基于CRISPR/Cas9技术构建猪KLF4基因敲除细胞系及其对细胞活性的影响分析

【目的】试验旨在利用CRISPR/Cas9技术构建Krüppel样因子4(Krüppel-like factor 4,KLF4)基因敲除的猪小肠上皮细胞,并探究KLF4基因敲除对于细胞活性和细胞周期的影响。【方法】在猪KLF4基因转录本第1外显子区域设计3条sgRNAs(sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3),经退火形成的双链DNA与线性化pGK1.1载体连接,产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞进行鉴定,并将重组载体转染至猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)。PCR扩增敲除位点附近序列,并通过测序判断sgRNA敲除效率;利用CruiserTMEnzyme酶切鉴定阳性细胞克隆,通过TA克隆测序鉴定敲除序列;利用Western blotting检测基因敲除细胞中KLF4蛋白表达情况。利用CCK-8和流式细胞术检测KLF4基因敲除后细胞活性和细胞周期的变化。【结果】重组载体测序结果显示,sgRNAs与pGK1.1成功连接。分析敲除效率发现,3个sgRNAs均可对靶序列进行敲除,其中sgRNA3有较高的敲除效率。PCR产物经CruiserTMEnzyme酶切筛选出2个阳性单克隆细胞。TA克隆测序分析发现,KLF4基因2个等位基因序列分别缺失116和137 bp。Western blotting结果表明,KLF4基因敲除细胞中未见KLF4蛋白表达。细胞活性及细胞周期分析显示,敲除KLF4基因极显著抑制了细胞活性(P<0.01),并导致G0/S细胞周期阻滞。【结论】本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了KLF4基因敲除的IPEC-J2细胞,且KLF4基因敲除可抑制细胞活性,并引起G0/S细胞周期阻滞。KLF4基因敲除细胞可为进一步探究KLF4基因功能及分子机制提供材料。

KLF4通过mTOR/P70S6K途径激活细胞自噬减轻高糖诱导的足细胞损伤

目的:分析Krüppel样转录因子4(KLF4)对高糖诱导的足细胞损伤的影响及相关分子机制。方法:体外培养MPC5细胞,将MPC5细胞分为对照组(Control组)、高糖组(HG组)、高糖+空载质粒对照组(HG+NC组)、高糖+KLF4过表达组(HG+KLF4组)。采用qRT-PCR法检测细胞中KLF4 mRNA表达水平,CCK-8法测定细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot法检测细胞中相关蛋白表达水平。结果:与Control组比较,HG组MPC5细胞中KLF4 mRNA和蛋白表达量降低,细胞增殖活性降低,细胞凋亡率升高,细胞中突触足蛋白(synaptopodin)、足蛋白(podocin)、肾蛋白(nephrin)、微管相关蛋白轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)、Beclin1蛋白表达量降低,P62蛋白表达量、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)/mTOR和磷酸化核糖体40S小亚基S6蛋白激酶(p-P70S6K)/P70S6K比值升高;差异均有统计学意义(P<0.05)。与HG组比较,HG+KLF4组MPC5细胞中KLF4 mRNA和蛋白表达量升高,细胞增殖活性升高,细胞凋亡率降低,细胞中synaptopodin、podocin、nephrin、LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白表达量升高,P62蛋白表达量、p-mTOR/mTOR和p-P70S6K/P70S6K比值降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:KLF4通过激活足细胞自噬减轻高糖诱导的足细胞损伤,其作用机制可能与调控mTOR/P70S6K信号通路有关。

miR-10b通过激活KLF4/Notch-1/STAT3信号途径加速腹主动脉瘤的进展

目的:miR-10b促进动脉瘤的进展但其机制未明确,本实验通过检测miR-10b对KLF4/Notch-1/STAT3途径的影响阐明其机理。方法:双荧光素酶实验验证miR-10b的靶基因。取20只apoE-/-小鼠构建腹主动脉瘤模型,其中10只尾静脉注射miR-10b过表达的慢病毒,分别记为模型组和miR-10b组。另取10只apoE-/-小鼠作为假手术组,28 d后解剖小鼠腹主动脉行病理学染色、Western-blot实验。将血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)作用后的THP-1巨噬细胞根据是否转染miR-10b mimic及其Nc对照、是否添加抑制剂分组:(1)Nc组;(2)miR-10b mimic组;(3)Nc+KLF4抑制组;(4)miR-10b mimic+KLF4抑制组;(5)Nc+Notch-1抑制组;(6)miR-10b mimic+Notch-1抑制组;(7)Nc+STAT3抑制组;(8)miR-10b mimic+STAT3抑制组,检测细胞内蛋白水平。结果:检测双荧光素酶活性得知miR-10b可靶向作用于基因KLF4。小鼠血管病理实验发现,与正常小鼠相比,动脉瘤模型小鼠的血管明显增粗、组织结构异常,miR-10b可加重血管病变;CD68+巨噬细胞、蛋白Notch-1、p-STAT3、MMP-2、MMP-9在假手术组、模型组与miR-10b逐渐增多,而α-SMA、蛋白KLF4逐渐减少。(1)、(2)两组细胞间,后者KLF4表达较少、而Notch-1、p-STAT3、MMP-2、MMP-9表达显著偏多;KLF4抑制剂抑制KLF4表达,而Notch-1显著增多;Notch-1被抑制而减少表达,p-STAT3也随之减少;p-STAT3被抑制表达,MMP-2与MMP-9表达量也明显降低。结论:miR-10b通过作用于KLF4/Notch-1/STAT3信号途径,引起动脉瘤组织中MMP-2、MMP-9表达增加,从而加速动脉瘤的进程。

MiR-92a-3p靶向KLF4促进肝细胞癌恶性进程

目的:探究微小RNA-92a-3p(miR-92a-3p)对肝细胞癌(HCC)的影响及其分子机制。方法:qRT-PCR检测人肝细胞癌细胞系SMMC-7721、Bel-7402、HepG2、Hep3B和人正常肝细胞系HL-7702中miR-92a-3p和Krüppel样因子4(KLF4)的表达。将SMMC-7721、Bel-7402细胞分组为Inhibitor NC组、miR-92a-3p Inhibitor组、mimic NC组、miR-92a-3p mimic组、mimic NC+oe-NC组、mimic NC+oe-KLF4组、miR-92a-3p mimic+oe-NC组、miR-92a-3p mimic+oe-KLF4组。qRT-PCR检测细胞中miR-92a-3p和KLF4的mRNA表达水平。Western blot检测KLF4蛋白表达水平。MTT增殖实验检测细胞活力。划痕愈合、Transwell侵袭实验分别检测细胞迁移能力和侵袭能力。通过TargetScan分析miR-92a-3p与KLF4的靶向关系,并通过双荧光素酶实验验证。结果:相比于正常细胞,miR-92a-3p在HCC细胞中高表达,KLF4在HCC细胞中低表达(P<0.05)。与正常表达组相比,下调miR-92a-3p显著抑制了SMMC-7721和Bel-7402细胞的增殖、迁移、侵袭能力(P<0.05)。双荧光素酶实验验证了miR-92a-3p与KLF4存在靶向结合位点。过表达KLF4能够阻碍HCC细胞的增殖、迁移和侵袭,抑制过表达miR-92a-3p对HCC细胞生长的促进作用,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:miR-92a-3p能够通过靶向下调KLF4来促进HCC细胞的增殖、迁移、侵袭。

LncRNA NEAT1通过调节miR-124-3p/KLF4轴改善过敏性鼻炎

目的长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)已被证明在过敏性鼻炎(allergic rhinitis,AR)发展中发挥重要作用。本研究旨在探究lncRNA NEAT1(nuclear enriched abundant transcript 1)在AR中的功能和分子机制。方法构建了卵清白蛋白(ovalbumin,OVA)诱导的AR小鼠模型和IL-13诱导的人鼻上皮细胞(human nasal epithelial cells,HNECs)模型。结果NEAT1在AR小鼠体内高表达。敲低NEAT1显著抑制了AR小鼠和HNECs中炎性因子的产生,并减少了细胞凋亡。进一步的研究表明,NEAT1的下调能够逆转miR-124-3p的上调和KLF4的下调,进而调节了IL-13诱导的HNECs中的炎性反应和细胞凋亡。此外,miR-124-3p过表达显著提高了HNECs细胞活力,抑制了细胞凋亡、炎症因子的产生和KLF4的表达。而NEAT1过表达显著逆转了这一现象。结论本研究发现NEAT1在AR中的高表达,并揭示了其通过miR-124-3p/KLF4信号通路调控炎性反应和细胞凋亡的机制。这些发现不仅为深入理解AR的分子机制提供了新的视角,还为进一步研究和治疗AR提供了潜在的靶点。

MiR-152-3p靶向调控KLF4促进结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭

目的:探讨微小RNA-152-3p(miR-152-3p)在结肠癌(CC)中的表达情况及靶向Krüppel样因子4(KLF4)对CC细胞的增殖、迁移和侵袭的影响。方法:通过starBase及TCGA数据库分析预测miR-152-3p与KLF4之间的靶向关系,以及各自在正常组织和CC组织中的表达情况差异;双荧光素酶和RIP实验验证miR-152-3p与KLF4之间的靶向关系;RT-q PCR检测miR-152-3p与KLF4在CC细胞系中的mRNA表达量;Western blot实验检测KLF4在CC细胞系中的蛋白表达水平;MTT实验检测细胞的增殖能力;划痕愈合实验检测细胞的迁移能力;Transwell实验检测细胞的侵袭能力;细胞周期实验和凋亡实验检测细胞的周期分布情况和凋亡百分率。结果:miR-152-3p在CC组织和细胞系中高表达(P<0.001),而KLF4低表达(P<0.01),且miR-152-3p能够靶向下调KLF4的表达(P<0.01)。miR-152-3p过表达能增高CC细胞系的增殖、迁移和侵袭能力,降低细胞周期在G0/G1期的分布,并抑制其凋亡(P<0.05);KLF4过表达可以抑制miR-152-3p对CC细胞增殖、迁移和侵袭能力的促进作用(P<0.05),使G0/G1期细胞比例增加(P<0.05),并促进细胞凋亡(P<0.05)。结论:miR-152-3p通过靶向下调KLF4的表达促进CC细胞的增殖、迁移和侵袭。

炎症微环境作用下BMP9通过ERK5/KLF4信号通路促进牙周膜干细胞成骨分化

目的:探讨骨形态蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)在炎症环境中是否通过ERK5/KLF4信号通路促进牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)成骨分化。方法:利用重组腺病毒技术,在TNF-α刺激的PDLSCs中过表达BMP9,通过RT-PCR和Western印迹法检测成骨相关基因及蛋白的表达变化。随后,通过转染技术使KLF4在PDLSCs中过表达,在炎症条件下观察其对成骨分化及相关基因表达的效应。在KLF4敲低的背景下过表达BMP9,观察其对成骨分化的影响。添加ERK5抑制剂BIX02189,揭示ERK5在BMP9诱导的成骨分化中的关键作用。采用SPSS 20.0软件包对数据进行统计学分析。结果:BMP9在炎症环境下显著促进PDLSCs成骨分化,并增强KLF4表达。KLF4过表达进一步加强了PDLSCs成骨分化。然而,当KLF4被敲低时,BMP9对PDLSCs成骨促进效应受到明显抑制。BMP9处理显著增加ERK5磷酸化水平,但在ERK5被抑制后,BMP9对成骨分化的促进效应大幅减弱。结论:BMP9可在炎症环境中通过ERK5/KLF4信号通路显著促进PDLSCs成骨分化。

苦参碱通过上调KLF4/Nrf2通路减轻H_(2)O_(2)诱导的人脐静脉内皮细胞氧化损伤

目的:基于KLF4/Nrf2途径探讨苦参碱对过氧化氢(hydrogen peroxide,H_(2)O_(2))诱导的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)氧化损伤的作用及机制。方法:培养HUVECs,采用CCK-8方法筛选苦参碱实验浓度。将HUVECs分为对照组、模型组和低、中、高浓度(0.5、1和2 mmol/L)苦参碱组,以H_(2)O_(2)(0.5 mmol/L)诱导建立HUVECs氧化损伤模型,检测细胞活力、细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性和谷胱甘肽过氧化物酶(gluta-thione peroxidase,GPX)活性;RT-qPCR和Western blot方法检测细胞中Krüppel样因子4(Krüppel-like factor 4,KLF4)、核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)、血红素加氧酶1(heme oxygenase-1,HO-1)、醌氧化还原酶1(quinone oxidoreductase 1,NQO1)及γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-glutamyl cysteine synthetase,γ-GCS)的mRNA和蛋白表达水平。进一步采用siRNA技术敲减KLF4基因表达,与苦参碱共同作用,观察上述指标的变化。结果:与模型组比较,苦参碱组细胞活力上升(P<0.05),ROS水平和MDA含量降低(P<0.05),SOD和GPX活性上升(P<0.05),KLF4、Nrf2、HO-1、NOQ1及γ-GCS表达水平升高(P<0.05)。抑制KLF4的表达后,苦参碱逆转H_(2)O_(2)引起的细胞活力降低、ROS升高及抗氧化应激分子表达的作用均显著减弱(P<0.05)。结论:苦参碱能够通过激活KLF4/Nrf2通路、抑制氧化应激来减轻H_(2)O_(2)诱导的HUVECs氧化损伤。

川芎嗪对H22肝癌小鼠血管生成及KLF4/VEGF/ADAMTS1通路的影响

目的 研究川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)对H22肝癌小鼠血管生成的影响及其分子机制。方法 40只BALB/c小鼠,皮下接种H22肝癌肿瘤细胞悬液建立荷瘤模型后随机分为模型组,低、高剂量组(TMP 25,50 mg/kg),阳性对照组(盐酸多柔比星2 mg/kg),连续给药10 d。ELISA检测各组小鼠血清谷丙转氨酶(glutamic-pyruvic transaminase,ALT)、门冬氨酸转氨酶(glutamic oxalacetic transaminase,AST)水平;计算抑瘤率;苏木精-伊红(hematoxylin eosin,HE)染色观察肿瘤组织的病理形态学变化;免疫组化染色观察肿瘤组织的微血管生成,以CD34标记肿瘤微血管;Western blot检测肿瘤组织中Kruppel样因子4(Kruppellike factor 4,KLF4)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、人金属肽酶含血小板反应蛋白(human A disintegrin and metalloprotease,ADAMTS) 1的表达变化。结果 连续治疗10 d后,与模型组比较,低、高剂量组、阳性对照组小鼠的肿瘤质量和转氨酶ALT、AST水平显著下降(P<0.01),癌巢数量减少,肿瘤细胞出现坏死和空泡样表现,肿瘤组织中KLF4、ADAMTS1蛋白表达显著增高,而VEGF蛋白表达显著降低(P<0.01)。免疫组化染色结果示模型组小鼠肿瘤组织CD34阳性表达率高,可见大量微血管生成,低、高剂量组小鼠随着TMP剂量的增加,肿瘤血管生成逐渐减少。结论 川芎嗪对H22肝癌小鼠的肿瘤生长具有一定的抑制作用,该作用与其调控KLF4、VEGF、ADAMTS1的蛋白表达,进而抑制肿瘤血管生成有关。

基于生信分析的KLF4、PRDX1在结肠癌中表达情况及临床相关性研究

目的本研究旨在通过TCGA和GEO数据库筛选与结肠癌预后相关的基因,结合临床数据验证关键基因对结肠癌术后复发转移的影响。方法基于GSE4486、GSE44076、GSE23408和GSE20970结肠癌数据集,筛选差异基因,利用STRING数据库和Cytohubba软件筛选出核心基因KLF4和PRDX1。通过TIMER和Prognoscan数据库分析KLF4和PRDX1基因对免疫浸润和患者生存期的影响,进行富集分析以探讨KLF4和PRDX1参与的生物学功能及信号通路,并分析其表达含量与免疫浸润基因和肿瘤增殖基因的相关性。本研究纳入156例结肠癌患者,检测肿瘤组织与癌旁组织中KLF4和PRDX1表达含量差异,并进行术后两年随访。多因素Cox回归分析KLF4和PRDX1表达含量与结肠癌复发转移的相关性。结果核心基因包括KLF4和PRDX1与结肠癌的预后密切相关。生存期分析表明,KLF4高表达和PRDX1低表达的患者生存期较长。KLF4与肿瘤免疫调控相关,其表达含量与CD4+T细胞、M1型巨噬细胞和B细胞浸润呈显著正相关性(均Rho>0.2,P<0.01),同时与M2型巨噬细胞浸润呈负相关性(Rho<-0.2,P<0.01)。PRDX1参与结肠癌细胞增殖的调控,其表达含量与细胞增殖基因KRAS、CDK1、CDK2、CDK4、E2F1表达含量呈显著正相关(Rho<-0.2,P<0.01)。与癌旁组织相比,结肠癌肿瘤组织中KLF4表达含量显著降低(0.27±0.02 V.S 0.97±0.03,P<0.05),而PRDX1表达含量显著升高(3.47±0.32 V.S 0.98±0.02,P<0.05)。多因素分析结果表明,KLF4低表达(HR=1.747,95%CI:1.543~2.885)和PRDX1高表达(HR=1.621,95%CI:1.342~2.143)是结肠癌术后复发转移的独立风险因素。结论KLF4低表达和PRDX1高表达是结肠癌术后复发转移的独立风险因素,KLF4、PRDX1表达情况可作为临床制定治疗方案的参考,同时为结肠癌的早期诊断和预后评估提供了新的靶点和策略。

KLF4与肺部相关疾病研究进展

Krüppel样因子4(Kruppel-like factor 4,KLF4),也称为肠道富集的Krüppel样因子(Gut-enriched kruppel-like factor,GKLF),是最早发现的KLF家族成员之一。它是一种高度保守的含锌指转录因子,可在人体多种组织中表达,调节细胞生长、增殖、分化、凋亡等多种过程[1],同时它是一种双功能转录因子,对于不同的靶基因能够通过不同的机制激活或抑制转录[2]。KLF4含有483个氨基酸,分子量为53 kDa,其特征在于羧基末端序列中含有三个锌指基序。

KLF4在肾透明细胞癌侵袭和迁移中的作用及其与SKA1的靶向调控关系探讨

目的探讨肾透明细胞癌(ccRCC)组织中锌指转录调节因子4(KLF4)的表达变化,及其调控纺锤体和动粒相关复合体亚基1(SKA1)促进ccRCC细胞侵袭、迁移的作用。方法从癌症和肿瘤基因图谱(TCGA)数据库下载440例ccRCC原位癌组织和80例伴有远处转移的ccRCC组织的转录组测序数据,分析KLF4在原位癌组织和伴有远处转移癌组织中的表达差异。取人肾癌细胞786-O、ACHN,分为KLF4过表达组、空载体组、共表达KLF4/SKA1组,采用慢病毒载体技术,分别转染pCMV-KLF4、pCMV、pCMV-KLF4和pCMV-SKA1质粒;采用Transwell小室实验观察各组细胞侵袭和迁移能力,Western blotting法检测细胞上皮间质转化相关蛋白E-cadherin、N-cadherin、Vimentin表达。取786-0、ACHN细胞,分为KLF4干扰组及干扰对照组、KLF4过表达组及空载体组,KLF4干扰组和干扰对照组分别转染siKLF4和siNC,KLF4过表达组和空载体组分别转染pCMV-KLF4、pCMV质粒;采用实时荧光定量PCR法检测细胞SKA1 mRNA表达,Western blotting法检测细胞SKA1蛋白表达;利用Jaspar和ConTra V3在线工具分析预测KLF4在SKA1启动子区的结合位点,并采用双荧光素酶报告实验进行验证。结果KLF4在伴有远处转移的ccRCC组织中的表达低于ccRCC原位癌组织(P<0.01)。在786-O和ACHN细胞中,与空载体组相比,过表达KLF4组细胞侵袭和迁移能力降低(P均<0.01);与过表达KLF4组比较,共表达KLF4/SKA1组细胞侵袭和迁移能力增加(P均<0.01)。与空载体组相比,过表达KLF4组E-cadherin蛋白表达水平升高、N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平降低;与过表达KLF4组比较,共表达KLF4/SKA1组E-cadherin蛋白表达水平降低、N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平升高(P均<0.05)。与siNC组相比,siKLF4组SKA1 mRNA及蛋白表达水平均升高;与pCMV空载体组相比,pKLF4过表达组SKA1 mRNA及蛋白表达水平均下降(P均<0.01)。SKA1转录起始位点上游850~900 bp启动子序列中存在KLF4的结合位点。双荧光素酶报告实验结果显示,与pSKA1-MUT+pKLF4/pCMV、pSKA1-WT+pCMV组比较,pSKA1-WT+pKLF4组荧光素酶活性降低(P均<0.01)。结论KLF4表达下调与ccRCC恶性进展相关,KLF4可通过结合SKA1启动子区特定序列负向调控SKA1表达,从而抑制ccRCC细胞的侵袭和迁移。

靶向敲减KLF4基因的重组腺相关病毒载体的构建及其在肺动脉高压动物模型中的应用

目的构建靶向敲减KLF4基因的重组腺相关病毒载体,并应用于肺血管疾病,为后期研究肺血管KLF4基因敲减在肺动脉高压大鼠中的作用及相关分子机制奠定基础。方法根据大鼠KLF4基因序列,设计针对大鼠特异性的siRNA序列,以pHBAAV-U6-MCS-CMV-EGFP作为空白载体,通过酶切技术构建带有GFP荧光标记的KLF4干扰腺病毒载体pHBAAV-r-KLF4shRNA-GFP,行测序分析,并进行病毒扩增、纯化及滴度测定。本研究对长时间(3个月)接触香烟烟雾的大鼠进行气道注入AAV1-KLF4-shRNA的干预治疗,观察大鼠右心室收缩压、平均右心室压等血流动力学指标改变。结果经测序检测显示,大鼠AAV1-KLF4-shRNA腺相关病毒载体构建成功。健康对照组、生理盐水模型组、对照病毒模型组、治疗干预组的右心室收缩压和平均右心室压比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论对长时间接触香烟烟雾的肺动脉高压模型大鼠应用AAV1-KLF4-shRNA腺相关病毒载体,能有效改善右心室收缩压和平均右心室压,该载体在相关疾病动物模型中应用有效,为后期顺利开展AAV1-KLF4-shRNA在肺动脉高压中的预防和治疗作用,以及相关分子机制的深入研究提供基础条件。

过表达KLF4通过Wnt/β-catenin信号通路抑制胃癌细胞EMT和细胞周期的实验研究

目的:探讨过表达KLF4通过Wnt/β-catenin信号通路抑制胃癌细胞上皮-间质转化和细胞周期的作用机制。方法:将课题组前期已成功转染过表达KLF4的BGC-823细胞分为KLF4过表达载体组(BGC823-OE组)、空病毒载体组(BGC823-NC组)和未经处理的BGC-823细胞组(BGC823-Ctrl组)。Western blot和qRT-PCR检测KLF4、EMT和Wnt信号通路相关蛋白和mRNA在三组细胞中的表达水平。CCK-8实验、划痕实验、Transwell迁移实验、平板克隆实验和流式细胞术观察各组细胞的增殖能力、迁移能力、克隆形成能力和细胞周期变化情况。结果:Western blot和qRT-PCR实验结果显示BGC823-OE组KLF4蛋白和mRNA表达水平明显升高。上皮-间质转化的上皮标志物E-cadherin蛋白和mRNA表达水平升高,间质标志物N-cadherin蛋白和mRNA表达水平降低。Wnt信号通路下游靶基因β-catenin和Cyclin D1的蛋白和mRNA表达水平降低。CCK-8增殖实验结果显示BGC823-OE组的增殖能力下降。划痕实验和Transwell迁移实验结果显示BGC823-OE组的迁移能力下降。平板克隆结果显示BGC823-OE组的克隆能力下降。流式细胞术结果显示BGC823-OE组G_(0)/G_(1)期比例增高,S期比例降低。结论:过表达KLF4可能通过Wnt/β-catenin信号通路抑制胃癌细胞EMT及阻滞胃癌细胞的细胞周期。

反复不明原因自然流产孕妇外周血单核细胞中lncRNASNHG5、KLF4表达及临床意义

目的:探讨反复不明原因自然流产(URSA)孕妇外周血单核细胞中长链非编码RNA(lncRNA)SNHG5、KLF4表达水平及临床意义。方法:选取2018年4月-2019年12月本院收治的URSA孕妇40例为流产组,正常妊娠要求人工流产孕妇40例为早孕组,健康非孕妇女40例为非孕组。测定外周血单核细胞中lncRNA SNHG5、KLF4表达水平,血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素4(IL-4)、IL-12水平。采用多因素logistic回归模型分析URSA发生相关因素。结果:非孕组、早孕组、流产组外周血单核细胞中lncRNA SNHG5 mRNA、KLF4 mRNA和蛋白表达,血清TNF-α、IL-4、IL-12水平均依次升高(均P<0.05)。外周血单核细胞中lncRNA SNHG5 mRNA、KLF4 mRNA和蛋白表达与血清TNF-α、IL-4、IL-12均呈正相关(均P<0.05)。异常高水平lncRNA SNHG5 mRNA、KLF4 mRNA和蛋白均为URSA发生的相关因素(P<0.05)。结论:URSA孕妇外周血单核细胞中lncRNA SNHG5、KLF4表达水平异常升高,且是URSA发生的影响因素。

黄连素通过KLF4减轻缺血/再灌注损伤所致的大鼠心肌细胞凋亡的作用机制研究

目的探讨黄连素(BBR)通过KRUPPEL样因子4(KLF4)减轻缺血/再灌注(I/R)损伤所致的大鼠心肌细胞凋亡的作用机制。方法将大鼠永久心肌细胞系H9C2细胞按随机数字表法分为4组,即对照组(正常培养4 h)、I/R组(诱导I/R模型)、BBR组(诱导模型期间给予50μmol/L BBR作用4 h)、KLF4小干扰RNA(siRNA)组(转染KLF4 siRNA后,诱导模型期间给予50μmol/L BBR作用4 h)。采用细胞计数试剂盒-8检测细胞活力,原位末端转移酶标记法染色和流式细胞术检测细胞凋亡情况,蛋白质印迹法检测细胞凋亡因子[包括B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)]、KLF4蛋白表达水平,实时定量逆转录-聚合酶链反应检测KLF4 mRNA表达水平。结果BBR组、I/R组、对照组H9C2细胞活力、细胞凋亡因子蛋白表达水平、膜阳性面积百分比、细胞凋亡率以及KLF4蛋白、mRNA表达水平比较,差异均有统计学意义(均P<0.05);其中BBR组细胞活力、Bcl-2蛋白表达水平以及KLF4蛋白、mRNA表达水平均明显高于I/R组(均P<0.05),Bax蛋白表达水平、膜阳性面积百分比、细胞凋亡率均明显低于I/R组(均P<0.05)。KLF4 siRNA组细胞活力明显低于BBR组(P<0.05),膜阳性面积百分比和细胞凋亡率均明显高于BBR组(均P<0.05)。结论BBR可以通过KLF4依赖的方式保护心肌细胞免受I/R损伤所致的细胞凋亡。

乳腺癌组织中eIF4E、eIF5A2、KLF4、YAP1的表达水平及临床意义

目的:探讨乳腺癌组织中真核细胞翻译起始因子4E(eIF4E)和5A2(eIF5A2)、Krüppel样因子4(KLF4)、Yes相关蛋白1(YAP1)的表达水平及临床意义。方法 :将接受手术治疗的乳腺癌组织50例作为观察组,同时选取50例癌旁正常组织作为对照组,检测两组eIF4E、eIF5A2、KLF4、YAP1的表达水平,分析其与乳腺癌病理特征的临床意义。结果 :观察组eIF4E、eIF5A2、YAP1阳性表达率均高于对照组(P <0.05),KLF4低于对照组(P <0.05);在临床分期Ⅰ~Ⅱ期及发生淋巴结转移的患者中,eIF4E、eIF5A2、YAP1高表达患者占比高于低表达(P <0.05),KLF4高表达患者占比低于低表达(P <0.05)。结论 :乳腺癌组织中,eIF4E、eIF5A2、YAP1水平呈高表达,KLF4水平呈低表达,是评估疾病进展的重要指标。

KLF4对肿瘤干细胞自我更新和增殖潜能的影响

目的:分析Kr櫣ppel样因子4(Krppel-like factor4,KLF4)对肿瘤干细胞T3A-A3自我更新和增殖能力的影响。方法:构建靶向干扰KLF4的慢病毒载体pLVTHM-shKLF4,利用前期实验分离与鉴定的肿瘤干细胞T3A-A3,应用RT-PCR和Western blotting分别检测pLVTHM-shKLF4感染后T3A-A3细胞中KLF4mRNA和蛋白的表达。细胞球形成实验检测pLVTHM-shKLF4感染对T3A-A3细胞自我更新的影响,平板集落形成实验检测T3A-A3细胞的克隆形成能力,流式细胞术检测T3A-A3细胞周期变化。裸鼠皮下移植瘤实验观察pLVTHM-shKLF4干扰KLF4表达后对T3A-A3细胞移植瘤生长的影响。结果:与肝癌细胞BEL-7402、HepG2相比,肿瘤干细胞T3A-A3表达更高水平的KLF4;pLVTHM-shKLF4感染能够在mRNA和蛋白水平下调T3A-A3细胞中KLF4的表达。pLVTHM-shKLF4感染的T3A-A3细胞形成细胞球的直径明显小于对照病毒的pLVTHM-shNC感染的T3A-A3细胞[(104.33±16.28)vs(186.67±28.15)μm,P<0.01],pLVTHM-shKLF4感染细胞形成的细胞克隆数目明显少于对照细胞[(83.5±7.78)vs(125±9.19)个,P<0.01),pLVTHM-shKLF4感染的T3A-A3细胞G1期比例明显升高[(39.65±4.03)%vs(29.35±1.00)%,P<0.01]。pLVTHM-shKLF4感染的T3A-A3细胞的移植瘤生长速度较对照细胞移植瘤明显减慢[细胞接种33 d,(46.14±12.94)vs(228.12±94.86)mm3,P<0.01]。结论:干扰KLF4的表达可抑制肿瘤干细胞T3A-A3的自我更新及其在体内外的增殖潜能。

KLF4和KLF5蛋白在不同临床分期胃癌组织中的表达及意义

背景与目的:胃癌的发生、发展及生物学行为受到多个分子信号通路的影响,转录因子是调控这些分子通路的重要因素。而转录因子KLF4(Krüppel-like factors 4)、KLF5(Krüppel-like factors 5)与胃癌相关性的报道比较罕见。因此探讨转录因子KLF4、KLF5对胃癌生物学行为影响的分子机制具有重要的意义。方法:收集158例手术切除的胃溃疡型腺癌组织标本,同时取78例癌旁组织作为对照。应用免疫组织化学SP法检测胃腺癌组织、癌旁组织中转录因子KLF4和KLF5蛋白的表达。结果:158例胃腺癌组织中KLF4的阳性表达率为40.50%,KLF5的阳性表达率为63.93%,KLF4和KLF5的表达与患者性别、年龄及肿瘤位置之间无显著相关性(P>0.05),与肿瘤有无淋巴转移及WHO临床分期之间有显著相关性(P<0.05)。随着临床分期等级的增加,KLF4表达呈现递减趋势,而KLF5表达呈现增加趋势,其表达率与肿瘤临床分期程度显著相关(P<0.05)。结论:胃癌组织中KLF4的低表达和KLF5蛋白高表达可能是胃黏膜恶性转变以及胃癌发生浸润转移的重要生物学标志,检测KLF4和KLF5对预测胃癌浸润转移有重要意义。

卵巢浆液性腺癌中SP1、KLF4和p21表达及其预后意义

目的探讨不同级别卵巢浆液性腺癌中SP1、KLF4和p21蛋白表达的差异和预后意义。方法应用免疫组化EliVision法检测卵巢低级别和高级别浆液性腺癌中SP1、KLF4和p21蛋白的表达,Kaplan-Meier单因素和Cox多因素生存分析其与患者预后的关系。结果 SP1、KLF4和p21蛋白在高级别浆液性腺癌中的阳性率分别为74.5%、17.0%和11.7%,低级别浆液性腺癌中的阳性率分别为65.2%、34.8%和26.1%,与对照组相比,SP1表达均明显升高(P<0.05),而KLF4和p21表达均明显降低(P<0.05)。三者在高、低级别液性腺癌中的表达差异无显著性(P>0.05)。SP1、KLF4和p21蛋白表达与高级别液性腺癌FIGO分期密切相关,且SP1还与术后有无残留灶密切相关(P<0.05)。卵巢高级别液性腺癌中SP1表达与KLF4、p21的表达均呈显著负相关(P<0.05)。高级别液性腺癌中SP1蛋白阳性者的5年生存率明显低于阴性者,而KLF4和p21蛋白阳性者的5年生存率明显高于阴性者(P<0.05)。Cox多因素分析显示,FIGO分期和SP1高表达是影响高级别浆液性腺癌预后的独立因素。结论 SP1蛋白过表达以及KLF4和p21蛋白低表达,参与了高、低级别浆液性腺癌的发生,三者表达与高级别浆液性腺癌的预后有关,且SP1是独立预后因素。