蛋白激酶全抑制分析揭示KG-1细胞增殖的分子机制

目的:通过分析KG-1细胞对各种蛋白激酶抑制剂的反应,探讨其增殖的分子机制。方法:采用CCK-8法、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western-blot检测各种蛋白激酶抑制剂对KG-1细胞增殖、相关基因mRNA表达水平以及FGFR1下游信号通路蛋白磷酸化水平的影响。结果:NVP-BGJ398和PD173074有效抑制KG-1细胞的增殖,表明FGFR及其下游信号通路在KG-1细胞增殖过程中具有关键作用。使用FGFR抑制剂处理后,p-FGFR1和p-STAT5水平显著下降(P<0.001),p-Akt水平稍有下降(P<0.05),并未影响p-ERK水平(P>0.05)。结论:FGFR1OP2-FGFR1主要作用于下游STAT5信号通路,以促进细胞增殖。蛋白激酶全抑制分析是一种可靠而直接的方法,可用于确定癌细胞增殖的分子机制。

三氧化二砷联合普纳替尼对白血病细胞KG-1的抑制效应

目的:探讨小分子酪氨酸激酶抑制剂普纳替尼联合三氧化二砷(arsenic trioxide,ATO)对人急性髓系白血病细胞KG-1的作用及可能机制。方法:CCK-8法检测普纳替尼及ATO对KG-1细胞增殖的影响;流式细胞术AnnexinⅤ/PI双重染色法检测细胞凋亡;实时荧光定量PCR检测细胞凋亡相关基因的表达;Western blot检测凋亡相关蛋白、成纤维细胞生长因子受体1(fibroblast growth factor receptor 1,FGFR1)蛋白及信号通路分子磷酸化水平的表达变化。结果:(1)ATO及普纳替尼对KG-1细胞的增殖抑制作用呈剂量依赖性,两药联合较单药作用具有更高的增殖抑制率、更少的集落形成及更多的细胞凋亡,差异均有统计学意义。(2)与DMSO组相比,ATO或普纳替尼均能显著下调Bcl-2表达,上调Bax及Caspase-3表达(P均<0.05);与单药作用相比,联合用药促进Bax及Caspase-3表达的作用更强(P均<0.01)。(3)普纳替尼显著抑制FGFR1基因及蛋白的表达(P均<0.01),ATO的加入并未使FGFR1表达进一步下降。信号通路研究显示,ATO可以显著抑制m-TOR和MAPK、STAT5的磷酸化(P均<0.001),但对PI3K/AKT、STAT3的磷酸化无明显影响。普纳替尼可以显著抑制FGFR1蛋白表达及STAT3、STAT5的磷酸化(P均<0.001),但对PI3K/AKT及MAPK的磷酸化无明显影响。两药联合后,STAT3的磷酸化水平较ATO或普纳替尼单药组进一步下调(P均<0.01)。结论:普纳替尼及ATO可能通过不同机制抑制KG-1细胞增殖及集落形成并诱导细胞凋亡;两药联合可进一步增强对KG-1细胞株的抑制效应。

大黄素诱导白血病KG-1a细胞凋亡及对Bcl-2/Bax mRNA表达的影响

目的本研究观察大黄素(emodin)对人急性髓系白血病KG-1a细胞的增殖及凋亡影响,探讨Bcl-2/Bax基因在其中的作用。方法采用四唑蓝比色试验(MTT)检测大黄素对KG-1a细胞增殖的影响;流式细胞术(FCM)测定细胞周期变化与凋亡情况;RT-PCR法检测大黄素作用后细胞Bcl-2/Bax mRNA表达的变化。结果大黄素能抑制KG-1a细胞的增殖,作用48 h的半数抑制浓度(IC50)约为171.8μmol/L流式细胞仪分析出现典型的亚二倍体峰(凋亡峰),将细胞阻滞于G0/G1期,大黄素作用后KG-1a细胞Bcl-2基因表达下调,而Bax基因表达上调,并呈量效关系。结论大黄素可诱导KG-1a细胞凋亡,其机制可能与下调Bcl-2,上调Bax基因表达水平有关。

白藜芦醇增强TRAIL对人髓系白血病KG-1a细胞的细胞毒作用

目的：观察白藜芦醇作用前后TRAIL对人髓系白血病KG-1a细胞的细胞毒作用的变化。方法：流式细胞仪检测KG-1a细胞表面CD34和CD38的表达,二甲氧唑黄（XTT）细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒检测白藜芦醇作用前后TRAIL对KG-1a细胞增殖的影响,AnnexinV-FITC/PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡变化。流式细胞仪检测白藜芦醇作用前后KG-1a细胞表面TRAIL死亡受体表达变化。结果：人髓系白血病KG-1a细胞CD34＋CD38-占（58.67±2.87）%,101 000 ng/ml的TRAIL对KG-1a细胞增殖无明显影响,但对白藜芦醇作用后的KG-1a细胞的增殖有明显抑制作用,白藜芦醇能促进TRAIL诱导KG-1a细胞凋亡,并能上调KG-1a细胞表面TRAIL死亡受体DR5的表达。结论：白藜芦醇能增强TRAIL对人髓系白血病KG-1a细胞的细胞毒作用,其机制可能与白藜芦醇上调KG-1a细胞表面TRAIL死亡受体DR5的表达有关。

GM-CSF对受辐射KG-1细胞的增值及细胞周期的影响

以临床上常用的细胞因子GM-CSF刺激受辐射的人髓性白血病细胞株KG－1，观察细胞的增殖情况及周期变化。结果显示；GM－CSF刺激受辐射KG－1细胞的增殖；并且能促进细胞跳出GO／G1阻滞，对S期似有促进作用及增加G2／M期。对未受照射的KG－1细胞，GM－CSF刺激效应不如受照射细胞。

白藜芦醇诱导KG-1细胞凋亡作用与bcl-2/bax表达相关性研究

本研究观察白藜芦醇(RES)体外诱导KG-1细胞凋亡的作用,探讨白藜芦醇诱导白血病细胞凋亡的可能作用机制。以不同浓度的白藜芦醇作用于KG-1细胞,用噻唑蓝(MTT)比色法分析细胞生长状态;透射电镜观察KG-1细胞凋亡的形态学变化;流式细胞术(FCM)测定细胞凋亡与周期分布;半定量RT-PCR、流式细胞技术检测细胞bcl-2、bax表达水平。结果表明:白藜芦醇可明显抑制KG-1细胞增殖(p<0.05),与对照组比较,白藜芦醇作用后KG-1细胞发生S期阻滞(p<0.01),细胞凋亡增高(p<0.01),bcl-2表达下调(p<0.05),而bax表达明显上调(p<0.01)。结论:白藜芦醇可诱导KG-1细胞凋亡,其机制可能与下调bcl-2、上调bax表达水平有关。

洛伐他汀对HL-60、KG-1、K562白血病细胞体外作用的研究

目的:观察胆固醇合成抑制剂洛伐他汀(lovastatin,LOV)对HL60、KG1、K562白血病细胞增殖、凋亡的影响,并进一步探讨其作用机制。方法:首先利用MTT法、台盼蓝拒染法观察LOV对HL60、KG1、K562细胞增殖及活力的影响。再通过细胞形态观察,DNA凝胶电泳,流式细胞术分析,RTPCR半定量测定bcl2mRNA水平等技术,系统观察LOV对HL60、KG1、K562体外诱导凋亡的情况。结果:①LOV抑制HL60、KG1、K562细胞增殖,IC50分别为17.16、51.65、58.95μmol/L;②LOV诱导HL60、KG1、K562细胞凋亡,影响细胞周期进程,细胞阻滞于G1/S期;LOV在诱导HL60细胞凋亡过程中随作用时间延长,bcl2表达水平逐渐下降。结论:LOV抑制HL60、KG1、K562细胞增殖并诱导凋亡,阻滞细胞周期进程于G1/S期;bcl2参与了LOV诱导凋亡的基因调控。

沉默SUV39H1基因对急性髓系白血病KG-1细胞凋亡的影响

本研究旨在探讨沉默SUV39H1基因对急性髓系白血病细胞株KG-1增殖和凋亡的影响。将SUV39H1 siRNA经LipofectamineTM2000转染至KG-1细胞,应用MTS法检测细胞增殖率,观察SUV39H1 siRNA对KG-1细胞增殖的影响;流式细胞术分析细胞凋亡;Western blot检测SUV39H1 siRNA作用后P15和凋亡相关蛋白BCL-2、procaspase-9、procaspase-3、C-MYC的表达。结果表明,沉默SUV39H1基因可抑制细胞增殖,SUV39H1 siRNA浓度为30、60、120、240 nmol/L作用48 h后,KG-1细胞的增殖率分别为(76.43±1.98)%、(51.31±1.84)%、(37.31±1.61)%、(18.94±3.22)%,差异具有统计学显著意义(P<0.05);SUV39H1 siRNA可上调P15基因的表达;SUV39H1 siRNA可诱导细胞凋亡,30、60、120 nmol/L SUV39H1 siRNA作用48 h后,KG-1细胞凋亡率分别为(40.2±5.1)%、(56.8±4.8)%、(71.6±5.6)%,差异有统计学显著意义(P<0.05);抗凋亡相关蛋白BCL-2、procaspase-9、procaspase-3、C-MYC的表达减少。结论:SUV39H1 siRNA能抑制KG-1细胞的增殖并诱导其凋亡,有望成为白血病治疗的一个新的靶点。

大黄素和叠氮胸苷对Egr-1 siRNA转染的KG-1a细胞的增殖和凋亡的影响

目的:本研究旨在观察Egr-1基因KG-1a细胞转染后,大黄素联合AZT对KG-1a细胞增殖的影响及其作用机理。方法:采用电转法瞬时转染Egr-1 siRNA,细胞分为空白对照、非特异对照(转染非特异序列)和目的 siRNA(转染Egr-1 siRNA)3组。流式细胞术测定转染效率,MTT法检测各组细胞增殖率,实时荧光定量PCR检测Egr-1基因的表达水平。各组细胞经大黄素10μmol/L或/和AZT 3200、1600μmol/L作用后,应用MTT法检测细胞增殖抑制率,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果:电转染Egr-1 siRNA转染效率可达59.21%以上,目的 siRNA组与空白对照和非特异性对照组相比,细胞增殖明显增加,Egr-1 mRNA的表达水平显著下降(P<0.001);大黄素和AZT联合对空白对照和非特异性对照组细胞的增殖抑制均呈现协同作用,联合作用指数(CI)均小于1,而对目的siRNA组细胞的CI大于1,增殖抑制作用与单用AZT相似(P>0.05)。目的 siRNA组细胞凋亡率较空白对照降低(P<0.001)。结论:大黄素联合AZT协同抑制KG-1a细胞增殖和促进凋亡的作用与Egr-1基因有关。

信号通路抑制剂XL765对人白血病KG-1细胞株的抑制效应研究

目的:探讨PI3K/mTOR信号通路抑制剂XL765(SAR245409, Voxtalisib)对人急性髓系白血病细胞株KG-1细胞的抑制效应及可能的作用机制。方法:应用CCK-8法检测XL765对KG-1细胞增殖的影响;平板集落形成实验检测XL765对KG-1细胞集落形成的抑制情况;Annexin V/PI双染色流式细胞术检测XL765对细胞凋亡的影响;实时荧光定量PCR检测细胞凋亡相关基因的表达;Western blot法检测凋亡相关蛋白的表达水平及信号通路分子磷酸化水平的变化。结果:XL765能有效抑制KG-1细胞的增殖,抑制率呈剂量依赖性增加;与DMSO处理组相比,加入XL765后,KG-1细胞的集落形成能力显著下降(P=0.0002);XL765能有效诱导细胞凋亡(P<0.001);XL765作用KG-1细胞48 h后,细胞的凋亡相关基因BCL-2表达下调,BAX及Caspase3表达上调,其差异均有统计学意义(P<0.05);与DMSO组对比,实验组BAX及Caspase3活化蛋白表达上调,同时BCL-2蛋白表达下调,信号蛋白PI3K、AKT及S6K磷酸化表达下调,其差异均有统计学意义(P值均<0.005)。结论:XL765能有效抑制KG-1细胞增殖及集落形成,并诱导细胞凋亡,其机制可能与调节凋亡蛋白BCL2、BAX及Caspase3水平及抑制PI3K、AKT及S6K磷酸化水平相关。

TGF-β_1对白血病KG-1细胞株Gli1表达的影响

目的证明在白血病KG-1细胞株中存在TGF-β信号通路对Gli的调控作用。方法 (1)用0.1、1、10ng/mL TGF-β1分别作用于KG-1细胞,时间分别为6、12、24h。处理结束后收集细胞,提取mRNA,检测Gli1的表达。(2)5ng/mL TGF-β1、5ng/mL TGF-β1联合5μmol SIS3分别作用于KG-1细胞24h。处理结束后收集细胞,提取mRNA,检测Gli1的表达。结果 (1)1～10ng/mL TGF-β1分别作用于KG-1细胞6、12、24h,从12h起并至少持续至24h,其Gli1的mRNA表达较对照组明显减少;(2)5ng/mL TGF-β1、5ng/mL TGF-β1联合5μmol SIS3分别作用于KG-1细胞24h,其Gli1的mRNA表达与对照组比较:5ng/mL TGF-β1组较对照组降低,而5ng/mL TGF-β1联合5μmol SIS3组较对照组明显增高。结论应用TGF-β1可以降低KG-1细胞Gli1的表达,TGF-β1降低KG-1细胞细胞Gli1的表达是通过TGF-β/Smad3途径介导的,可被SIS3所抑制,不依赖于Ptch/Smo途径。

白藜芦醇诱导KG-1细胞凋亡作用机制的初步研究

通过观察白藜芦醇诱导人急性白血病细胞株KG-1凋亡的作用,检测bcl-2、caspase-3的表达,探讨白藜芦醇诱导白血病细胞凋亡的作用机制。采用噻唑蓝(MTT)比色法分析细胞生长状态;瑞-吉染色、透射电镜观察KG-1细胞凋亡的形态学变化;流式细胞术(FCM)测定细胞凋亡与周期分布;半定量RT-PCR检测bcl-2 mRNA、caspase-3 mRNA表达水平。结果显示白藜芦醇可明显抑制KG-1细胞增殖(P<0.01),与对照组相比,实验组使细胞发生S期阻滞(P<0.01),促进细胞凋亡(P<0.01),使bcl-2的表达下调,上调caspase-3的表达(P<0.05)。结论:白藜芦醇能诱导KG-1细胞凋亡,其机制可能与下调bcl-2、上调caspase-3表达水平有关。

白藜芦醇诱导白血病KG-1细胞凋亡及对其细胞周期的影响

目的:探讨白藜芦醇诱导人白血病细胞株KG-1细胞凋亡的作用。方法:以不同浓度的白藜芦醇作用KG-1细胞,用噻唑蓝(MTT)比色法分析细胞生长状态;透射电镜观察KG-1细胞凋亡的形态学变化;流式细胞术(FMC)测定细胞凋亡率和细胞周期分布。结果:白藜芦醇可明显抑制KG-1细胞增殖(P<0.05),与对照组比较,白藜芦醇作用后,KG-1细胞发生S期阻滞(P<0.01),且细胞凋亡率增高(P<0.01)。结论:白藜芦醇能明显抑制KG-1细胞增殖,使细胞周期阻滞在S期,并能进一步诱导其凋亡。

淫羊藿素对KG-1a细胞增殖和凋亡的影响及其相关作用机制

目的:分析淫羊藿素抑制Wnt/β-catenin信号通路干预急性髓系白血病KG-1a细胞增殖的可能机制,为开发治疗急性髓系白血病药物提供实验依据。方法:50只c57BL/6小鼠编号后随机分为空白对照、模型对照和淫羊藿素高、中、低剂量共5组(n=10只),除空白对照组外均采用腹腔注射人急性髓系白血病细胞KG-1a的方法建模。淫羊藿素高、中、低剂量组分别按80、40和20 mg/kg剂量肌肉注射淫羊藿素治疗3周,模型对照组和空白对照组肌肉注射生理盐水。采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测S期激酶相关蛋白2(SKP2)、β-连环蛋白(β-catenin)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)及多聚腺素二磷酸核糖多聚酶[poly(ADP-ribose)polymerase;PARP]蛋白表达;采用分光光度法检测细胞中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)和天冬酶-3酶原(Procaspase-3)活性;流式细胞术分别检测经淫羊藿素处理后的细胞周期时相分布和细胞凋亡率情况。结果:淫羊藿素可增强Caspase-3活性,降低Procaspase-3的水平,还可上调E-cadherin蛋白的表达,下调SKP2和β-catenin蛋白的表达,呈剂量依赖性增加PARP蛋白表达,经淫羊藿素处理后细胞凋亡明显,KG-1a细胞被阻滞于G_0/G_1期,KG-1a细胞生长明显受到抑制。结论:淫羊藿素能够剂量依赖性地裂解PARP,以诱导人急性髓系白血病细胞株KG-1a细胞凋亡,其作用机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路及其下游相关基因表达有关。

蛋白酶体抑制剂MG132诱导KG-1细胞凋亡的机制研究

研究蛋白酶体抑制剂MG132对人急性髓性白血病细胞株KG-1的致凋亡作用及其对细胞内信号传导因子NF-κB与凋亡蛋白PARP表达的影响。采用CCK-8法检测MG132对KG-1细胞增殖的抑制作用;利用Hoechst33342染色法,从形态学上观察凋亡的KG-1细胞;Western blot检测NF-κB活性及与凋亡相关的蛋白变化情况。CCK-8法检测结果表明,MG132能明显抑制KG-1细胞生长,并呈现时间依赖性和浓度依赖性;Hoechst染色和Western blot检测实验证明,MG132诱导KG-1细胞发生凋亡的同时,NF-κB活性明显降低,细胞凋亡蛋白PARP降解为P89蛋白。以上结果显示,MG132能诱导KG-1细胞凋亡,其机制可能与MG132抑制NF-κB信号转导通路,下调NF-κB表达继而增加凋亡蛋白PARP剪切有关。

急性髓系白血病细胞中DICER1基因的表达及其功能研究

目的:检测急性髓系白血病细胞株HL-60、KG-1细胞中DICER1基因的表达水平,研究DICER1基因沉默对HL-60、KG-1细胞增殖、凋亡的影响,探寻DICER1在白血病发病机制中的作用。方法:应用Real-time PCR和Western blot检测DICER1在白血病细胞株HL-60、KG-1中mRNA和蛋白的相对表达水平。用LipofectamineTMLTX将DICER-shRNA载体转染HL-60、KG-1细胞,Real-time PCR和Western blot的方法从mRNA和蛋白水平检测DICER1的干扰效率。CCK-8法检测DICER1干扰后对白血病细胞增殖的影响,流式细胞仪检测DICER1干扰后白血病细胞凋亡率。结果:以正常HEK293细胞为对照,白血病细胞株HL-60、KG-1中DICER1 mRNA和蛋白的表达水平显著高于正常HEK293细胞(P<0.05)。DICER1-shRNA转染HL-60、KG-1细胞5天后,DICER1 mRNA和蛋白表达水平显著下降,干扰效果显著(P<0.05);CCK-8实验结果表明:与对照组细胞相比,DICER1干扰后白血病细胞增殖力显著降低(P<0.05);流式细胞分析表明:与正常细胞和对照组细胞比较,DICER1干扰后白血病细胞凋亡显著增加(P<0.01)。结论:DICER1在白血病细胞株HL-60、KG-1中高表达,具有促进白血病细胞增殖,抑制凋亡的作用。

新酪氨酸激酶抑制剂BGJ398对白血病细胞株KG-1细胞的抑制效应研究

【摘要】目的探讨针对FGFRl的酪氨酸激酶抑制剂BGJ398对人急性髓系白血病细胞株KG-1细胞的影响及可能的作用机制。方法CCK-8法检测BGJ398对KG-1细胞增殖的影响；流式细胞术AnnexinV／PI双重染色法检测BGJ398对细胞凋亡的影响；RQ．PCR检测细胞凋亡相关基因的表达；Westernblot法检测凋亡相关蛋白、FGFRlOP2-FGFRl融合蛋白及信号通路分子磷酸化水平的表达变化。结果BGJ398能有效抑制KG-1细胞增殖，抑制率呈剂量依赖性升高，并能诱导细胞凋亡。BGJ398作用KG．1细胞48h后，与对照组比较凋亡相关基因Bcl。2表达下降（0．342±0．054对1．026±0．165，t=3．94，P=0．017），caspase．3表达上调（0．456±0．189对1．008±0．091，t=16．44，P〈0．001），差异均有统计学意义。与对照组相比，BGJ398作用组caspase-3活化蛋白表达增加，同时Bcl-2蛋白表达下凋；FGFRlOP2-FGFRl融合蛋白水平及AKT、S6K1磷酸化水平下捌，差异均有统计学意义∽值均〈0．01），但ERK磷酸化表达水平无明显改变。结论BGJ398能有效抑制KG-1细胞增殖并诱导细胞凋亡，其机制可能与抑制FGFR1表达、下调Bcl-2水平、促进Caspase-3活化及抑制AKT和S6K磷酸化有关。

肝脂素诱导KG-1细胞凋亡作用的研究

目的探讨肝脂素是否可诱导白血病细胞系KG-1细胞发生凋亡及其最佳药物作用浓度及作用时间。方法应用肝脂素作用于KG-1细胞,采用锥虫蓝拒染法、MTT细胞活性测定法,确定肝脂素作用于KG-1细胞的最佳药物作用浓度和作用时间,以瑞特染色细胞形态学观察法、流式细胞仪检测肝脂素作用前后KG-1细胞DNA分布,并提取肝脂素作用前后KG-1细胞的DNA进行琼脂糖电泳。结果肝脂素诱导后的KG-1细胞细胞形态学呈现凋亡,DNA电泳出现梯状DNA,流式细胞仪检测出现亚凋亡峰。肝脂素作用于KG-1细胞的最佳药物作用浓度为250mg/ml,最佳药物作用时间为用药后10￣22h。结论肝脂素可直接诱导KG-1细胞发生凋亡,其分子机制有待进一步探讨。

应用mRNA差异显示法检测肝脂素诱导的KG-1细胞凋亡相关基因表达的改变

目的观察肝脂素（heplipin）对KG-1细胞的凋亡诱导作用。比较肝脂素诱导KG-1细胞凋亡前后的基因表达谱，寻找与白血病细胞凋亡相关的基因。方法应用DNA倍体分析和DNA凝胶电泳的方法，证实肝脂素可诱导KG-1细胞凋亡。采用差异显示逆转录聚合酶链反应（DDRT—PCR）的方法寻找肝脂素诱导前与诱导16、20h后的基因表达差异片段，并对其进行克隆分析。结果250μg/ml肝脂素作用KG-1细胞16、20h细胞凋亡率分别为13．5％和30．4％，显著高于未经肝脂素诱导组（1．5％）。肝脂素诱导KG-1细胞凋亡前后存在明显的基因表达差异，Wnt13和ATPase 3基因是肝脂素诱导KG-1细胞凋亡相关下调基因。结论肝脂素诱导KG-1细胞凋亡，其机制是一个多基因参与的过程。肝脂素诱导KG-1细胞凋亡与Wnt13和ATPase 3基因有关。Wnt13基因在多种肿瘤细胞中高表达，在白血病细胞系中被检测到尚属首次。

TGF-β对KG-1细胞株Gli 2表达影响

目的探讨在白血病KG-1细胞株中转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)信号通路对Gli的调控作用。方法用0.1、1、10 ng/mL TGF-β1分别作用于KG-1细胞6、12和24 h,收集细胞,提取mRNA,检测Gli 2表达;5 ng/mL TGF-β1、5 ng/mL TGF-β1+5μmol/L SIS 3(specific inhibitor of Smad3)分别作用于KG-1细胞24 h,收集细胞,提取蛋白,检测Gli 2表达。结果 1、10 ng/mL TGF-β1分别作用于KG-1细胞6、12、24 h,其Gli 2的mRNA表达分别为0.78、0.51、0.16和0.73、0.59、0.15,与对照组比较,明显减少(P<0.05);与对照组比较,5 ng/mL TGF-β1组Gli 2蛋白表达明显降低,而5 ng/mL TGF-β1+5μmol/L SIS3组Gli 2蛋白表达明显升高。结论 TGF-β降低KG-1细胞Gli 2表达是通过TGF-β/Smad3途径介导的,不依赖于Ptch/Smo途径。