芦荟大黄素对Jurkat T细胞增殖和凋亡的作用及机制

目的研究芦荟大黄素对Jurkat T细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用,并探讨可能的机制。方法应用细胞计数测定增殖,Hoechst/PI双染法及DNA片断化分析细胞凋亡特征,流式细胞术检测细胞周期分布。进一步应用二氢乙锭荧光染色测量活性氧产物,Western blotting检测胞浆细胞色素C(Cyt-c)的量,比色法检测caspase-3和caspase-9活性。结果芦荟大黄素剂量和时间依赖性地抑制JurkatT细胞增殖。芦荟大黄素诱发细胞核皱缩,核DNA片断化,细胞周期出现亚G1期凋亡峰,且停滞于G2/M期。芦荟大黄素介导细胞内活性氧水平显著提高,线粒体释放Cyt-c量显著增加,caspase-3和caspase-9活性显著增强。结论芦荟大黄素剂量依赖性地抑制Jurkat T细胞增殖并诱导其凋亡。诱导凋亡的机制中,包括增加活性氧产物和线粒体损伤途径。

砷在体外对人T淋巴细胞和Jurkat T细胞系的生长抑制作用

目的:通过三氧化二砷在体外对人 T淋巴细胞生长的影响 ,探讨三氧化二砷的免疫毒性和免疫抑制作用的机制。 方法 :应用正常人外周血 T细胞和人 Jurkat T细胞作为体外实验模型 ,观察不同浓度 (0 .5～ 10 0μM)三氧化二砷对正常人淋巴细胞和人 Jurkat T细胞的生长影响 ,并用电镜观察三氧化二砷对人 Jurkat T细胞的形态学改变。结果 :体外实验结果显示 ,三氧化二砷在 0 .5～ 10 0 μM浓度范围对正常人 T细胞和人 Jurkat T细胞的生长有明显的抑制作用 ,并随着三氧化二砷的浓度增高而抑制作用增强 ,呈现为剂量 -反应关系。三氧化二砷对正常人 T淋巴细胞和人 Jurkat T细胞的 IC50 分别为 8.0 5 μM和 8.9μM。电镜观察结果提示 ,三氧化二砷 (5 μM,2 4 h)处理 Jurkat T细胞 ,导致较多细胞出现细胞体积缩小 ,细胞核内染色质浓集于核膜内面成团块状 ,或染色体断裂成碎块状 ,或胞核固缩边缘化等典型的凋亡细胞特征性形态改变。存活的部分细胞线粒体增生 ,提示细胞功能活跃。同时 ,见到许多细胞浆内有空泡形成。结论 :三氧化二砷在体外能明显地抑制人 T淋巴细胞生长 ,这种生长抑制作用的机制之一是诱导细胞凋亡 。

盐霉素增强长春新碱诱导急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞株凋亡研究

目的:本文旨在研究长春新碱(vincristine,VCR)与盐霉素(salinomycin,Sal)联合作用对急性T淋巴细胞白血病jurkat细胞株增殖、凋亡的影响及其可能的机制。方法:CCK-8法检测细胞增殖情况;流式细胞术检测各实验组细胞凋亡率;Western blot检测凋亡相关蛋白BCL-2、caspase-3和caspase-8表达水平。结果:VCR、Sal单独及联合处理Jurkat细胞株均显示出明显的增殖抑制作用,两药联合使用的增殖抑制作用更显著(P<0.05),具有协同作用。联合用药组BCL-2蛋白水平较VCR和Sal单独处理组明显减少,而caspase-3和caspase-8水平明显增高;VCR和Sal联合用药组细胞凋亡率较VCR和Sal单独处理组明显提高(P<0.05)。结论:长春新碱联合盐霉素作用于Jurkat细胞具有协同抑制增殖及诱导凋亡的作用。

去甲斑蟊素诱导T淋巴细胞白血病Jurkat细胞凋亡作用及其机制

目的研究去甲斑蝥素(norcantharidin,NCTD)在体外对急性T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat细胞凋亡的作用及其机制。方法取对数生长期的Jurkat细胞分别加入不同浓度的NCTD和(或)10 mg/L的长春新碱(VCR),倒置显微镜下观察不同时间Jurkat细胞形态、密度及结构的变化;采用MTT比色法测定NCTD及VCR两种药物作用于细胞72 h后对细胞增殖抑制作用的影响;实时荧光定量RT-PCR法对p53及survivin基因表达量进行检测。结果 NCTD及VCR作用组细胞形态出现不规则,胀大、变形现象明显,分布稀疏,大量细胞死亡,两者在相同时间点上对细胞的影响无明显差别。MTT法检测结果表明:NCTD增殖抑制作用呈现时间-浓度依赖关系,最佳浓度及时间在20 mg/L,作用72 h时。NCTD与VCR两者对Jurkat细胞均有抑制作用(P<0.05),两者的抑制率相比无显著性差异(P>0.05),且两者联合可增加细胞增殖抑制率(P<0.05)。应用实时荧光定量RT-PCR技术定量表达p53及survivin基因,结果显示NCTD组p53基因表达较对照组细胞株明显上升(P<0.001),相反survivin基因较对照组明显下降(P<0.01)。结论(1)NCTD抑制Jurkat细胞株的增殖抑制作用具有时间-浓度依赖关系;(2)NCTD与VCR对细胞增殖均有抑制作用,两者的影响无显著性差异,且两者联合可增强对细胞的增殖抑制作用;(3)NCTD促进Jurkat细胞株细胞凋亡、抑制增殖的机制可能与上调p53基因表达量及下调survivin基因表达量有关。

转导反向6A8α-甘露糖苷酶cDNA对抗Fas抗体诱导Jurkat细胞凋亡的影响

用梯形DNA电泳与Gimsa染色研究人T细胞瘤细胞株Jurkat在转导编码人 6A8α 甘露糖苷酶基因的反向cDNA后 ,对抗Fas抗体诱导凋亡敏感性的变化 ,并用间接免疫荧光染色 (流式细胞仪 )检测细胞表面Fas分子的表达。结果表明 ,抗Fas抗体诱导细胞 2 4h后 ,野生型及转导空载载体的Jurkat细胞出现明显的梯形DNA ,两者之间无明显差异 ,但转导反向 6A8cDNA的细胞未见明显的梯形DNA。Gimsa染色结果显示转导反向 6A8cDNA的Ju rkat细胞中凋亡细胞数明显减少 ,而转导空载载体则无影响。Jurkat细胞为Fas(CD95 ,Apo 1)全阳性细胞 ,转导反向 6A8cDNA或空载载体对Fas表达阳性率与Fas表达强度无明显影响。以上结果提示 ,转导编码 6A8α 甘露糖苷酶基因的反向cDNA使人T细胞株Jurkat对抗人Fas抗体诱导的凋亡作用产生耐受。

异硫氰酸苯已酯抑制T细胞白血病Jurkat细胞Wnt／β-catenin信号通路的研究

本研究目的在于探索研究异硫氰酸苯己酯(PHI)在体外对人类T细胞白血病Jurkat细胞Wnt/β联蛋白(catenin)信号通路及组蛋白调控、细胞凋亡和增殖的影响。用MTT方法检测PHI作用后Jurkat细胞的增殖率变化;用流式细胞术观察细胞凋亡;用Western blot观察Jurkat细胞Wnt/β-catenin信号转导通路相关蛋白β-catenin、TCF、c-myc、cyclinD1水平的变化,以及组蛋白甲基化H3K4,H3K9、乙酰化H3,H4的变化。结果表明,PHI可抑制Jurkat细胞增殖,诱导细胞凋亡,呈浓度和时间依赖性,48 h的IC50约为20μmol/L;PHI处理3 h后上调组蛋白乙酰化H3、H4和组蛋白甲基化H3K4,下调组蛋白甲基化H3K9,7 h时作用更明显;PHI作用3 hβ-catenin表达水平无变化,7 h后Wnt/β-catenin信号转导通路β-catenin及其周期相关基因TCF、c-myc、cyclinD1表达均下降。结论:PHI抑制Jurkat细胞Wnt/β-catenin信号转导通路,调控组蛋白甲基化、乙酰化,从而诱导细胞凋亡,抑制细胞增殖。

阿糖胞苷刺激Jurkat细胞B7和细胞因子mRNA表达

目的探讨B7共刺激分子在T细胞活化和分化中的作用。方法阿糖胞苷(Ara-C)刺激Jurkat细胞,流式细胞术检测刺激前、后B7-1、B7-2的表达,RT-PCR检测刺激前、后B7-1、B7-2基因的表达,检测T细胞表面因子IL-3和IFN-γ的表达以及这两种细胞因子在Ara-C刺激Jurkat细胞后12,24,48,72,96,120,144 h时间动态变化。结果经Ara-C刺激Jurkat细胞后,均能使B7-1、B7-2表达上调,并且可诱导T细胞分泌细胞因子IL-3和IFN-γ,而未经Ara-C刺激的Jurkat细胞,无B7-1、B7-2的表达,均未诱导细胞因子的分泌。IL-3在T细胞活化12 h即可检测到,在48 h表达量最高,IFN-γ在T细胞活化24 h即可检测到,在72 h表达量最高。结论Ara-C可有效地刺激Jurkat细胞B7的表达,有效地增强肿瘤细胞的免疫原性,激活T细胞。B7在T细胞活化中起着重要作用。

转染B7-1基因的Raji和Jurkat细胞诱导细胞因子mRNA表达的研究

为探讨B7共刺激分子在T细胞活化和分化中的作用,利用脂质体介导的转基因技术将B7基因导入恶性血液病细胞系Raji和Jurkat细胞,用流式细胞术检测转基因前、后B7-1基因的表达,用RT-PCR检测T细胞表面细胞因子IL-2,IL-4和IFN-γ mRNA的表达及这3种细胞因子在转基因后4,12,20及48小时的时间动态变化。结果发现,B7^+ Raji细胞可诱导T细胞分泌细胞因子IL-2,IL-4和IFN-γ,B7^+ Jurkat细胞可诱导IL-2和IFN-γ的分泌,而B7^- Raji细胞及B7^- Jurkat细胞均未诱导细胞因子的分泌。IL-2和IL-4在T细胞活化4小时即可检测到,IFN-γ在T细胞活化12小时可检测到,在20小时出现峰值。结论:B7-1基因的导入可有效地增强肿瘤细胞的免疫原性,激活T细胞,B7-1在T细胞活化和分化中起着更主要的作用。

以RNAi慢病毒为载体下调CD59对急性T系白血病Jurkat细胞株的表达影响

目的:分析以RNAi慢病毒为载体下调CD59基因表达对急性T系白血病Jurkat细胞株的表达影响。方法:通过RNAi慢病毒作为载体,诱导急性T系白血病Jurkat细胞株中的CD59表达降低;采用激光共聚焦技术分析RNAi慢病毒转染情况和CD59分子的定位情况;应用实时荧光定量PCR法检测空白对照组、阴性对照组和RNAi慢病毒转染组中CD59 mRNA的相对表达量;用酶联免疫吸附试验法测定3组细胞培养上清中肿瘤坏死因子-β(TNF-β)和白介素-3(IL-3)的表达,用免疫印迹法(Western blot)测定3组细胞中凋亡相关分子半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、生存素(Survivin)、B淋巴细胞瘤-2(BCL-2)及BCL-2相关X蛋白(BAX)蛋白表达水平。结果:Jurkat细胞转染效率高于90%,CD59主要定位于细胞膜中。相比空白对照组和阴性对照组,RNAi慢病毒转染组中CD59 mRNA表达明显下调(P<0.05)。RNAi慢病毒转染组中CD59蛋白表达水平较空白对照组和阴性对照组明显降低(P<0.05)。相比空白对照组和阴性对照组,RNAi慢病毒转染组中TNF-β表达水平明显升高,IL-3表达水平明显降低(P<0.05)。RNAi慢病毒转染组Survivin和BCL-2表达水平较空白对照组和阴性对照组明显降低,Caspase-3和BAX蛋白表达较空白对照组和阴性对照组明显升高(P<0.05)。结论:通过转染RNAi慢病毒载体促使CD59基因表达下调可降低急性T系白血病Jurkat细胞株中促增殖分化相关分子IL-3的表达,提高肿瘤坏死相关因子TNF-β的表达,同时可提高细胞中促凋亡相关蛋白Caspase-3和BAX的表达,降低抗凋亡蛋白Survivin和BCL-2的表达。

γ-分泌酶抑制剂DAPT抑制Jurkat T细胞增殖

目的:探讨γ-分泌酶抑制剂DAPT在体外对人T淋巴细胞白血病JurkatT细胞株增殖的抑制作用及其某些机制。方法:通过倒置显微镜和MTT法检测DAPT对Jurkat T细胞聚集的影响和对其增殖的抑制作用;利用碘化丙锭染色结合流式细胞术检测DAPT对Jurkat T细胞周期的影响;藉免疫印迹法检测DAPT对Jurkat T细胞周期蛋白ICBP90表达的影响。结果:DAPT能显著影响Jurkat T细胞的聚集,抑制Jurkat T细胞的增殖,使其细胞周期停滞于S期,且周期蛋白ICBP90的表达下调。结论:γ-分泌酶抑制剂DAPT能够抑制Jurkat T细胞的增殖和细胞周期的进行,其抑制作用可能与ICBP90蛋白表达的下调有关。

精胺-普鲁兰联合地氯雷他定介导的NOTCH1沉默对急性T淋巴细胞白血病细胞系Jurkat的影响

目的以精胺-普鲁兰(Ps)作为NOTCH1 siRNA的载体,研究Ps联合溶酶体促渗剂地氯雷他定(DL)介导的NOTCH1沉默对急性T淋巴细胞白血病细胞系Jurkat的作用。方法采用动态光散射仪分析不同N/P比siRNA/Ps复合物的粒径和Zeta电位。将Jurkat细胞与siNOTCH1/Ps共孵育6 h,换液后加入含10μmol/L DL的RPMI 1640完全培养基继续孵育18 h;实时荧光定量PCR检测NOTCH1的沉默效率;流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡;Western blot检测NOTCH1下游蛋白C-MYC和凋亡相关蛋白caspase 3和cleaved caspase 3的表达。结果N/P比为5的siRNA/Ps复合物粒径为(203.97±1.07)nm,Zeta电位为(46.13±0.07)mV;复合物在10%FBS培养基中稳定。在Jurkat细胞中,与无DL组相比,siNOTCH1/Ps联合10μmol/L DL可高效沉默NOTCH1,诱导细胞周期阻滞在G 1期,促进细胞凋亡(P<0.05);同时,Jurkat细胞中cleaved caspase 3蛋白的表达水平升高,C-MYC及caspase 3蛋白的表达水平降低(P<0.05)。结论Ps联合溶酶体促渗剂DL有效介导Jurkat细胞中的NOTCH1沉默,从而诱导急性T淋巴细胞白血病细胞G 1期阻滞,并促进细胞凋亡。

砷诱导人T淋巴细胞表达HMG2基因的克隆研究

目的 为了解三氧化二砷诱导人T淋巴细胞的差异表达基因 ,探讨砷对淋巴细胞基因转录的影响机制。方法 在体外用三氧化二砷处理人JurkatT淋巴细胞 ( 5 μmol/L ,2 4h)后 ,应用抑制性消减杂交技术 (SSH)和克隆技术构建差异表达的cDNA文库 ,用PCR技术和测序技术鉴定阳性克隆。结果 用SSH技术构建了由三氧化二砷诱导的JurkatT淋巴细胞的差异表达基因的正向消减cDNA文库。经测序分析结果显示 ,该文库中含有高泳动类蛋白 2 (HMG2 )基因片段 ,同源性 98%。结论 我们的研究结果提示三氧化二砷 ( 5 μM ,2 4h)可诱导HMG2的转录 。

HIV-1潜伏感染人Jurkat T细胞模型的建立

目的建立Ⅰ型艾滋病病毒(HIV-1)潜伏感染人Jurkat T细胞的模型,为进一步研究HIV-1潜伏感染机制奠定基础。方法利用一种表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的HIV-1假病毒感染人Jurkat T细胞,采用流式细胞术分选出GFP-细胞群,之后经激活剂曲古抑菌素A(Trichostatin A,TSA)刺激后,再次采用流式细胞术分选出GFP+细胞,并通过有限稀释法制备获得单克隆细胞系。利用流式细胞术及酶联免疫吸附试验(ELISA)分别检测单克隆细胞系在TSA刺激前后的GFP+细胞比例及HIV-1病毒抗原p24;并用Alu-长末端重复序列(LTR)套式聚合酶链反应(Nested PCR)检测单克隆细胞系中HIV-1基因组的整合情况。结果获得了5株HIV-1潜伏感染的Jurkat单克隆细胞系,对这5株单克隆细胞系分别进行激活剂处理,发现无论是GFP表达细胞比例或HIV-1病毒蛋白p24抗原的表达,皆显著高于激活剂处理前的背景表达水平(P<0.05);并能从这5个单克隆细胞系基因组中扩增出针对HIV-1基因组的特异条带。结论已获得的5株单克隆细胞系具有HIV-1潜伏细胞的生物学特点,表明已成功地建立了HIV-1潜伏感染细胞模型。该模型可用于各种药物或激活剂的筛选和检测,也为进一步研究HIV-1潜伏感染机制奠定了工作基础。