仔猪黄痢K88-K99-987p-F41多价菌毛疫苗的制备及小鼠免疫试验

为了更好地预防仔猪黄痢,选取野生分离菌株HN2001(K88ab)、HN2002(K88ac)、HN2003(K 88ad)、HN2004(K 99)、HN2005(987p)和HN2006(F41)培养后用低温磁力搅拌法提取菌毛,制成5批多价菌毛混合油乳剂灭活苗。试验结果表明,5批多价灭活疫苗对小鼠的平均保护率达95.0%,为进一步进行本体动物试验提供了有价值的参考资料。

猪大肠杆菌K88-K99 PCR诊断试剂盒研究

根据已成功扩增的大肠杆菌K88及K99菌毛蛋白结构基因PCR反应 ,进行PCR反应体系的优化。将 2种菌毛蛋白结构基因的扩增引物混合进行PCR ,同时检测K88及K99菌毛蛋白结构基因。经优化试验 ,筛选出 5 0 μLPCR反应体系中各成分的最适用量为 :Mg2 + 浓度 2mmol L ,Taq酶 5U ,dNTPs 2 0 0mmol L ,每条引物 5 0pmol,模板量 1 0 0CFU ,并研制成功用于临床检测的PCR诊断试剂盒。

应用K88-K99 PCR试剂盒检测大肠杆菌研究

用研制的K88-K99 PCR诊断试剂盒对湖北省和江苏省的5个猪场238个病猪粪便进行了检测。扩增结果是K88检出率92.0％(219/238);K99检出率89.1％(212/238);阳性对照检出率100％,阴性对照未扩增到目的DNA片段。结果表明,运用PCR试剂盒检测具有快速、特异的优点,可同时处理大量样品,且可直接对粪便样品进行检测,值得进一步推广。

大肠埃希氏菌表面菌毛黏附因子多价菌毛疫苗的研制

为了预防仔猪黄痢,选取ETEC野生分离菌株HN2001(K88ab)、HN2002(K88ac)、HN2003(K88ad)、HN2004(K99)、HN2005(987p)、HN2006(F41)培养后用低温磁力搅拌法提取到菌毛,制成5批多价菌毛混合油乳剂灭活苗,实验室试验结果表明,5批多价灭活疫苗对小白鼠的平均保护率达95.0%,为进一步进行田间试验提供了理论依据,并将为生产上防治仔猪黄痢提供一种保护范围更加全面的生物制品。

大肠杆菌野生株K_(99)菌毛蛋白结构基因的克隆与序列分析

根据产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)K99菌毛蛋白的全基因序列设计产肠毒素大肠杆菌主要菌毛K99的一对引物。PCR扩增K99菌毛蛋白的全基因序列大小为546bp。将PCR扩增的目的片断克隆于pMD18-T载体、pET-32a载体中,分别转化大肠杆菌,经酶切鉴定、PCR鉴定及DNA序列分析,筛选出阳性克隆。经过序列比对,所克隆的外源基因与报道的K99菌毛蛋白结构基因序列同源性达99.3%。成功克隆分离到的产肠毒素大肠杆菌菌毛的K99基因,为当地产肠毒素性大肠杆菌病疫苗的选择及基因疫苗的研制提供了坚实的理论基础,为产肠毒素性大肠杆菌病检测、预防及基因工程疫苗的研制开辟新的途径。

日本血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶基因和产毒大肠杆菌纤毛抗原基因的联合表达

目的：编码日本血吸虫２６ｋＤａＧＳＴ和产毒大肠杆菌纤毛抗原Ｋ９９基因的联合表达。方法：ＰＣＲ扩增的Ｋ９９基因克隆入ｐＵＣ１８载体，再将限制性酶切获得的ＧＳＴ基因克隆入ｐＵＣ１８－Ｋ９９重组质粒。限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳选择连接方向正确的重组质粒用于重组蛋白的表达。共表达产物采用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ、反向ＩＨＡ、ＥＬＩＳＡ和透视电镜观察进行分析鉴定。结果：共表达产物的分子量约５０ｋＤａ，存在于宿主菌体表面的纤毛中，ＧＳＴ抗血清和Ｋ９９抗血清均可识别共表达产物，提示共表达产物既有ＧＳＴ表位，又有Ｋ９９抗原表位。结论：日本血吸虫２６ｋＤａＧＳＴ和产毒大肠杆菌Ｋ９９基因共表达获得成功。