KLK4介导氟诱发成釉细胞凋亡的作用机制

目的探讨氟对成釉细胞中激肽释放酶4(kallikrein-4,KLK4)表达和细胞凋亡的影响及其作用机制。方法以不同浓度的氟化钠(NaF)处理ALC细胞24 h、48 h,qRT-PCR和Western blotting检测KLK4 mRNA及蛋白表达;CCK-8检测细胞相对活力;流式细胞术、Hoechst 33342染色检测氟对细胞周期和细胞凋亡的影响;Western blotting检测葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)、真核生物起始因子2a(eukaryotic initiation factor 2α,eIF2α)、激活转录因子-4(activating transcription factor 4,ATF4)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)的蛋白表达。结果1.0、2.0 mmol/L NaF处理细胞24 h、48 h后,与对照组(0 mmol/L NaF)相比,KLK4 mRNA和蛋白表达降低(P<0.05)。1.0、2.0 mmol/L NaF处理细胞24 h、48 h后,漂浮细胞增加,其中2.0 mmol/L NaF组细胞相对活力降低,与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。NaF处理细胞24 h后,与对照组相比,0.1、1.0 mmol/L NaF组G0/G1期细胞比例降低,S期细胞比例升高(P<0.05),2.0 mmol/L NaF组G0/G1期细胞比例升高,S期细胞比例降低(P<0.05);NaF处理细胞48 h后,与对照组相比,2.0 mmol/L NaF组G0/G1期细胞比例升高,G2/M期细胞比例降低(P<0.05)。随着NaF处理浓度的升高,亮蓝色的细胞数量逐渐增多,细胞凋亡率也依次升高,除了0.1 mmol/L NaF 24 h处理组外,其余氟浓度处理组细胞凋亡率与对照组相比,差异均具有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,0.1、1.0、2.0 mmol/L NaF处理细胞24 h后,GRP78和p-eIF2α蛋白表达升高(P<0.05)。与对照组相比,1.0、2.0 mmol/L NaF处理细胞24 h,ATF4和CHOP蛋白表达升高(P<0.05),0.1、1.0、2.0 mmol/L NaF处理细胞48 h,ATF4和CHOP蛋白表达升高(P<0.05)。结论NaF可能通过上调GRP78表达,激活eIF2α/ATF4/CHOP信号通路,从而引起KLK4表达抑制,诱发ALC细胞生长异常。

血清KLK4、KLK7在子宫内膜癌诊断中的价值

目的:探讨KLK4和KLK7在早期子宫内膜癌血清学诊断中的价值。方法:收集54例子宫内膜癌患者(术前)和31例子宫内膜良性病变患者血清,ELISA方法检测KLK4和KLK7表达水平。利用ROC曲线分析KLK4和KLK7单独使用和联合HE4及CA125时对子宫内膜癌的诊断意义。结果:子宫内膜癌组血清中KLK4、KLK7和HE4表达水平显著高于良性病变组,差异有统计学意义。KLK4、KLK7、HE4和CA125单独诊断子宫内膜癌时ROC曲线下面积分别为0.758、0.737、0.717和0.649,单项检测指标KLK4的敏感性最高(61.11%),HE4的特异性最高(90.32%);KLK4、KLK7、HE4三者联合检测时曲线下面积为0.866,其敏感性和特异性分别为74.07%和93.55%。KLK4、KLK7、HE4联合检测优于单一指标的预测价值。结论:术前血清KLK4、KLK7单项指标对子宫内膜癌的诊断具有一定的临床意义;KLK4、KLK7、HE4联合检测可以互为补充,提高子宫内膜癌的诊断准确性。

实时荧光定量PCR检测乳腺癌组织中KLK4 mRNA表达

目的探讨KLK4基因在人乳腺癌组织中表达的临床意义。方法用实时荧光定量PCR(FQ-PCR)的方法检测39例乳腺癌组织和25例正常组织中KLK4 mRNA的表达,以及mRNA表达量与雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、CerbB-2及肿瘤的转移情况进行相关性分析。结果正常乳腺组织和癌组织KLK4 mRNA的相对表达水平分别为0.0120±0.0044和0.0272±0.0067,两者差异显著(P<0.01);乳腺癌组织中KLK4的相对表达水平在ER(+)和ER(-)组分别为0.0269±0.0070和0.0276±0.0067;在PR(+)和PR(-)组分别为0.0270±0.0065和0.0275±0.0081;在CerbB-2(+)和CerbB-2(-)组分别为0.0270±0.0064和0.0301±0.0074;在肿瘤有、无转移组分别为0.0258±0.0061和0.0276±0.0066,各组间KLK4mRNA表达水平均无显著性差异(P>0.05)。结论在乳腺癌组织中KLK4 mRNA的表达水平显著高于正常乳腺组织,但在肿瘤是否转移,雌激素受体、孕激素受体及CerbB-2阳性和阴性组间无显著性差异。

KLK4 mRNA实时荧光定量检测方法研究

应用SYBR Green I作荧光染料,利用磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作内对照,建立KLK4 mRNA的实时荧光定量(FQ-PCR)检测方法。结果建立的FQ-PCR方法扩增GAPDH和KLK4 mRNA的效率分别为0.98和0.96;检测GAPDH和KLK4的批内变异系数(CV)分别为0.8%和1.6%,批间CV分别为3.9%和2.4%;基因扩增产物DNA序列分析及熔解曲线分析表明该方法特异可靠。认为本研究建立的FQ-PCR检测方法简便、特异、重复性好、可信度高,可为KLK4基因表达水平的研究提供基础。

氟对大鼠成釉细胞中MMP-20、KLK4表达的影响

目的观察用含不同浓度氟饮水喂养的SD大鼠所产的子鼠成釉细胞中基质金属蛋白酶-20(MMP-20)、激肽释放酶(KLK4)的表达变化,探讨氟牙症的发病机制。方法给母体SD大鼠分别饮用氟质量浓度为0、50、100mg/L的饮水,待母鼠自然分娩后,取其子鼠下颌骨制作切片并提取牙胚组织,分别用免疫组化和实时定量PCR方法检测不同染氟组大鼠成釉细胞中MMP-20及KLK4的蛋白及基因表达,应用Image-Pro Plus 6.0和GraphPad Prism 5软件对免疫组化和PCR数据结果进行分析。结果①随着饮水氟质量浓度的增加,成釉细胞中MMP-20蛋白及其mRNA的表达量逐渐减少;②KLK4蛋白和KLK4mRNA的表达量在两实验组呈现了类似的变化,但高氟组与低氟组间的差别不明显。结论氟可使成釉细胞减少对MMP-20及KLK4的分泌。这可能是釉基质蛋白降解延迟、釉质矿化异常,最终导致氟牙症产生的机制之一。

lncRNA HOTTIP通过miR-637/KLK4轴促进肺癌SPC-A-1细胞的恶性生物学行为

目的:探讨lncRNA HOTTIP对肺癌细胞增殖、凋亡及EMT的影响及其作用机制。方法:利用qPCR检测lncRNA HOTTIP、miR-637和KLK4在肺癌SPC-A-1、正常肺上皮BEAS-2B细胞中的表达量;siRNA干扰SPC-A-1细胞中lncRNA HOTTIP的表达后,分别通过CCK-8、Transwell、流式细胞术和WB法检测SPC-A-1细胞增殖、侵袭、凋亡和EMT能力的变化。miRanda软件和双荧光素酶报告基因实验分析lncRNA HOTTIP和miR-637之间的靶向关系,RNA pull-down实验检测lncRNA HOTTIP和miR-637的吸附作用,检测lncRNA HOTTIP通过miR-637对SPC-A-1细胞增殖、侵袭、凋亡和EMT的调控。利用TargetScan软件分析miR-637与KLK4的相关性,双荧光素酶报告基因实验检测miR-637与KLK4 mRNA之间的相互作用;检测miR-637通过KLK4 mRNA对SPC-A-1细胞增殖、侵袭、凋亡和EMT的调控。下调lncRNA HOTTIP和miR-637表达后,利用qPCR和WB检测KLK4 mRNA和蛋白表达水平的变化。结果:与BEAS-2B细胞比,在SPC-A-1细胞中lncRNA HOTTIP呈高表达(P<0.01),miR-637呈低表达(P<0.01),KLK4呈高表达(P<0.01)。下调lncRNA HOTTIP后,SPC-A-1细胞增殖、侵袭与EMT能力显著减弱,细胞凋亡率显著上升(P<0.01);lncRNA HOTTIP与miR-637具有靶向关系;下调miR-637表达后,SPC-A-1细胞增殖、侵袭与EMT能力显著上升,细胞凋亡率显著降低(P<0.01)。miR-637与KLK43’UTR特异性结合。miR-637通过KLK4显著促进了SPC-A-1细胞增殖、侵袭与EMT,细胞凋亡率显著上升(P<0.01)。下调lncRNA HOTTIP使KLK4表达显著降低,而下调miR-637可促进KLK4表达(P<0.05)。结论:上调lncRNA HOTTIP可通过miR-637/KLK4轴促进肺癌SPC-A-1细胞的增殖、侵袭与EMT而抑制癌细胞凋亡。

乳腺癌基因研究的新进展

近年来随着实验室技术的不断提高,人们对原癌基因、抑癌基因及各种相关蛋白在乳腺癌发生发展中作用的研究进一步深入,这不仅为乳腺癌的研究开辟新领域,也为乳腺癌的治疗提供了新的途径。现将与乳腺癌发病关系密切的相关基因DAPK、Pokemon、TBX2、EZH2及KLK4的研究进展做一综述。

子宫内膜癌基因研究的新进展

子宫内膜癌的发生是一个多种因素相互博弈的过程,而显性癌基因激活和隐性抑癌基因失活又是这些因素重要部分。在分子水平上分析肿瘤的发生已成为研究热点,多基因表达及相关性分析来判断子宫内膜癌恶性程度及临床预后也已得到广泛应用。本文就相关基因KLK4、MDM2、EZH2、RUNX3、CHFR、Maspin在子宫内膜癌表达及其在肿瘤发生发展方面的研究进展作一综述。

BMP2和BMP4对牙釉质基质蛋白酶表达的调控

目的研究BMP2和BMP4对小鼠ALC(ameloblast-lineage cell)内牙釉质基质蛋白酶中基质金属蛋白酶20(matrix metalloproteinase 20,MMP20)和激肽释放酶4(kallikrein 4,KLK4)表达的调控作用。方法在ALC细胞系中加入BMP2和BMP4重组蛋白,利用免疫印迹实验和荧光定量PCR检测BMP通路信号分子和牙釉质基质蛋白酶的表达变化。同期,在另一组ALC细胞系中加入BMP通路抑制剂(Dorsomorphin),检测牙釉质基质蛋白酶的表达情况。结果在BMP2和BMP4蛋白的作用下,ALC细胞中BMP通路的经典通路(Smad1/5/8)和非经典通路(p38)的表达显著增强,同时MMP20和KLK4的基因表达也有明显上调。同期添加Dorsomorphin的ALC细胞中BMP通路的经典通路的表达明显下降,而非经典通路的表达变化不大,同时MMP20和KLK4的基因表达也有明显的下调趋势。在另一组实验中添加BMP抑制剂的处理组则表现出MMP20和KLK4蛋白表达的下调,而使用BMP2和BMP4对抑制剂组进行处理的挽救组则表现出MMP20和KLK4蛋白水平的明显恢复。结论BMP2和BMP4可以通过影响BMP信号经典通路调节牙釉质形成过程中牙釉质基质蛋白酶的表达。

釉基质蛋白酶与氟牙症的发病机制

目前认为,釉原蛋白降解延迟和清除障碍是氟牙症形成的关键。一些研究表明,氟可减少在釉原蛋白被水解、清除过程中发挥重要作用的釉基质蛋白酶的表达。釉基质蛋白溶解酶包括基质金属蛋白酶(MMP-20)和丝氨酸蛋白酶(KLK4)。本文从分子结构和生物学功能等方面对两种酶的研究现状进行了系统回顾,同时分析了氟对釉基质蛋白酶的可能影响及其与氟牙症发病机制间的关系。

人组织激肽释放酶4在子宫内膜癌中的表达和预后的关系

目的 探讨人组织激肽释放酶4（ KLK4）在子宫内膜癌中的表达和对预后的影响，为改善子宫内膜癌的预后提供新的思路。方法 免疫组化法检测81例子宫内膜癌、30例不典型增生的子宫内膜和30例正常子宫内膜中KLK4的表达情况，收集患者临床病理资料，结合随访资料做生存分析，并分析KLK4的表达和子宫内膜癌预后的关系。结果 KLK4在正常内膜、不典型增生内膜和子宫内膜癌中的高表达率分别为30％、53％、67％，差异有统计学意义（χ^212．059，P＝0．002）；KLK4的高表达和子宫内膜癌的分化程度及深肌层浸润相关（χ^2=7．985，P＝0．021；χ^2=4．629，P＝0．031），与年龄、临床分期、淋巴结转移无关（χ^2分别为0．266、1．761、0．277，均P＞0．05）；KLK4高表达组的5年无进展生存率较低表达组更低，差异有统计学意义（P＝0．032）。结论 KLK4的高表达可能与子宫内膜癌细胞的分化和局部侵袭有关，其高表达提示早期复发，KLK4有可能作为预测子宫内膜癌早期复发的标志物。