3个山羊品种KAP6.2和KAP7基因的PCR-SSCP分析

采用PCR-SSCP法对3个山羊品种角蛋白辅助蛋白(KAP6.2,KAP7)进行了多态性研究。结果显示,3个品种中KAP7均未出现多态,而KAP6.2均出现了3种带型:AA、BB和AB。Hardy-Weinberg分析表明辽-苛高代杂种山羊和黎城大青羊未达到平衡状态,辽宁绒山羊达到了平衡。测序结果显示,和GenBank登陆序列相比,AA和BB均发生了碱基变化。其中AA型出现了以下变异:107bp(A-G),196bp(C-T),199bp(T-G),252bp(A-T),265bp(C-T),291bp(A-G),292bp(T-C),345bp(T-G);BB型出现了以下变异:164bp(T-C),194bp(T-C),199bp(T-G),201bp(C-G),233bp(A-G),275bp(A-G),299bp(A-G),309bp(G-C),327bp(A-G),352bp(G-T)。分析表明AA型和BB型变异均造成了氨基酸序列的变化。

和田羊KAP7、KAP8基因遗传多样性及其与羊毛长度的关联性分析

以采集的600只和田羊个体的血样为材料,利用PCR-SSCP、DNA测序等技术研究分析和田羊KAP7、KAP8基因的多态性,并与羊毛长度进行关联。结果表明,和田羊KAP8基因没有发现多态性;KAP7基因具有多态性,存在3种基因型:AA、AB和BB,且处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05),多态信息含量为0.2376,属于低度多态。测序结果显示,与原基因碱基序列相比,KAP7基因碱基序列在110(T→G)和268(G→A)处发生突变。关联分析表明,和田羊不同基因型之间羊毛长度差异显著。

新疆南疆和田羊、卡拉库尔羊毛囊KAP7基因的原核表达及多克隆抗体制备

本研究旨在制备新疆南疆平原型和田羊、山区型和田羊与卡拉库尔羊3个地方品种(系)绵羊毛囊角蛋白关联蛋白7(keratin associated protein 7,KAP7)基因多克隆抗体,为探索毛囊KAP7基因对半粗毛羊羊毛产量与质量的影响奠定基础。以3个品种绵羊的皮肤毛囊为试验材料,提取总RNA,反转录得到cDNA,PCR扩增获得绵羊毛囊KAP7基因,构建pMD19-T-KAP7克隆质粒,对重组质粒进行PCR、酶切鉴定和序列分析,再构建pET-28a(+)-KAP7原核表达重组质粒,并在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中表达,SDS-PAGE电泳检测原核表达的绵羊毛囊KAP7蛋白,经提取、纯化、回收得到目的蛋白,用其免疫家兔得到绵羊毛囊KAP7多克隆抗体血清,并用间接ELISA法检测其抗体效价。结果表明,与美利奴羊比对,平原型与山区型和田羊KAP7基因序列的同源性达99%,但平原型和田羊KAP7基因第22位碱基由G变为C,造成其KAP7蛋白第8位氨基酸由Gly变为Arg;山区型和田羊第70位碱基由A变为C,造成其24位氨基酸由Thr变为Ala;卡拉库尔羊毛囊KAP7基因与美利奴羊同源性达100%,其KAP7蛋白氨基酸序列与美利奴羊没有差异。绵羊毛囊KAP7基因原核表达重组质粒pET-28a(+)-KAP7可以在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中表达目的蛋白,其大小约为10ku。利用绵羊毛囊KAP7蛋白免疫家兔得到的多克隆抗体阳性血清具有免疫活性和特异性,其抗体效价达到1∶10 000。

和田羊毛囊KAP7基因的原核表达及其生物信息学分析

为了研究绵羊毛囊角蛋白基因对异质毛绵羊羊毛性状、品质的影响,将和田羊毛囊高Gly/Tyr蛋白中的角蛋白关联蛋白KAP7基因克隆到原核表达载体pET28a(+)中,然后将重组质粒pET28a(+)-KAP7转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导目的蛋白的表达,并对表达的蛋白进行了SDS-PAGE检测。进行了核苷酸与氨基酸序列分析,并对4个物种的KAP7基因进行了聚类分析。结果表明:成功构建了和田羊毛囊角蛋白原核表达载体pET28a(+)-KAP7,KAP7基因大小为258 bp;并在原核细胞中表达了KAP7成熟蛋白,SDS-PAGE检测在10 ku的位置有特异性表达蛋白条带,与预期的KAP7蛋白大小一致,该基因编码85个氨基酸;将其与绵羊、驯鹿、牦牛的核苷酸序列进行比对,和田羊与GenBank中不同绵羊品种的亲缘关系都比较近,同源性分别为100%、99.6%和98.4%。与牦牛的同源性为96.8%,有14个bp的差异,与驯鹿的同源性为95.7%。

3个山羊品种角蛋白辅助蛋白7基因的遗传多态性分析

本研究采用PCR-SSCP方法对陕北白绒山羊、太行黑山羊及南疆绒山羊的角蛋白辅助蛋白(keratin-associated pro-teins,KAP)7基因进行遗传多态性研究。结果显示,KAP7基因在3个山羊品种中有多态性,有AA和AB 2种基因型,AA基因型均为其优势基因型。测序结果发现,KAP7基因在129bp处存在C→G的突变,突变的位置位于5′调控区。