基因编码区均长2 499 bp,编码832个氨基酸,两品种基因编码区有5处碱基不同,并导致3处氨基酸的差异;MSH5基因编码区均长2 496 bp,编码831个氨基酸,两品种基因编码区有9处碱基不同,并导致5处氨基酸的差异。藏山羊MSH4基因编码区核苷酸序列与金堂黑山羊、山羊、绵羊、牛、马、小鼠、褐家鼠、人的同源性分别为:99.8%、99.8%、99.4%、98.1%、94.4%、85.1%、84.7%和93.5%;藏山羊MSH5基因编码区核苷酸序列与金堂黑山羊、山羊、牛、家犬、小鼠、褐家鼠、人的同源性分别为:99.6%、99.6%、97.3%、88.0%、85.8%、85.3%和90.2%。MSH4和MSH5基因m RNA在两个山羊品种的卵巢、子宫、输卵管、垂体中均有表达,但两品种间无显著性差异(P>0.05)。说明MSH4和MSH5基因在动物进化中比较保守,与山羊多羔性状的相关性有待进一步研究。

引进金堂黑山羊的饲养效果观测

2014年秋季,重庆市武隆区从四川金堂县引进200头金堂黑山羊进行饲养试验,以观测该品种在渝东南地区的生产性能和适应性。结果显示,引进地金堂黑山羊各阶段的体重与原产地金堂黑山羊体重差异不显著,繁殖性能相当,屠宰成绩基本一致,没有出现烈性疾病,表明金堂黑山羊适应引种地区的气候条件。

羊源解淀粉芽孢杆菌对断奶金堂黑山羊生长性能、屠宰性能、血清生化和免疫指标以及肌肉发育相关基因表达的影响

本研究旨在探讨羊源解淀粉芽孢杆菌对断奶金堂黑山羊生长性能、屠宰性能、血清生化和免疫指标以及肌肉发育相关基因表达的影响。将20只断奶金堂黑山羊随机分为2组,每组10只。试验组每2 d灌服1 mL浓度为10;CFU/mL的解淀粉芽孢杆菌fsznc-06冻干菌剂,对照组每2 d灌服1 mL空白的菌剂保护剂(3.102%丙三醇、2.926%蔗糖和7.096%葡萄糖)。30 d后观察该菌对黑山羊生长性能、屠宰性能、血清生化和免疫指标、肌肉发育相关基因表达的影响。结果表明:与对照组相比,灌服解淀粉芽孢杆菌fsznc-0630 d后的黑山羊平均日增重、平均日采食量、饲料转化率、胴体重、屠宰率、净肉重、净肉率以及心脏指数和肝脏指数显著提高(P<0.05);黑山羊血清总抗氧化能力(T-AOC)及免疫球蛋白G(IgG)和干扰素-γ(IFN-γ)含量显著提高(P<0.05);血清丙二醛(MDA)含量显著降低(P<0.05);背最长肌和臀肌肌纤维直径和面积显著降低(P<0.05),背最长肌肌纤维密度显著提高(P<0.05);背最长肌中脂肪酸合成酶(FAS)、生肌决定因子1(MYOD1)、肌细胞生成素(MYOG)、肌球蛋白重链Ⅰ(MyHCⅠ)和臀肌脂蛋白脂酶(LPL)、过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)、MYOD1、MyHCⅠ基因相对表达量显著提高(P<0.05),背最长肌纤黏连蛋白1(FN1)、转化生长因子β1(TGFβ1)、固醇调节元件结合蛋白-1(SREBP-1)、肌球蛋白重链Ⅱb(MyHCⅡb)、肌球蛋白重链Ⅱx(MyHCⅡx)和臀肌FN1、TGFβ1、肌球蛋白重链Ⅱa(MyHCⅡa)、MyHCⅡb、MyHCⅡx基因相对表达量显著降低(P<0.05)。综上所述,解淀粉芽孢杆菌fsznc-06可提高金堂黑山羊生长性能、屠宰性能、免疫指标以及肌肉发育相关基因相对表达量。

金堂黑山羊不同组织内参基因筛选与稳定性分析

为筛选检测金堂黑山羊不同组织转录水平的荧光定量PCR方法中的最佳内参基因,本实验首先利用荧光定量PCR(qPCR)检测16个候选基因在金堂黑山羊心、肝、脾、瘤胃、背最长肌和臀肌中的转录水平,并利用geNorm、NormFinder、BestKeeper程序分析候选基因转录水平的稳定性。再以最佳内参基因组合、最佳内参基因和2个转录水平稳定性相对最差的候选基因作为内参基因,经qPCR检测黑山羊心、脾和臀肌中相容性复合体Ⅱ类基因(MHC class II DQ-beta 1 chain gene,DQB1)的转录水平,验证筛选基因的稳定性。结果显示,不同候选基因在不同组织中的转录水平稳定性存在一定的差异性。经geNorm、NormFinder、BestKeeper程序分析得出最稳定内参基因为PPIB和YWHAZ,相对最不稳定内参基因为18S rRNA、TOP2β和EIF3K。以最佳内参基因组合(PPIB和YWHAZ)、最佳内参基因(PPIB)和两个最不稳定基因(TOP2β和EIF3K)作为内参基因检测DQB1在黑山羊心、脾和臀肌中转录水平,前两者分别与后两者所得到的DQB1转录水平差异显著(p<0.05),验证了本实验所筛选内参基因的稳定性。本实验首次筛选出了金堂黑山羊最佳内参基因组合为PPIB和YWHAZ,为金堂黑山羊不同组织qPCR分析中的内参基因选择提供参考。

金堂黑山羊传染性脓疱的病理组织学观察和病毒分子检测

为确定四川成都某羊场黑山羊发病的病原并探讨其病理变化特点,本试验观察了患病羊的临床症状及剖检变化,制备了其唇、舌、心脏、肝脏、脾脏、肺脏的病理组织切片,观察其病理变化;并对患病羊的口唇病料样品进行羊传染性脓疱病毒(CEV)F1L基因的PCR检测。剖检结果显示,患病金堂黑山羊口、唇出现大小不等的丘疹、溃疡和脓疱;心包积液、出血;肾脏、脾脏肿大、淤血。病理组织学检查结果显示,病变唇、舌部表皮棘细胞大量增生,棘细胞空泡变性、网状变性、气球样变性,胞浆内可见嗜酸性病毒包涵体;心肌细胞排列紊乱,心肌纤维肿胀,成纤维细胞增多;肝细胞水肿,空泡变性;脾淋巴鞘增厚,血窦扩张、充血;肺泡扩张、破裂,肺泡壁变薄。PCR检测结果显示,患病羊口唇病料样品扩增出大小为230 bp的F1L基因片段;测序后BLAST比对显示,该基因序列与GenBank中登录的羊传染性脓疱病毒F1L基因序列同源性达99%。上述结果表明,该羊场此次发病由CEV感染引起,且CEV主要侵害金堂黑山羊唇、舌部的上皮组织,并且可造成心肌细胞肿胀、肝细胞变性、脾窦充血、肺泡扩张等病理损伤。本试验结果为CEV的诊断与治疗提供了科学依据。

金堂黑山羊不同年龄、性别及不同温湿度指数下的血液生化指标测定

为了测定金堂黑山羊不同年龄、性别及在较高和较低温湿度指数(THI)下的血液生化指标,为环境调控及饲养管理提供依据,试验定时定点测定山羊舍内干湿球温度,计算THI。随机选取金堂黑山羊48只,其中1,2,3岁3个年龄段各16只,公母各半(母羊空怀),分别在THI为85.96,83.44,69.04条件下,颈静脉采血,测定血液肾上腺素(EPI)、生长激素(GH)、甲状腺素(T4)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、γ-谷氨酰转移酶(γ-GT)、碱性磷酸酶(ALP)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、胆碱酯酶(CHE)、总胆红素(T-Bil)、直接胆红素(D-Bil)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、总胆汁酸(TBA)和葡萄糖(Glu)等14项指标,并按照年龄、性别及不同THI整理血液生化指标并进行比较分析。结果表明:随着年龄增大,ALT活性及TP、ALB、TBA浓度显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01),ALP活性和Glu浓度极显著降低(P<0.01)。母山羊GH浓度显著高于公山羊(P<0.05),T4浓度和ALP活性极显著高于公山羊(P<0.01),γ-GT活性极显著低于公山羊(P<0.01)。在较高THI条件下,EPI和T4及GH浓度较高,其中THI为83.44和85.96时三者的浓度均极显著高于THI为69.04时的浓度(P<0.01)。THI为69.04与85.96时,相应ALB浓度、γ-GT活性前者高于后者,而T-Bil、D-Bil及TBA浓度则是后者高于前者。说明ALT和ALP活性及TP、ALB、TBA和Glu浓度与年龄有关;ALP和γ-GT活性及GH和T4浓度与性别有关;在较高THI条件下,EPI和T4浓度揭示金堂黑山羊处于热应激状态,同时GH浓度较高,ALT和AST等主要肝功能指标活性下降。

金堂黑山羊白介素10基因的克隆及表达分析

为探究山羊白介素10(interleukin 10,IL-10)基因的序列特征及在组织中的相对表达情况,试验采用PCR法扩增并克隆金堂黑山羊IL-10基因,用DNAMAN、DNAStar、ExPASy等生物信息学软件进行序列分析,运用实时荧光定量PCR法检测IL-10基因在金堂黑山羊不同组织中的表达情况。结果显示,金堂黑山羊IL-10基因序列长为379bp,开放阅读框为276bp,编码91个氨基酸残基。IL-10蛋白二级结构中含有α-螺旋、β-转角和无规则卷曲,分别为76.92%、2.20%和20.88%。IL-10蛋白三级结构模型与人IL-10(1ilk.1.A)基因同源性最高(86.81%)。系统进化分析结果发现,金堂黑山羊IL-10基因与挪威山羊IL-10基因亲缘关系最近。实时荧光定量PCR检测发现,在金堂黑山羊肺脏中IL-10基因表达水平显著高于脾脏、心脏、肌肉和肾脏(P<0.05),在肾脏中IL-10基因表达水平显著高于脾脏、心脏和肌肉(P<0.05),在脾脏、心脏和肌肉中IL-10基因表达水平较低,但差异不显著(P>0.05)。本试验结果揭示了IL-10基因具有高度的保守性,可能参与调控山羊的免疫应答反应。

金堂黑山羊血液蛋白遗传多态性的研究

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)研究了金堂黑山羊血液运铁蛋白 (Tf)、后白蛋白 (Pa)及白蛋白(Alb)三个基因座的遗传多态性 ,并计算了金堂黑山羊与成都麻羊、湘东黑山羊等七个山羊群体的欧氏遗传距离 .结果表明 :金堂黑山羊群体中Tf和Pa两个基因座均表现出多态性 ,Alb基因座呈单态 ;Tf和Pa两个基因座基因型分布均符合Hardy weinberg定律 ;金堂黑山羊群体内的基因一致度高、基因多样度低、平均等位基因有效数少 ,是宝贵的山羊遗传资源 .

山羊DQB1基因分析及其组织表达分析

为探究金堂黑山羊主要组织相容性复合体II类基因(MHC class II DQ-beta 1 chain gene,DQB1)的结构与功能,及其组织表达特征。本研究采用PCR扩增DQB1基因并对其进行生物信息学分析,同时采用荧光定量PCR技术检测其在金堂黑山羊不同组织中的转录情况。结果显示:金堂黑山羊DQB1基因长度为786 bp,编码261个氨基酸。同源性分析显示金堂黑山羊DQB1基因与8个物种的相应基因同源性均达到85%以上,表明DQB1基因具有较高的保守性。荧光定量PCR结果显示,该基因在金堂黑山羊心脏组织中转录水平显著高于其在脾、肌肉、肠的转录水平(p<0.01),表明DQB1基因在不同组织中的转录水平存在一定差异。本研究为进一步探究DQB1的免疫功能提供参考依据。

山羊CXCR1基因的克隆及组织表达谱研究

为了探究山羊C-X-C趋化因子受体1(C-X-C motif chemokine receptor 1,CXCR1)基因的特点,试验以金堂黑山羊脾脏cDNA为模板克隆了CXCR1基因,借助生物信息学软件及在线软件分析序列,并采用实时荧光定量PCR方法检测CXCR1基因在金堂黑山羊脾脏、肺脏、肌肉、心脏和肠的5个组织中的相对表达量。结果表明:克隆得到的CXCR1基因序列全长为1 140 bp,完整CDS编码区长1 107 bp,共编码368个氨基酸;所得氨基酸序列与牛进行比对,两者同源性为96.8%;编码蛋白为带正电荷、具有疏水性的稳定蛋白;有7个跨膜结构和32个磷酸化位点,无信号肽;二级结构中α-螺旋比例最高,为54.35%;获得的三级结构模型与人的CXCR1蛋白(PDB:2lnl.1.A)同源性最高,为81.49%;氨基酸比对结果与系统进化树结果相近,金堂黑山羊与牛的亲缘关系最近;CXCR1基因主要表达于肌肉和心脏。说明CXCR1基因可能在山羊肌肉发育相关的信号通路中发挥作用。