鞘内注射钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ抑制剂KN93对骨癌痛小鼠痛行为的影响

目的 探讨钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）在骨癌痛发病机制中的作用.方法 雄性C3H/HeN小鼠40只分为5组：假手对照Sham组（S组n=8）,癌痛模型对照Control组（C组n=8）和KN93 Treat组（T1组n=8、T2组n=8、T3组n=8）.C组和T组（T1、T2、T3）小鼠左侧股骨远端骨髓腔接种溶于α-MEM的NCTC 2472纤维肉瘤细胞,建立骨癌痛模型;S组小鼠骨髓腔注入不含NCTC 2472细胞的α-MEM.在术后的第14天S组和C组鞘内注射20%DMSO 5μl,T1、T2、T3组分别鞘内注射溶于20%DMSO的KN93 15 nmol/5μl、30nmol/5μl、60nmol/5μl.各组于给药前及给药后的0.5 h、2h、4h、8 h检测小鼠的自发抬足次数、机械性缩足反射阈值（PWMT）和热缩足反射潜伏期（PWTL）.结果 鞘内给予KN9315 nmol对骨癌痛小鼠痛行为无影响,鞘内给予KN93 30nmol、60nmol能剂量依赖性减轻小鼠痛行为反应,给药后0.5 h 2组小鼠自发抬足次数[（7.25±1.49）次、（4.12±1.36）次]比C组[（11.62±1.92）次]降低,PWMT[（1.28±0.14）g、（1.75＋0.46）g]、PWTL[（14.64±2.12）s、（16.85±1.61）s]比C组[（0.47±0.16）g、（11.32±1.68）s]升高,差异有显著性（P＜0.05）.作用2h达到高峰,维持到4h左右,8 h后基本消失.结论 CaMKⅡ在骨癌痛的发病中起重要作用,鞘内注射KN93能够剂量依赖性改善骨癌痛小鼠的痛行为.

鞘内注射KN93对神经病理性疼痛大鼠痛行为学的影响

目的观察鞘内注射钙，钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（Ca2＋／calmodulin dependent proteinkinaseⅡ，CaMKⅡ）抑制剂KN93对腰背根神经节慢性压迫（chronic compression of dorsal root ganglion，CCD）大鼠神经病理性疼痛的影响。方法SD雄性大鼠48只，按随机数字表法分为3组：假手术组（S组，11只）、CCD模型组（C组，11只）、KN93组（K组，26只）。C组、K组制备CCD模型，S组仅暴露L。椎间隙。术后14dS组和C组鞘内注射10％溶媒二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）25μl，K组鞘内注射溶于10％DMSO的KN9350μg／25μl。各组在造模前1d（t1），造模后4（t2）、7（t3）、10（t4）、14d（t5）随机取8只大鼠检测热缩足反射潜伏期（paw withdrawal thermal latency，PWTL）和机械缩足反射阈值（paw withdrawal mechanical threshold，PWMT）；并于鞘内注射DMSO或KN93后2（t6）、4（t7）、10（t8）、12（t9）、24h（t10）时进行相同的行为学检测。各组于给药前以及K组的给药后各时间点（t6．t9）随机取8只大鼠处死并取脊髓腰膨大部分，采用Westernblot方法检测CaMK11蛋白表达水平。结果鞘内给药后t6．t9时点，K组PWTL[（14．7±1．6）、（18．6±1．8）、（21．2±2．5）、（15．3±2．0）S]，PWMT[（12．0±1．0）、（15．4±1．4）、（17．5±1．7）、（14．9±1．6）g]比C组PWTL[（11．6±1．8）、（10．7±1．7）、（11．7±2．4）、（9．9±1．7）s]，PWMT[（8．4±0．9）、（9．6±1．6）、（10．6±1．7）、（8．9±1．3）g]升高，差异有统计学意义（P〈0．05）。给药前及给药后t10时，K组PWTL、PWMT与C组比较，差异无统计学意义（P〉0．05o和t5时CaMKII值（1．55±0．12）比较，给药后t6～t9时间点CaMKⅡ蛋白[（1．37±0．11），（1．15±0．12）、（0．75±0．08）、（0．86±0．12）]表达下降（P〈0．05）。结论鞘内注射KN93可有效缓解神经病理性疼痛大鼠的疼痛反应。

鞘内注射钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ抑制剂KN93对瑞芬太尼痛觉过敏大鼠痛行为的影响

目的观察鞘内注射钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）抑制剂KN93对瑞芬太尼痛觉过敏大鼠痛行为的影响。方法SD雄性大鼠60只按随机数字表法分为5组：空白对照组（C组，n=12）、切口痛（I组，n=12）、瑞芬组（R组，n=12）、二甲基亚砜组（DMSO组，n=12）以及KN93组（n=12）。除空白对照组外均做切口痛模型，瑞芬组、DMSO组及KN93组切皮同时经皮下泵注瑞芬太尼（0．04mg／kg，1mg溶于40ml生理盐水）30min。DMSO组及KN93组术前30min分别鞘内给予10％DMSO20μl和KN9320μl（50μg溶于20μl10％DMSO中）。各组分别在术前24h及术后2h、6h、24h、48h检测术侧热缩足潜伏期（Pawwithdrawalthermallatency，PWTL）及机械缩足阈值（Pawmechanicalwithdrawalthreshold，PMWT）。结果与C组相比，I组术后各时间点PwTL[（11．24±0．69）s，（10．36±0．29）S，（11．29±1．12）S，（12．21±0．75）S]及PMWT[（25．5±1．20）S，（24．92±1．98）S，（25．47±1．54）s，（27．14±1．04）S]明显降低（P〈0．05）；与I组相比，R组术后PWTL[（8．48±0．72）s，（8．58±0．45）S，（8．46±0．92）S，（9．07±0．79）S]及PMWT[（21．2±2．42）S，（19．58±1．12）S，（21．87±1，56）S，（22．26±1．64）s]明显降低（P〈0．05）；与R组相比，KN93组术后各点踟汀L[（13．32±0．73）S，（11．79±0．32）S，（11．86±0．98）S，（12．76±0．82）s]及PMWT[（29．75±1．38）S，（28．27±1．16）s，（26．5±1．02）s，（27．79±1．22）s]明显升高（P〈0．05）。结论鞘内注射KN93能够缓解瑞芬太尼诱发的痛觉过敏。

大鼠切口痛模型中鞘内注射不同剂量KN93对瑞芬太尼诱发的痛觉过敏的影响

目的观察不同剂量KN93对瑞芬太尼痛觉过敏大鼠痛行为的影响。方法采用完全随机分组方法，将36只雄性SD大鼠分为6组（每组6只）：①空白对照组；②切口组；③瑞芬太尼组；④KN9325μg组；⑤KN9350μg组；⑥KN93100μg组。除空白对照组外，其余各组均制作切口痛模型、瑞芬太尼组及KN933个剂量组，手术过程中皮下输注瑞芬太尼（40μg/kg，1mg溶于40ml生理盐水中）30min。各组大鼠分别于术前24h、术后2、6、24、48h测定术侧机械缩足阈值（paw withdrawal mechanical threshold，PWMT）和热缩足潜伏期（paw withdrawal thermal latency，PWTL）。结果与切口组比较，瑞芬太尼组术后出现痛觉过敏表现PWMT（20．9±2．6，19．6±1．8，21．9±2．0，22．3±1．9）及肌[（8．5±1．5）s，（8．6±1．5）s，（8．5±2．0）s，（9．1±1．5）s]，P〈0．05。鞘内注射KN9325μg对痛觉过敏大鼠痛行为无改善作用，鞘内注射KN9350、100μg能剂量依赖性改善瑞芬太尼所致痛觉过敏大鼠痛行为，P〈0．05。结论瑞芬太尼诱发切口痛大鼠痛觉过敏；KN93剂量依赖性的改善瑞芬太尼诱发的痛觉过敏。

KN93对心力衰竭兔心室肌细胞迟后除极和钙离子的影响

目的观察CaMKⅡ抑制剂KN93对心力衰竭兔心室肌细胞迟后除极和钙离子的作用，探讨CaMKⅡ信号通路对心衰后触发性心律失常的影响。方法选取雄性新西兰大白兔30只，随机（随机数字法）分为3组：假手术组（sham组）、心衰组（HF组）、心衰＋KN93（HF＋KN93组），每组10只。采用腹主动脉缩窄联合主动脉瓣反流术建立兔心衰模型，利用双酶法分离单个兔心室肌细胞，全细胞膜片钳记录动作电位和瞬时内向电流（Iti）电流，利用离子浓度测定系统检测胞内钙瞬变，用Western blot技术检测主要钙转运蛋白。数据采用pCLAMP10．2处理。SPSS17．0软件进行统计学分析，多组间数据比较用ANOVA方差分析，组间两两比较用SNK-q检验。结果（1）心衰后兔心室肌细胞发生迟后除极（delayed afterdepolarization，DAD）和触发活动（trigger activity,TA）增加，应用KN931．0μmol／L后，DAD和由此引起的TA均降低。（2）Iti电流密度在心衰后增加，在-50mv时，峰电流密度从假手术组细胞的．0．12±0．02pA／pF增加至．0．95±0．06pA／pF（n=10，P〈0．01）。暴露于KN931．0mol／L后，电流密度降低为-0．44±0．04pA／pF（n=10，P〈0．01o（3）KN93可以减少胞内钙离子浓度、降低钙瞬变幅值，加速钙瞬变的衰减。（4）KN93可以上调pPLN和SERCA2a的表达，增加胞内钙离子的摄取，而降低NCX的表达，减少Iti电流，抑制DAD和TA发生。结论KN93可降低心衰动物模型的心室肌细胞内钙离子浓度，有效减少DAD和TA的发生，CaMKⅡ可能成为抗心衰时心律失常发生的新靶点。

Ca^(2+)/CaMKⅡ信号通路在肿瘤坏死因子-α诱导心肌肥大中的作用

目的研究钙调素依赖蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)信号通路在肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导心肌细胞肥大中的作用。方法Lowry法测心肌细胞蛋白含量;计算机图像分析系统测心肌细胞体积;[3H]-亮氨酸参入法测心肌细胞蛋白合成;Till阳离子测定系统观察胞内[Ca2+]i瞬变;Westernblot法测定CaMKⅡδB的表达。结果①TNF-α(100μg.L-1)明显诱导心肌细胞蛋白含量、蛋白合成及体积的增加,CaMKⅡ特异性抑制剂KN93(0.2μmol.L-1)明显抑制TNF-α诱导的心肌肥大,但对正常心肌细胞生长无影响。②TNF-α引起心肌细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)瞬间变化幅度增高,KN93明显降低TNF-α诱导的上述改变。③TNF-α明显增强心肌细胞内CaMKⅡδB的表达。结论TNF-α可能通过引起心肌细胞[Ca2+]i升高,促进CaMKⅡδB表达诱导心肌细胞肥大的。

CaMKⅡ在小鼠重症急性胰腺炎胰腺损伤中的作用

目的观察钙调素依赖蛋白激酶(CaMKⅡ)在重症急性胰腺炎(SAP)小鼠胰腺组织中的表达情况,并探讨其抑制剂KN93对SAP胰腺损伤的保护作用和机制。方法36只健康雄性C57小鼠随机分为假手术组、SAP组、KN93组、SAP组+KN93组,9只/组。于造模后24 h收集血清和胰腺组织;采用HE染色观察胰腺组织病理改变;Elisa检测血清脂肪酶、淀粉酶活性以及炎性因子变化情况;免疫印迹法检测CaMKⅡ、p-CaMKⅡ、p-NF-κB、MAPK、p-MAPK在小鼠胰腺组织中的表达变化。结果与假手术组比较,SAP组p-CaMKⅡ、p-NF-κB、p-MAPK表达水平升高(P<0.05)。KN93干预后,SAP小鼠胰腺组织病理损伤减轻,血清脂肪酶、淀粉酶以及炎性因子(TNF-α、IL-6)水平降低(P<0.05),同时NF-κB、ERK和MAPK蛋白磷酸化也降低(P<0.05)。结论CaMKⅡ蛋白在SAP疾病胰腺组织活性升高,CaMKⅡ抑制剂KN93能有效减轻SAP小鼠胰腺损伤和炎症程度,其机制可能与ERK/MAPK信号通路有关。

细胞凋亡和程序性坏死在心肌缺血再灌注损伤中的作用研究

目的通过使用特异性抑制剂ZVAD和KN93分别抑制细胞凋亡和程序性坏死的发生,来比较在心肌缺血再灌注损伤中哪一种细胞死亡方式占比更大。方法选择雄性C57/BL6小鼠40只,随机分为假手术(sham)组、缺血再灌注(I/R)组、ZVAD组和KN93组,在结扎前15 min,sham组不做处理,I/R组注射二甲基亚砜(DMSO)溶液,ZVAD组和KN93组则分别注射ZVAD和KN93溶液,建立心肌缺血再灌注损伤模型。氯化三苯基四氮唑(TTC)染色测心肌梗死面积,酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测心肌肌钙蛋白I(cTnI),炎性因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)水平,用蛋白印迹(WesternBlot)检测特异蛋白受体相互作用蛋白激酶-3(RIP3)和胱天蛋白酶-3(caspase-3)的表达。结果(1)ZVAD组和KN93组较I/R组心肌梗死面积明显缩小(P<0.05),且KN93组相比ZVAD组,心肌梗死面积更小(P<0.05);(2)ZVAD和KN93处理后相比I/R组,cTnI表达明显减少(P<0.05),而KN93组cTnI低于ZVAD组(P<0.05);(3)IL-1β和TNF-α在I/R组中明显升高(P<0.01),而在ZVAD组和KN93组中明显降低(P<0.05),KN93组IL-1β和TNF-α明显低于ZVAD组(P<0.05);(4)caspase-3和RIP3的表达在I/R组显著升高(P<0.05),而ZVAD和KN93组相对于I/R组二者的表达有所减少。其中RIP3的表达,KN93组相比I/R组显著下降(P<0.05),ZVAD组相比I/R组有所下降,但无统计学意义(P>0.05);caspase-3的表达,ZVAD组相比I/R组显著下降(P<0.05),KN93组相比I/R组无统计学意义(P>0.05)。结论(1)ZVAD和KN93干预可以减轻I/R损伤,起到心肌保护作用;(2)KN93相比ZVAD在减少心肌细胞死亡方面存在较大优势,提示在I/R损伤中,相比细胞凋亡,程序性坏死可能起更大作用。

Nrf2参与CaMKII抑制引起的神经细胞毒性作用

目的探讨Ca^(2+)/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKII)的特异性抑制剂KN93对神经细胞的作用及其与Nrf2通路之间的关系。方法培养小鼠脑神经瘤细胞N2a,CCK8检测确定给药12h后KN93对细胞的毒性作用与浓度的相关性;应用5μmolKN93给药12h后进行荧光NeuN染色,检测细胞存活率;应用ELISA试剂盒检测KN93对炎症因子TNF-α、IL-1β表达的影响;Westernblot检测给药KN93后Nrf2蛋白表达的变化;ELISA试剂盒检测KN93与Nrf2拮抗剂ML385同时处理时,炎症相关因子TNF-α、IL-1β表达的变化。结果与对照组相比,5μmol KN93给药12h后,KN93给药组中NeuN染色的阳性细胞明显减少;TNF-α和IL-1β表达明显增加;Nrf2蛋白表达显著增加;与KN93给药组相比,KN93和Nrf2拮抗剂ML385同时处理组炎症相关蛋白表达下降,即Nrf2的抑制剂ML385能逆转KN93诱发的炎症反应。结论Nrf2通过诱发炎性反应,参与CaMKII的抑制剂KN93引起的神经细胞毒性作用。

CaMKII磷酸化水平对大鼠缺血-再灌注损伤的作用研究

目的探讨钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKII)对离体心肌缺血-再灌注损伤的影响及对细胞凋亡与自噬的作用。方法选取心电图正常的SPF级雌性SD大鼠(体重250~280 g),Langendorff灌流系统建立成功的离体心肌缺血-再灌注损伤模型共70只,随机分为五组(n=14),心脏缺血-再灌注组(IR组)、CaMKII磷酸化激活剂组(IR+异丙肾上腺素组)、CaMKII磷酸化抑制剂类似物组(IR+KN92组)、CaMKII磷酸化抑制剂组(IR+KN93组)、空白对照组(Control组)。采用再灌注末,左心室功能的变化、心肌细胞形态的变化评价心肌损伤程度;原位末端标记(TUNEL)法来检测细胞凋亡指数;蛋白印迹法(Western blot)检测CaMKII、受磷蛋白(PLN)的磷酸化水平(p-CaMKII/CaMKII、p-PLN/PLN)、以及凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3和自噬标记蛋白LC3II/LC3I、Beclin-1、P62的表达水平。结果与Control组相比,IR组的大鼠左心室功能降低,心肌纤维形态排列紊乱,凋亡指数增高,p-CaMKII/CaMKII、p-PLN/PLN、Cleaved Caspase-3、Bax/Bcl-2、LC3II/LC3I、Beclin-1表达增多,P62表达减少,凋亡和自噬水平明显升高(均P<0.05)。与IR组相比,IR+KN93组的大鼠心肌损伤有明显改善,凋亡指数减少,p-CaMKII/CaMKII、p-PLN/PLN、Cleaved Caspase-3、Bax/Bcl-2、LC3II/LC3I、Beclin-1表达减少,P62表达增多,凋亡和自噬水平明显降低(均P<0.05)。IR+异丙肾上腺素组与IR组相比,进一步降低大鼠左心室功能,同时凋亡和自噬水平进一步升高(P<0.05),而IR+KN92组大鼠与IR组相比,心肌各指标比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论抑制CaMKII磷酸化通过降低细胞凋亡和自噬进而减轻离体心肌缺血-再灌注损伤。