应用逆转录病毒载体构建荧光标记的K562细胞模型

目的:采用逆转录病毒载体系统构建荧光标记的K562细胞模型。方法:将增强绿色荧光蛋白(EGFP)cDNA插入载体pCMV-hyg,构建重组质粒pCMV-EGFP-hyg,并与逆转录病毒载体质粒pCMV-G和pCMV-GP共转染293T细胞生产重组逆转录病毒,感染K562细胞;通过Hyg筛选建立EGFP自身标记的K562细胞模型。应用流式细胞仪及荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达。比较EGFP-K562细胞与K562细胞生长曲线。通过外周血淋巴细胞的NK活性试验观察EGFP-K562能否用于有关实验研究。结果:应用EGFPcDNA成功构建pCMV-EGFP-hyg,与逆转录病毒载体系统质粒共转染293T细胞后产生含EGFP的重组逆转录病毒,48h收集的病毒滴度达1.5×106CFU/ml。重组逆转录病毒感染K562细胞后,经Hyg筛选,98%以上稳定表达EGFP。长期培养20代,EGFP表达稳定,对K562细胞生长无影响。以EGFP-K562为靶细胞的NK活性试验显示40∶1效靶比,孵育4h最敏感。结论:应用逆转录病毒载体系统成功构建稳定表达绿色荧光蛋白的EGFP-K562细胞模型,NK活性试验提示EGFP-K562可用作实验研究的新型靶细胞模型。

利用流式细胞仪检测人外周血NK细胞毒性方法的建立

目的利用流式细胞仪(FACS)技术检测人外周血NK细胞的毒性。方法首先将pEGFP-N1质粒转染人NK细胞的天然靶细胞K562,经过G418筛选后进一步单克隆化,得到稳定、均一表达绿色荧光蛋白的K562细胞。取对数期的K562-EGFP细胞与人外周血单个核细胞分别按5∶1、10∶1、20∶1、40∶1的比例混合,分别孵育0.5、1、2、4 h后用碘化丙啶(PI)标记,用流式细胞仪分析呈红、绿色荧光的细胞数,最后计算NK细胞的杀伤效率。结果0.5、1、2、4 h均能得到明显的杀伤效果,而且以2h的杀伤率最高。此时杀伤率与传统乳酸脱氢酶法(LDH)具有显著相关性(γ=0.997,P=0.003),而且显示出更强的敏感性。结论利用流式细胞仪检测NK细胞毒活性的方法可作为传统51Cr释放法、LDH法的一个补充,而且具有经济、快速和敏感的特点。

流式细胞术检测NK细胞活性在获得性噬血细胞性淋巴组织细胞增多症诊断中的应用

本研究目的旨在建立一种准确、稳定的NK细胞杀伤活性检测方法,应用于获得性噬血细胞性淋巴组织细胞增多症诊断。21例疑似患者及20例健康对照者纳入本研究。根据HLH-2004标准将疑似患者分为确诊组和排除组,将pEGFP-N1质粒转染人NK细胞的天然靶细胞K562,经过G418筛选后进一步单克隆,得到稳定、均一表达绿色荧光蛋白的EGFP-K562细胞,将EGFP-K562细胞与人外周血单个核细胞按10∶1的比例混合孵育2小时后,用碘化丙啶(PI)标记,用流式细胞仪分析呈红、绿色荧光的细胞数,最后计算NK细胞的杀伤效率;同时采用LDH释放法测定外周血NK细胞对单纯K562细胞的杀伤活性,并进行比较。结果表明:获得了稳定表达绿色荧光蛋白的EGFP-K562细胞;流式细胞仪检测表明健康人NK细胞杀伤率与病人组之间存在明显差异,流式细胞仪技术检测NK细胞杀伤活性与传统LDH释放法检测NK细胞杀伤活性具有显著相关性。结论:EGFP-K562细胞株作为靶细胞用于流式细胞术检测NK细胞杀伤活性,无需预先染色和标记靶细胞,操作简便、省时、稳定、重复性高,可应广泛应用于获得性噬血细胞性淋巴组织细胞增多症诊断。

建立非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠人白血病模型的实验研究

目的:建立绿色荧光蛋白(GFP)标记的人白血病细胞株K562,并以此移植非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠,建立白血病研究的新动物模型。方法:用含GFP的逆病毒载体将标记基因GFP转入人白血病细胞株K562。NOD/SCID小鼠经2.5Gy的γ射线照射后,从尾静脉注射0.5×106个K562-GFP细胞(n=3;第1组);或1×106个K562-GFP细胞(n=3;第2组);或生理盐水作为对照组(n=2)。移植后第6周用流式细胞术和PCR检测受鼠体内白血病细胞。结果:外源性GFP基因在K562细胞中稳定表达。移植后6周FCM检测,受鼠骨髓中的人源细胞比例均数分别为12.3%(第1组)和22.6%(第2组),并且外周血和脾脏也可检测白血病细胞。结论:用GFP标记的K562细胞移植NOD/SCID小鼠,成功建立了白血病动物模型。

构建含绿色荧光蛋白和潮霉素抗性基因重组逆转录病毒载体的实验研究

目的构建含增强绿色荧光蛋白(EGFP)和潮霉素抗性(Hyg)重组逆转录病毒载体。方法将Hyg和EGFP基因片段分别插入逆病毒载体质粒pCMV-LL-SA-2中,构建重组的逆病毒质粒pCMV-EGFP-hyg与质粒pCMV-G和pCMV-GP共转染293T细胞产生重组逆病毒,感染白血病细胞株K562。结果成功构建重组逆病毒载体质粒pCMV-EGFP-hyg,与质粒pCMV-G和pCMV-GP共转染293T细胞后24h和48h,细胞培养上清中的病毒滴度分别为7.5×105CFU/ml和1.5×106CFU/ml。K562细胞经与产毒293T细胞协同培养感染重组逆病毒后,表达EGFP的阳性细胞比率为59.6%。经Hyg筛选后,98%以上的K562细胞为EGFP表达细胞。结论成功构建了含EGFP和Hyg的重组逆转录病毒载体,可以产生较高滴度的目的病毒;并且建立了稳定持久表达EGFP的K562白血病细胞系。

EGFP作为报道基因在研究WT1基因调控元件中的应用

本研究调查EGFP基因作为报道基因在研究WT1基因调控功能中应用的可行性。利用基因重组技术分别将WT1基因启动子和增强子的功能片段构建到质粒pEGFP-1载体中,转化感受态E.coli菌细胞,筛选了阳性转化菌落,通过限制性酶切鉴定重组质粒插入片段正确的菌落,抽提重组质粒DNA;同时将重组质粒转染K562细胞,通过荧光显微镜检测重组质粒的功能。结果表明:通过基因重组技术分别构建了含有WT1基因启动子的载体(pEWP)和含有WT1基因启动子和增强子的载体(pEWPE、pEWPA和pEWPD)。转染48小时后,pEWP、pEWPE、pEWPA和pEWPD的K562细胞在荧光显微镜下能够显示荧光,而转染了空载体pEGFP-1的K562细胞未出现荧光。结论:EGFP基因作为报道基因可以用于WT1基因调控功能的研究,为进一步开展基因治疗创造了条件。