舒尼替尼诱导耐药白血病细胞K562/ADR焦亡的作用及其通路研究

目的:探讨舒尼替尼(SU11248)对耐药白血病细胞K562/ADR死亡的诱导作用及其相关信号通路。方法:使用不同浓度舒尼替尼干预K562/ADR细胞,分别于24、48、72、96 h收集各组细胞,采用MTS法检测舒尼替尼对K562/ADR细胞增殖能力的影响,确定适当的舒尼替尼干预时间和浓度。通过qPCR和Western blot检测舒尼替尼干预后K562/ADR细胞的凋亡相关基因mRNA和蛋白表达水平变化。使用4种不同细胞死亡抑制剂Nec-1、VX-765、CQ、Fer-1检测舒尼替尼干预后K562/ADR细胞的死亡方式。通过qPCR和Western blot检测舒尼替尼干预后K562/ADR细胞的焦亡相关基因mRNA和蛋白表达水平变化。结果:舒尼替尼可明显抑制K562/ADR细胞的增殖,抑制效果呈一定的时间及浓度依赖性(r_(48 h)=0.9579、r_(4μg/ml)=0.9740),其48 h的IC_(50)为(3.96±0.14)μg/ml;舒尼替尼干预后K562/ADR细胞凋亡相关基因Bax、BCL-2、Caspase-3、Caspase-9的mRNA和蛋白表达水平均无明显变化;4种不同细胞死亡抑制剂处理后,仅焦亡抑制剂VX-765能够明显逆转舒尼替尼对K562/ADR细胞的增殖抑制作用(P<0.01);舒尼替尼干预后K562/ADR细胞焦亡相关基因Caspase-1、Caspase-4、Caspase-5、NLRP3、GSDMD、IL-1β的mRNA和蛋白表达水平均明显升高(P<0.01)。结论:舒尼替尼可诱导耐药白血病细胞K562/ADR发生焦亡,深入研究细胞焦亡相关信号通路有望为耐药白血病治疗提供实验依据。

人参皂苷Rg1联合阿霉素对K562/ADR细胞增殖及耐药的影响

目的探究人参皂苷Rg1对人慢性髓细胞白血病耐阿霉素(adriamycin,ADR)细胞K562/ADR增殖的影响及其对K562/ADR细胞的耐药逆转作用。方法CCK-8法检测不同浓度的人参皂苷Rg1对K562/ADR细胞增殖的影响;CCK-8法检测人参皂苷Rg1与ADR联用对K562/ADR细胞增殖的影响,计算半数抑制浓度(IC 50)和逆转倍数;集落形成实验检测人参皂苷Rg1联合ADR对K562/ADR细胞集落形成能力的影响;流式细胞术检测人参皂苷Rg1联合ADR对K562/ADR细胞周期的影响。结果与对照组相比,各浓度和作用时间的人参皂苷Rg1均可抑制K562/ADR细胞增殖(P<0.001),当人参皂苷Rg1浓度为120μg/mL,作用时间为48 h时,细胞增殖抑制率最高(P<0.05);与单用ADR相比,人参皂苷Rg1联合ADR作用48 h后,K562/ADR细胞IC 50值明显下降(P<0.05),人参皂苷Rg1对K562/ADR细胞的耐药逆转倍数为2.34;与对照组和ADR或人参皂苷Rg1单药作用相比,人参皂苷Rg1联合ADR作用能明显抑制K562/ADR细胞集落形成(P<0.05);与ADR或人参皂苷Rg1单药作用相比,人参皂苷Rg1联合ADR作用可以将细胞周期阻滞在G_(0)/G_(1)期。结论人参皂苷Rg1联合ADR能明显抑制K562/ADR细胞增殖并逆转K562/ADR细胞对ADR的耐药性,这可能与细胞周期阻滞于G_(0)/G_(1)期有关。

小檗胺对多药耐药K562/Adr细胞作用的研究

目的研究小檗胺诱导人白血病K5 6 2 /Adr细胞凋亡及逆转多药耐药的作用及机理。方法采用MTT法测IC50 值 ,流式细胞仪AnnexinVFITC PI法检测细胞凋亡发生率 ,PI染色法检测凋亡峰及细胞周期 ,同时以FCM检测Caspase 3、P GP蛋白表达及细胞内药物积聚能力 ,RT PCR法检测mdr 1基因表达。结果小檗胺能抑制人白血病K5 6 2 /Adr细胞生长且呈剂量依赖关系 ,并能诱导细胞凋亡 ,使Caspase 3蛋白表达及细胞药物外排能力增加 ,同时降低mdr 1基因mRNA和蛋白表达水平。结论小檗胺能激活Cas pase 3以诱导人白血病K5 6 2 /Adr细胞凋亡 ,同时能通过降低mdr

细胞因子诱导的杀伤细胞体外逆转K562/ADR细胞株多药耐药性观察

目的:研究细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)体外逆转K562/ADR细胞株多药耐药(MDR)的可行性。方法:在含细胞因子(人重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、人重组白细胞介素-1、人重组白细胞介素-4和人重组肿瘤坏死因子-α)的RPMI1640完全培养液中诱导K562细胞株、K562/ADR耐药细胞株分化成树突状细胞(DC)。正常人外周血单个核细胞(PBMC)在上述细胞因子诱导下培养成CIK,与成熟的DC共培养成CIK+K562/ADR-DC。应用流式细胞术检测CIK及CIK+K562/ADR-DC的细胞表型。MTT法测定CIK和K562/ADR-DC对K562/ADR的细胞毒作用,流式细胞仪检测CIK组和CIK+K562/ADR-DC组细胞中糖蛋白(P-gp)、阿霉素(ADR)的含量,RT-PCR检测mdr-1基因表达。结果:CIK、CIK+K562/ADR-DC细胞经流式细胞仪检测,均具有自己独特的表型。PBMC诱导培养4d后,CIK开始增殖,第7～9天细胞数量明显增多。K562/ADR来源的DC和CIK共培养后,细胞增殖速度明显加快,9d以后与CIK相比2组细胞的增殖速度呈现明显差异。CIK+K562/ADR-DC细胞对K562/ADR的细胞毒作用在效靶比20:1范围内明显高于CIK细胞(P<0.05)。CIK组和CIK+K562/ADR-DC组细胞的P-gp和Mdr-1与对照组相比显著降低(P<0.05),ADR表达明显升高。结论:CIK+K562/ADR-DC对高表达P-gp的K562/ADR耐药细胞株表现出了特异性细胞毒作用,有效提高了细胞内ADR的含量,下调了P-gp蛋白和mdr-1基因的表达,从而使免疫效应细胞体外逆转MDR的效果得以显现。

热休克蛋白90抑制剂17-AAG对K562/ADR耐药细胞株生长和凋亡的影响

目的研究热休克蛋白90抑制剂17-AAG对耐药白血病细胞生长的影响及其诱导的细胞凋亡作用,为白血病的治疗提供新的研究思路。方法采用MTT法检测17-AAG对细胞增殖抑制的剂量-时间-效应关系;激光共聚焦DA-PI染色法观察细胞形态学变化;流式细胞术检测细胞凋亡、周期及P-糖蛋白(P-gp)的变化,Western blot检测细胞凋亡相关蛋白的变化。结果 17-AAG能够明显抑制K562/ADR细胞的生长,大量细胞的核内DNA发生断裂,细胞核边缘化,加药组细胞凋亡率与对照组相比明显增高;加药后细胞被阻滞在G1期,procaspase-3和cleaved Caspase-3表达升高。结论 17-AAG可以通过诱导耐药细胞株K562/ADR的凋亡而抑制细胞生长。P-gp和Caspase-3的表达与凋亡事件的发生具有一定的相关性。

葛根素注射液对K562/Adr细胞化疗药物敏感性及机理研究

目的：通过观察葛根素注射液协同化疗药物对K562／Adr白血病耐药细胞的抑制作用，探讨葛根素增加白血病耐药细胞对化疗药物的敏感性及作用机理。方法：选K562／Adr耐药细胞株作为靶细胞，采用MTT法观察不同浓度的葛根素注射液对K562／Adr耐药细胞增殖的影响，及细胞对化疗药物的敏感性。RT—PCR的方法检测葛根素对耐药相关基因（MDR1／P-gp、MRP）表达的影响。结果：①MTT法结果显示低到中等浓度的葛根素（25～100μg／mL）对15562／Adr耐药株的生长与对照组相比无显著差异（P〉0.05），但当葛根素浓度提高至250μg／mL以上时，对细胞则出现增殖抑制作用，且随浓度增加抑制作用增强。②用不同浓度的葛根素和化疗药物（Adr 1μg/mL）合用时结果显示，低浓度（25～50μg／mL）的实验组与对照组无显著差异（P〉0．05）；随着葛根素浓度增加（100～500μg／mL），Adr对细胞的抑制作用明显，即K562／Adr对Adr的敏感性与葛根素呈剂量依赖吴系。③K562／Adr细胞经葛根素（100μg/mL）处理1周后，MDR1基因表达受到抑制，是未经处理细胞的2．5倍，MRP基因表达在处理前后无明显变化；当处理1个月后，细胞中MDR1、MRP两基因表达均明显低于未经处理过的细胞，分别是未经处理细胞的2．6倍和3．5倍。结论：葛根素注射液在一定浓度下，能直接抑制白血病耐药细胞增殖，并能提高耐药细胞对化疗药物的敏感性；其机制可能通过对耐药相关基因（MDR1、MRP）表达抑制来起作用。

补骨脂素逆转多药耐药细胞系K562/ADR耐药性研究

目的 研究补骨脂素对白血病细胞阿霉素耐药株(K5 6 2 /ADR)多药耐药 (multidrugresistance,MDR)性的逆转作用及其机制。方法 采用MTT法检测药物细胞毒性作用 ,高效液相色谱法检测细胞内阿霉素 (ADR)的浓度 ,流式细胞术测定细胞P 糖蛋白 (P gp)的表达。 结果 补骨脂素 (1～ 2 0 μmol·L-1)能不同程度地降低ADR对K5 6 2 /ADR细胞的IC50 。 2 0 μmol·L-1能显著提高ADR在K5 6 2 /ADR细胞内的浓度 ,降低K5 6 2 /ADR细胞P gp的表达。 结论 补骨脂素能逆转K5 6 2 /ADR细胞的MDR ,其机制与抑制P gp的功能及其表达 。

DC-CIK细胞对K562/ADR细胞多药耐药的逆转作用

目的探讨共培养树突状细胞(dendritic cell,DC)和细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-inducedkiller cell,CIK),即DC-CIK逆转白血病细胞多药耐药的作用及相关机制。方法采用RT-PCR方法检测DC-CIK处理后的耐药细胞株(K562/ADR细胞)中多药耐药基因(mdr1基因)的表达;利用MTT法检测DC-CIK细胞处理后的耐药细胞株对阿霉素敏感性的变化。结果经DC-CIK作用后的K562/ADR细胞mdr1表达明显低于未经DC-CIK处理的K562/ADR细胞组(P<0.05),而且其对阿霉素的敏感性也明显高于未经DC-CIK处理的K562/ADR细胞(P<0.05)。结论 DC-CIK可逆转耐药细胞的多药耐药,其作用机制可能与下调耐药细胞中mdr1的表达有关。

亚硒酸钠对K562/ADR多药耐药的逆转作用及其机制

本研究探讨亚硒酸钠对白血病耐药细胞株K562/ADR细胞的多药耐药性的逆转作用及其逆转机制。用噻唑蓝(MTT)法检测亚硒酸钠对K562/ADR细胞的生长抑制作用及其对K562/ADR细胞耐药性的逆转作用;应用流式细胞仪检测亚硒酸钠对K562及K562/ADR细胞凋亡率的影响;用半定量RT-PCR法检测K562/ADR细胞中mdr1和bcl-2基因的表达情况。结果表明,10μmol/L亚硒酸钠可以明显增加K562/ADR细胞对阿霉素敏感性,其耐药逆转倍数为2.31;早期凋亡率在10μmol/L亚硒酸钠作用于K562细胞48小时是升高的;而中、晚期凋亡率在亚硒酸钠5、10μmol/L作用48、72小时时均明显升高;两种浓度亚硒酸钠在作用48小时可使K562/ADR细胞早期凋亡率增加,作用48、72小时可使K562/ADR的细胞中、晚期凋亡率增高,10μmol/L的亚硒酸钠所致凋亡率高于5μmol/L,作用72小时的凋亡率高于48小时;亚硒酸钠可使K562/ADR细胞mdr1 mRNA及bcl-2mRNA表达下降。结论:亚硒酸钠可部分逆转K562/ADR细胞的耐药性,其机制可能是增加K562/ADR细胞凋亡率,下调mdr1 mR-NA和bcl-2 mRNA的表达。

维药异常黑胆质成熟剂总黄酮杀伤K562/ADR细胞株作用研究

目的探讨维药异常黑胆质成熟剂总黄酮（ASMq）对人慢性骨髓性白血病细胞（K562）及人白血病阿霉素耐药株（K562/ADR）的细胞毒性作用。方法对K562细胞株及K562/ADR细胞株细胞进行培养,在培养过程中注意K562/ADR细胞株对阿霉素的耐药性。取对数生长期K562、K562/ADR细胞株,96板孔中加入RPMI-1640培养液配制5×104个/m L细胞悬液100μL/每孔,37℃、5%CO2培养24 h贴壁,然后加入不同浓度（0、50、100、200、400、800和1600μg/m L）的ASMq,在37℃共培养48 h,每组5个重复,按照CCK-8说明书检测细胞活性。结果 K562细胞株对不同浓度的ASMq的细胞毒性的敏感性不同,差异有统计学意义（P〈0.05）;K562/ADR细胞株对0~1 600μg/m L浓度的ASMq的细胞毒性的敏感性差异无统计学意义（P〉0.05）;结论 ASMq对K562细胞具有细胞毒性作用,为临床治疗血液肿瘤提供了新的线索。

木香烃内酯通过PI3K/AKT通路诱导K562/ADR细胞凋亡

目的:探讨木香烃内酯对慢性粒细胞性白血病细胞耐药细胞株K562/ADR细胞增殖及凋亡的影响及其机制。方法:运用CCK-8法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测相关蛋白的表达。结果:选用木香烃内酯0.01、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10、25、50和100μmol/L作用K562/ADR细胞72h后,结果显示,木香烃内酯能够显著抑制K562/ADR细胞增殖,且呈浓度依赖性(r=0.9886),半数有效抑制浓度约为10.86±0.99μmol/L,差异有统计学意义(P<0.05)。选用木香烃内酯10及15μmol/L能显著诱导K562/ADR细胞凋亡,细胞凋亡率分别为14.80%±3.27%和33.2%±5.03%,与对照组(4.30%±0.62%)相比差异具有统计学意义(P<0.05)。Western blot结果显示,木香烃内酯能够明显下调p-AKT、p-PI3K、BCL-2的表达,上调激活型caspase-3、cleaved-PARP的表达。结论:木香烃内酯抑制K562/ADR细胞增殖并诱导细胞凋亡可能是通过调控PI3K/AKT通路实现的。

大黄素可能通过Akt-Caspase 3信号通路诱导K562/Adr细胞凋亡

目的:观察大黄素(emodin)对多药耐药白血病细胞株K562/Adr凋亡的影响及Akt-Caspase 3信号通路在其中的作用。方法:采用Annexin V/PI双染的流式细胞术和DNA倍体分析法检测细胞凋亡;Western blot法检测大黄素作用后不同时间段caspase-3前体蛋白、PARA、Akt、p-Akt表达水平的变化。结果:大黄素能够诱导K562/Adr细胞凋亡,并呈量效关系。大黄素作用K562/Adr细胞后caspase-3前体蛋白、Akt、p-Akt、PARA 116 KD表达水平下调,PARP 85 KD表达水平增加,并呈时效关系。结论:Akt-Caspase 3信号通路可能参与大黄素诱导K562/Adr细胞凋亡的过程。

地西他滨逆转K562/ADR细胞株多药耐药性机理初步探讨

目的探讨地西他滨(Decitabine,DCA)体外逆转耐阿霉素(ADR)的K562细胞株(K562/ADR)多药耐药性(Multi-drug resistance,MDR)的机理。方法设实验组为不同浓度的DCA与不同浓度的ADR联合作用于K562/ADR细胞;同时设对照组1为不同浓度的DCA作用的K562/ADR细胞组,对照组2为不同浓度的ADR作用的K562/ADR细胞组。检测各组对K562/ADR细胞杀伤活性、细胞膜P-糖蛋白(P-glycoproteins,P-gp)含量以及靶细胞凋亡情况等。结果实验组对K562/ADR细胞杀伤活性高于两个对照组(P<0.05);且随DCA浓度增大,杀伤活性增大(P<0.05);随所加入的ADR浓度增大,杀伤活性差异无统计学意义(P>0.05)。实验组和仅经DCA作用对照组1的P-gp含量均下降,P-gp含量随DCA浓度增大,下降明显(P<0.05);而随所加入的ADR浓度增大,下降无统计学意义(P>0.05)。流式细胞仪凋亡实验提示DCA诱导靶细胞的凋亡;DCA与ADR联合应用,部分靶细胞凋亡同时可见部分靶细胞死亡。结论通过DCA与ADR的联合应用,降低了K562/ADR细胞的胞内P-gp表达、增强了ADR对靶细胞的杀伤活性,为解决白血病MDR和联合化疗提供理论依据。

槲皮素逆转柔红霉素在耐药细胞株K562/ADR内的异常分布

目的 研究槲皮素处理前后柔红霉素 (DNR)在耐药细胞株K5 62 /ADR亚细胞结构的不同分布。方法 利用蒽环类抗生素固有的荧光 ,通过共聚焦激光扫描显微镜观察槲皮素作用后DNR在耐药细胞株K5 62 /ADR内亚细胞结构分布的改变。结果 与DNR在敏感细胞株K5 62 /S细胞核、胞浆均匀分布不同 ,在K5 62 /ADR细胞 ,DNR主要集中在核周及周边胞浆 ,核内DNR荧光很少 ;经槲皮素处理后 ,可恢复DNR在K5 62 /ADR内细胞核、胞浆中的弥漫分布。结论 DNR在耐药细胞中的异常分布与肿瘤细胞耐药的形成有关 。

siRNA沉默c-FLIP对K562/ADR耐药性的影响

目的探讨c-FLIP si RNA干扰c-FLIP m RNA水平对阿霉素耐药细胞K562/ADR的耐药性的影响及作用机制。方法应用si RNA干扰的方法抑制K562及K562/ADR细胞c-FLIP的表达,通过荧光定量PCR的方法检测c-FLIP m RNA表达及对多药耐药基因MDR1 m RNA水平的影响。MTT法检测c-FLIP干扰与否对K562及K562/ADR细胞增殖的影响,Annexin V/7-ADD双染研究c-FLIP干扰与否对K562及K562/ADR细胞凋亡的影响。结果与阴性si RNA转染组相比较,c-FLIP si RNA转染下调K562细胞中c-FLIP的m RNA后,K562细胞增殖受到一定程度的抑制(P<0.05),但是并未显著诱导细胞凋亡,c-FLIP干扰与否K562细胞48 h增殖率分别为(69.14±1.82)%和(60.69±2.23)%,凋亡率分别为(1.7±0.3)%和(1.8±0.2)%。与阴性si RNA转染组相比较,c-FLIP si RNA转染抑制K562/ADR细胞中c-FLIP的m RNA后,K562/ADR细胞增殖显著被抑制(P<0.05),并显著诱导了细胞凋亡增加(P<0.05),c-FLIP干扰与否K562/ADR细胞48 h增殖率分别为(-6.07±0.71)%和(-37.45±3.53)%,凋亡率分别为(5.2±0.4)%和(9.2±0.4)%。并且c-FLIP si RNA下调c-FLIP m RNA水平后,K562/ADR细胞中的多药耐药基因MDR1的m RNA表达水平也被显著下调(P<0.05)。结论 c-FLIP si RNA下调K562/ADR细胞中c-FLIP的m RNA水平抑制了多药耐药基因MDR1的表达,从而抑制了K562/ADR细胞对阿霉素的耐药性。

裴氏升血颗粒含药血清对K562/ADR细胞p170表达的影响

目的:观察裴氏升血颗粒(PG)含药血清对人白血病细胞株K562/ADR细胞p170蛋白表达水平的影响。方法:采用MTT法测定不同浓度含药血清对K562细胞系的细胞毒作用,用流式细胞仪检测非细胞毒性浓度含药血清处理后K562/ADR细胞膜表面p170表达变化。结果:不同浓度含药血清对K562/ADR细胞无明显细胞毒作用,非细胞毒性含药血清能明显下调K562/ADR细胞p170蛋白的表达。结论:裴氏升血颗粒能够提高化疗疗效,其机制可能与下调p170蛋白表达有关。

K562/ADR细胞的5型腺病毒感染率研究

腺病毒是目前肿瘤基因治疗研究的常用载体,而5型腺病毒(Ad5)以其复制效率高、载体容量大等优势而被广泛用于基因治疗的相关研究。比较5型腺病毒对人白血病细胞K562及其耐药株K562/ADR的感染效率,并分析引起这种差异的分子机制。流式细胞术及荧光显微镜观察,结果显示,5型腺病毒对K562/ADR的感染效率明显高于K562;Real time PCR定量分析表明K562/ADR细胞株表面的CAR表达水平约为K562的1.33倍(P<0.05),而整合素αν表达则是K562的4.36倍(P<0.01)。

升血颗粒含药血清对人白血病K562/ADR细胞多药耐药的逆转作用

目的:观察升血颗粒(PG)含药血清对人白血病K562/ADR细胞多药耐药性的逆转作用,并探讨其逆转机制。方法:采用MTT法测定细胞的药敏性及耐药逆转性,应用流式细胞仪检测非细胞毒性的含药血清处理后K562/ADR细胞内阿霉素(ADM)的浓度。结果:低、中、高剂量含药血清对K562/ADR细胞无明显细胞毒性。低、中、高剂量含药血清作用后,ADM对K562/ADR细胞的半数抑制浓度(I C50)显著下降,逆转倍数分别为1.34、1.71、1.82倍;ADM外渗试验显示,低、中、高剂量含药血清处理后K562/ADR细胞内ADM浓度显著增加,增加倍数分别为1.41、1.67、2.04倍。结论:升血颗粒含药血清对人白血病K562/ADR细胞耐药性有一定的逆转作用。

五味子甲素对K562/ADR、HL60/ADR、MCF-7/ADR多药耐药逆转机制的研究

目的探讨五味子甲素(schizandrin A or deoxyschizan-drin,schA)对白血病细胞K562/ADR、HL60/ADR、乳腺癌细胞MCF-7/ADR多药耐药的逆转作用,并初步探讨其逆转机制。方法 MTT法检测schA对耐药细胞的逆转作用;流式细胞仪检测schA对细胞内柔红霉素、罗丹明-123含量和细胞表面P-gp表达水平的变化;用Real-time PCR方法检测schA对细胞内mdr1 mRNA和mrp1 mRNA表达;生化检测法检测schA对细胞内GSH含量的变化。结果耐药逆转实验显示:不同浓度的schA对作用机制不同的化疗药物耐药产生不同的逆转效果;蓄积实验表明schA可增加柔红霉素、罗丹明123在耐药细胞内的蓄积,并且有良好的剂量依赖关系;schA处理K562/ADR、HL60/ADR细胞24 h后,能降低P-gp蛋白和mdr1、mrp1基因的表达;schA处理K562/ADR、HL60/ADR细胞4 h后,可降低细胞内谷胱甘肽含量。结论 schA对耐药机制不同的细胞株K562/ADR、HL60/ADR均有耐药逆转作用,推测可能是与抑制细胞表面的P-gp蛋白功能和表达,降低mdr1、mrp1耐药基因的表达和降低细胞内谷胱甘肽含量有关,schA通过影响上述机制,进而增加细胞内的药物浓度,达到有效杀灭肿瘤细胞的作用。