KAP-1:转录调控中的一个桥梁分子

KAP-1(又称TIF1β,TRIM28等)是一种转录中介因子,在诸多转录调控复合体中起桥梁作用。它通过其N端RBCC结构域与含KRAB结构域的锌指蛋白、MDM2、MM1、C/EBPβ等相互作用;通过C端的PHD及BrD结构域与SETDB1、Mi-2α等分子相互作用,参与形成具有组蛋白甲基化酶或组蛋白去乙酰化酶活性的复合体;通过中间的HP1BD区域与HP1蛋白相互作用,进而与组蛋白相结合。大量研究表明,KAP-1作为一个桥梁分子,主要以共抑制因子形式参与转录抑制复合体的形成,在某些复合体中也可作为共激活因子发挥作用。KAP-1参与形成的复合体在精细胞发育、胚胎早期发育等生理过程中发挥重要的调控作用,这种调控属于表观遗传调控范畴。

siRNA沉默KAP-1表达抑制胰腺癌细胞PANC-1的侵袭能力

目的:观察siRNA沉默KAP-1基因表达对人胰腺癌PANC-1细胞侵袭能力的影响,探求该基因作为治疗靶点的可行性.方法:针对KAP-1基因设计5条siRNA,构建真核表达载体,转染293T细胞筛选RNAi有效靶点,包装成重组慢病毒Lv-siRNA-KAP-1,感染胰腺癌细胞PANC-1成功后RT-qPCR检测RNA干扰沉默效果,Transwell小室检测细胞侵袭能力.Western blot检测波形蛋白表达.结果:转染48h后,5条siRNA能显著抑制KAP-1的蛋白表达;其中最有效的1条siRNA包装成重组慢病毒Lv-siRNA-KAP-1,感染PANC-1细胞侵袭能力明显受到抑制;感染后细胞侵袭数目(97.3±25.6)较空白对照组(253.3±20.6)与阴性对照组(213.2±19.4)明显减少,差异显著(P<0.05);感染后PANC-1细胞的波形蛋白表达下调.结论:Lv-siRNA-KAP-1能显著抑制PANC-1细胞KAP-1的表达,抑制PANC-1细胞侵袭能力及波形蛋白表达,KAP-1基因有可能成为胰腺癌基因治疗的新靶点.

KAP-1在胰腺癌中的表达及临床意义

目的:研究KAP-1在胰腺癌组织和细胞株中的表达及意义.方法:采用免疫组织化学方法检测46例胰腺癌标本(高分化15例,中分化17例,低分化14例)及9例正常胰腺标本中的KAP-1表达;采用RT-qPCR和Western blot的方法检测8对胰腺癌组织和配对癌旁组织标本中KAP-1的mRNA和蛋白质水平;采用RT-qPCR和Wsetern blot检测胰腺癌细胞株BxPC3、PANC-1、AsPC-1、SW1990、MIAPaCa-2、CFPAC-1、Capan-1和Capan-2中KAP-1mRNA和蛋白的表达水平.结果:免疫组织化学结果显示KAP-1在胰腺癌组织中阳性表达率为45.6%(21/46例),正常胰腺组织中阳性表达率为11.1%(1/9);在低分化胰腺癌组织中阳性表达率为78.6%(11/14),中分化胰腺癌组织为47.1%(8/17),高分化胰腺癌组织为13.3%(2/15);RT-qPCR和Western blot显示在胰腺癌组织中KAP-1的mRNA和蛋白质水平较癌旁正常胰腺组织高,KAP-1的mRNA水平在Panc-1中最高,在BXPC-3和CFPAC-1中较高,在SW1990、Capan-1和MIAPaCa-2中较低,在AsPC-1和Capan-2中最低.KAP-1蛋白质水平在低分化胰腺癌细胞株MIAPaCa-2和Panc-1中高,来源于肝转移的胰腺癌细胞系CFPAC-1中较高,其余细胞株中不表达.结论:KAP-1在胰腺癌组织中高表达,正常胰腺组织中几乎不表达,其表达与胰腺癌细胞分化相关;KAP-1可能在胰腺癌发生发展中发挥重要作用.

慢病毒介导KAP-1增强胰腺癌细胞Capan-2侵袭能力

目的观察KAP-1基因对人胰腺癌细胞Capan-2侵袭能力的影响,探求该基因作为治疗靶点的可行性。方法针对KAP-1基因构建真核表达载体,在293T细胞中包装成重组慢病毒Lv-eGFP-KAP-1,RT-qPCR和Western Blot法检测其对Capan-2细胞KAP-1的影响,Transwell侵袭小室检测其对Capan-2细胞侵袭能力的影响。结果成功地构建Lv-eGFP-KAP-1,感染Capan-2后细胞侵袭数目(128.3±4.6)较空白对照组(45.3±2.6)与阴性对照组(36.2±3.4)明显增加,差异有显著性(P<0.05)。结论 Lv-eGFP-KAP-1能显著上调Capan-2细胞KAP-1的表达,增强其侵袭能力,KAP-1基因有可能成为胰腺癌基因治疗的新靶点。

KAP-1对胰腺癌细胞Capan-2上皮细胞间质转化的促进作用

目的研究KAP-1对胰腺癌细胞Capan-2上皮细胞间质转化（EMT）的调节作用。方法构建LV-plenti-GFP。KAP-1慢病毒载体。将Capan-2细胞分为实验组（转染LV-plenti-GFP-KAP-1慢病毒载体）、阴性对照组（转染空载体）以及空白对照组1（含10％小牛血清的1640培养基）；而后再将实验组Capan-2细胞分为抑制剂组（转染化学合成的miR-100-5p抑制剂）、空载体对照组（转染无关序列micro-RNAs抑制剂）、空白对照组2（含10％小牛血清的1640培养基）。用双酶切及测序鉴定慢病毒并计算病毒滴度。LV-plenti-GFP-KAP-1慢病毒载体稳定转染至Capan-2细胞后，观察细胞的形态学改变。应用实时定量PER检测各组细胞中KAP-1、EMT标志蛋白以及miR-100-5pmRNA的表达情况。应用Westernblot法检测各组细胞中KAP-1、EMT标志蛋白表达水平。计量资料采用x-±s表示，组间比较均采用方差分析。结果成功构建LV-plenti-GFP-KAP-1慢病毒载体，病毒滴度为2×10^8 TU／ml。慢病毒载体转染Capan-2细胞48h后，实验组细胞与对照组比较其形态有明显间质样改变。实验组、阴性对照组、空白对照组1细胞中各目标蛋白mRNA的相对表达量：KAP-1分别为1．77±0．83、5．03±0．29、5．13±1．14，N-钙黏蛋白分别为2．62±0．71、5．07±1．53、5．81±1．49，波形蛋白分别为2．50±0．21、3．83±0．57、4．92±0．90，E-钙黏蛋白分别为7．20±1．17、7．83±0．78、3．07±0．36，miR-100-5p分别为1．81±0．40、7．01±0．96、6．87±0．35，3组比较，差异有统计学意义（F=5．99，7．62，7．88，6．62，4．64，P〈0．05）。抑制剂组、空载体对照组、空白对照组2细胞中KAP-1mRNA的相对表达量分别为1．56±0．42、4．89±0．61、5．20±0．38，3组比较，差异有统计学意义（F=5．14，P〈0．05）；波形蛋白mRNA的相对表达量分别为3．10±1．37、3．44±0．94、3．08±1．16，3组比较，差异无统计学意义（F=0．49，P〉0．05）。Westernblot检测结果表明：实验组、阴性对照组、空白对照组1细胞中各目标蛋白的相对表达量：KAP-1蛋白分别为2．77±1．99、0．83±0．46、0．71±0．26，N-钙黏蛋白分别为1．31±0．38、0．41±0．37、0．08±0．04，波形蛋白分别为4．25±0．63、1．03±0．33、1．37±0．92，E-钙黏蛋白分别为0．62±0．06、1．17±0．45、3．04±0．65，3组比较，差异有统计学意义（F=5．54，4．68，3．19，8．18，P〈0．05）。抑制剂组、空载体对照组、空白对照组2细胞中KAP-1蛋白的相对表达量分别为2．27±0．71、0．56±0．43、0．61±0．39，3组比较，差异有统计学意义（F=4．81，P〈0．05）；波形蛋白分别为3．19±0．55、3．93±0．06、3．61±0．73，3组比较，差异无统计学意义（F=0．04，P〉0．05）。结论KAP-1转录因子通过特异性调控其下游miR-100-5p表达，从而促进人类胰腺癌细胞Capan-2EMT。

4个绒山羊群体KAP13-1基因的遗传多态性分析

【目的】对中国河西绒山羊、内蒙古绒山羊、辽宁绒山羊和陇东绒山羊4个绒山羊群体KAP13-1基因的遗传特征进行分析,为揭示绒山羊遗传特征和生产利用提供基础数据。【方法】采用PCR-SSCP方法,检测河西绒山羊、内蒙古绒山羊、辽宁绒山羊及陇东绒山羊(共721只)KAP13-1基因的多态性。同时基于DA遗传距离用UP-GMA法进行聚类分析,以明确各群体间的遗传关系。【结果】基因组DNA扩增后得到491bp的扩增产物,经SSCP分析,从4个绒山羊群体KAP13-1基因中共发现6种基因型,4个等位基因中存在5个变异位点,这些多态位点主要为点突变,且均处于编码区,其中转换位点3个(占60%),颠换位点2个(占40%)。在170和197位分别发生了T→G、C→G的错义突变,导致氨基酸分别由Leu、Thr变为Arg、Ser。该基因在河西绒山羊与陇东绒山羊中均存在4个等位基因,而内蒙古绒山羊未检测到C和D等位基因,辽宁绒山羊未检测到D等位基因。聚类结果显示,河西绒山羊与陇东绒山羊之间的遗传距离较小,在系统发生树中聚为一支,辽宁绒山羊与内蒙古绒山羊聚为一支。【结论】KAP13-1基因在4个绒山羊群体中呈中度多态,群体间存在差异。生态学作用对4个绒山羊品种的进化过程有一定的影响。

牦牛KAP1家族基因长度多态研究

试验旨在研究牦牛角蛋白关联蛋白1(keratin associated protein 1,KAP1)家族基因长度多态与重复序列特点。研究对牦牛和黄牛KAP1家族基因进行测序,并与绵羊已知序列进行比较分析。结果发现,牛KAP1家族位于19号染色体,根据绵羊KAP1家族基因在染色体上的位置与相似性,重新命名了牛KAP1家族基因B2D、B2A、KAP1-1和B2C为KAP1-4、KAP1-1、KAP1-2、KAP1-3(按照染色体上的基因顺序)。KAP1家族基因之间在3′和5′端区域高度保守,中间有重复序列长度差异,其中牦牛KAP1-KAP4基因发现有30bp的长度多态。研究其蛋白序列发现5个氨基酸为基序的重复序列B(CCQTS)A1(CCQPT),以及一个新的重复序列C(SIQTS)。本研究结果说明重复序列是KAP1家族基因间和基因内的主要差异区域,这可能与其角蛋白结合螺旋数相关。

多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶-1通过激活NF-κB途径导致高糖人视网膜血管内皮细胞凋亡

目的探讨多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶-1[poly(adenosine diphosphate-ribose)polymeras-1,PARP-1]和核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)在高糖人视网膜血管内皮细胞(retinal vascular endothelial cells,RVEC)中的相互作用及其在人RVEC中的表达定位及作用机制。方法体外培养人RVEC及HEK293T细胞,并进行传代,同时构建高糖人RVEC细胞模型。构建PARP-EGFP及Flag-NF-κB质粒,酶切鉴定后转染高糖培养的人RVEC,Western blot法检测重组质粒表达目的基因的效果,并应用Western blot法和免疫共沉淀法检测高糖人RVEC中PARP-1和NF-κB的相互作用。PARP-EGFP和Flag-NF-κB质粒共转染人RVEC,激光共聚焦扫描显微镜检测PARP-1和NF-κB在高糖人RVEC中的定位及其相互作用。结果人RVEC复苏后24 h贴壁,细胞呈扁平梭形,3 d左右细胞开始融合呈铺路石样,单层生长,铺满瓶底,并可见接触抑制现象。成功构建PARP-EGFP及Flag-NF-κB质粒,并有效表达目的基因。免疫共沉淀结果显示PARP-1和NF-κB是相互作用的蛋白质,高糖组NF-κB p50的条带比正常对照组明显增粗,并且高糖情况下PARP-1结合NF-κB的量较正常对照组明显增加。激光共聚焦扫描显微镜结果显示PARP和NF-κB均表达于正常的人RVEC的细胞核和核周区域,当受到高浓度葡萄糖影响后,PARP-1和NF-κB均集中表达于细胞核内,尤以NF-κB最显著。结论 PARP-1和NF-κB是相互作用的蛋白质,血糖增高时,PARP-1可能进入细胞核内并结合同时进入细胞核的NF-κB,激活NF-κB信号通路,引起RVEC凋亡,导致DR的发生。

KRAB型锌指蛋白(KZNF)的研究进展

KRAB型锌指蛋白是哺乳动物中最大的转录调控因子家族,它的多数成员在基因组上成簇分布。其结构特征是N端含有KRAB结构域,C端含有多个C2H2型锌指结构。KRAB结构域为一蛋白质-蛋白质相互作用区,可以与多种协同转录抑制因子和转录因子结合,使KRAB型锌指蛋白作为转录因子和／或转录调控因子发挥依赖于DNA结合的转录抑制功能,在胚胎发育、细胞分化、细胞转化及细胞周期的调控中发挥重要功能。