Kir2ds4基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

本研究旨在构建kir2ds4基因RNAi慢病毒载体。针对已经筛选确定的kir2ds4基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的OligoDNA,退火形成双链DNA,与经HpaI和XhoI酶切后的pSicoR-GFP载体[含U6启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接产生LV-shkir2ds4慢病毒载体,应用PCR筛选阳性克隆并进行测序鉴定。用LV-shkir2ds4,包装系统质粒共转染包装细胞293T细胞,产生慢病毒颗粒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度。结果表明,PCR和测序结果证实成功地构建了kir2ds4shRNA的慢病毒载体LV-shkir2ds4。293T细胞测定病毒滴度为6×108TU/ml。结论:成功地构建了人kir2ds4基因RNAi慢病毒载体。

KIR2DS4等位基因在无关全相合异基因造血干细胞移植中的作用

目的 研究中国南方汉族人群中KIR2DS4等位基因分布及2DS4基因对无关供者全相合造血干细胞移植（HSCT）的影响.方法 采用基因测序（Sequenee-based testing,SBT）和TOPO-TA 克隆相结合的方法 ,对接受HSCT的75对HLA-A、-B、-Cw、-DRB1、-DQB1高分辨全相合的供、受者进行KIR2DS4等位基因分型,150名供、受者均为中国南方汉族人群,75例受者中急性淋巴细胞白血病（ALL）29例,慢性粒细胞白血病（CML）24例,急性髓系白血病（AML）19例,其他恶性血液病3例.结果 150名供、受者中139例（92.7%）存在KIR2DS4基因,对2DS4基因全长测序后发现4个2DS4等位基因：KIR2DS4＊00101、＊003、＊004和＊007;109例（78.4%）存在2DS4＊00101;2DS4缺失型（具有1个或缺失2DS4＊00101基因）与完整型（具有两个2DS4＊00101基因）的存在比率为1：2;发现3个KIR2DS4新基因.当供者KIR分型为B/x（40例）时,移植后总体生存率明显高于供者为A/A组（35例）[RR=3.1（95%CI 1.1～8.6）,P=0.007];当供者为完整型（36例）时,移植后总体生存率低于供者为缺失型（39例）（P=0.031）;在A/A组中,当供者为完整型（14例）时,移植后急性移植物抗宿主病（GVHD）的发生率明显高于供者为缺失型（21例）[RR=9.0（95%CI 1.2～66.9）,P=0.010],并以Ⅲ～Ⅳ度aGVHD尤为明显（P=0.006）.结论 SBT与TOPO-TA基因克隆的高分辨分型方法可用于研究KIR基因家族多态性,并且移植前在HLA分型的基础上对供受者进行KIR2DS4基因分型,可能对临床选择合适的供者提供有利的依据.

中国南方汉族人群KIR2DS4基因的多态性

目的探讨南方汉族人群KIR2DS4分子遗传多态性。方法应用特异性PCR引物扩增306名无关个体KIR2DS4基因的全部外显子，确定KIR2DS4框架基因的有无。对存在KIR2DS4的样本，对该基因的全部外显子进行双向测序，用Assign3．5分析软件鉴定基因型。在测序分型中出现与国际IPD-KIR数据库不完全匹配结果的样本，进行cDNA分子克隆和单倍型测序。结果306名南方汉族无关个体中，携带KIR2DS4基因的个体为297例，经测序分型，均获得了清晰的序列峰图。共检出了7种等位基因，其中3个新等位基因被世界卫生组织HLA因子命名委员会KIR分委会正式命名。检出的等位基因及其频率分别为KIR2DS4＊00101（78．8％）、＊003（10．5％）、＊004（16．0％）、＊010（23．2％）、＊017（0．3％）、＊00105（0．3％）和＊018（0．7％），未检出KIR2DS4＊007等位基因。能正常表达于细胞表面的等位基因（KIR2DS4＊00101、＊017、＊00105）和不能正常表达于细胞表面的等位基因（KIR2DS4＊003、＊004、＊010、＊018）的检出比例分别为79．4％及50．4％，约为1．6：1。结论获得了南方汉族人群KIR2DS4等位基因分子遗传多态性，可为移植、疾病关联研究及人类进化等提供基础数据。

KIR2DS4基因分型方法建立及新等位基因KIR2DS4^(*)016的鉴定

目的建立稳定的KIR2DS4基因测序分型法并研究KIR2DS4在中国汉族人群中等位基因多态性。方法采用PCR序列特异性引物(sequence specific primer,SSP)分析法对222名随机中国汉族个体基因组中的KIR2DS4基因进行阴阳性初筛鉴定,对KIR2DS4阳性的标本采用高保真、长片段PCR测序分型技术(PCR-sequence based typing,PCR,PCR-SBT)对KIR2DS4基因的第4、5外显子的片段进行扩增、测序及分型。结果建立的PCR-SBT方法成功扩增出KIR2DS4基因的第4、5外显子序列,长度达3.2 kb。探究中国汉族人群中KIR2DS4等位基因型及频率。检出KIR2DS4阳性个体为209个,阳性率为94.1%。测序分型共发现12种基因型和7种等位基因,6种已知的等位基因及其检出频率为:KIR2DS4^(*)00101/011(180次,81.1%),KIR2DS4^(*)010(53次,23.9%),KIR2DS4^(*)004(34次,15.3%),KIR2DS4^(*)003(15次和6.8%),KIR2DS4^(*)006(2次,0.9%)以及KIR2DS4^(*)015(1次,0.5%)。发现并鉴定一个新等位基因KIR2DS4^(*)016,与其最相近的等位基因KIR2DS4^(*)010区别在第5外显子,KIR2DS4^(*)010的第5外显子是22 bp缺失型,而KIR2DS4^(*)016的第5外显子为完整型。该新等位基因在受检人群中被发现3次,频率为1.4%,并非罕见等位基因,该等位基因序列已向GenBank(登录号:KC414890)及IPD-KIR数据库(提交号:IWS40001804)提交,并获得世界卫生组织HLA系统命名因子委员会的命名。结论本文中我们成功建立了KIR2DS4基因4、5外显子测序分型方法,并对其等位基因多态性进行了探究,发现了新的KIR2DS4等位基因型,丰富了中国汉族人群KIR2DS4基因多态性数据。

杀伤细胞免疫球蛋白样受体2DS4及其变体KIR1D与梅毒的关联性研究

目的探讨杀伤细胞免疫球蛋白样受体（killer cell immunogloblin-like receptor，KIR）基因KIR2DS4及其变体KIR1D与属于KIR基因单体型A（haplotypeA）的梅毒（syphilis）患者的关联性。方法采用序列特异性引物聚合酶链反应（PCR-SSP）法，分析192例无血缘关系的健康人和190例梅毒患者KIR基因的单体型，在归类于单体型A的梅毒患者和健康人群中分析KIR2DS4和KIR1D基因与梅毒的关联。结果在192例健康者中，含有KIR2DS4基因的个体为187例，其中有91例归类于纯合子（homozygous）单体型A，占48．7％（91／187）；在190例梅毒患者中，出现KIR2DS4基因的个体为181例，其中有89例归类于纯合子单体型A，占49．2％（89／181）。在归属于单体型A的人群中，KIR1D／KIRlD在梅毒病例组的基因型频率为16．9％，显著高于对照组（6．6％，P=0．032），而KIR2DS4／KIR2DS4和KIR2DS4／KIR1D基因型频率在两组间差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论KIR1D／KIR1D可能与纯合子单体型A中的个体的梅毒发生相关联。