鸡KRT14基因编码区SNPs及其与蛋壳品质性状的相关分析

角蛋白14(Keratin 14,KTR14)属于富含半胱氨基酸残基的I型(酸性)角蛋白,具有参与细胞生长,促进细胞分化的作用。为分析KRT14基因对鸡蛋壳品质性状的影响,本研究以43周龄的江汉鸡为实验对象,利用PCR技术结合直接测序法,分析鸡KRT14基因编码区SNPs,并将其与蛋重、蛋壳厚度、蛋壳强度性状进行关联分析。结果显示:在鸡KRT14基因外显子2~5中共发现g.184bp C>T、g.215bp C>T、g.275bp C>A、g.285bp G>A 4个SNPs,均为同义突变;相关性分析结果表明,上述4个SNPs位点的多态性与蛋重、蛋壳厚度、蛋壳强度等具有相关性(P<0.05),其中g.184bp C>T位点的CT基因型、g.215bp C>T位点的CT基因型、g.275bpC>A位点的CC基因型及g.285bpG>A位点的GG基因型具有更高的蛋壳强度和蛋壳厚度;上述突变引起KRT14基因的多态性,共形成9种单倍型、23种单倍型组合,其中单倍型组合H1H9(其序列为CCAG/TTCG)具有最佳的蛋壳品质性状。综上,KRT14基因可作为影响蛋鸡蛋壳品质性状的候选基因,可选择KRT14基因外显子2~5区域的H1H9单倍型作为提高蛋鸡蛋壳品质性状的潜在遗传标记用于江汉鸡的辅助选择中。

构建模拟人致病位点突变的靶向小鼠Krt14的CRISPR/Cas9系统

目的建立可模拟人类KRT14强致病位点突变的高效靶向小鼠Krt14的CRISPR/Cas9系统。方法本研究通过检索多个数据库筛查人类单纯性大疱性表皮松懈症(EBS)致病的基因KRT14强致病突变位点,并通过人和小鼠KRT14蛋白序列比对分析将筛查到的强致病位点定位于小鼠基因组上。根据CRISPR/Cas9系统的基因打靶原理,设计了4个靶向小鼠Krt14的单导RNA(sgRNA),并对应构建了4个sgRNA表达质粒。将sgRNA表达质粒分别与Cas9表达质粒共转染小鼠NIH 3T3细胞,转染细胞经过药物筛选、PCR扩增产物测序、TA克隆测序等实验验证4个sgRNAs的打靶效率。结果根据数据库筛查结果判定人KRT14蛋白的p.Arg125位点为强致病位点,与小鼠KRT14蛋白的p.Arg131位点相对应;根据小鼠p.Arg131位点的DNA序列,成功构建了4个靶向该位点的sgRNA表达质粒;药筛阳性细胞打靶位点的PCR扩增产物测序表明4个位点均发生了突变;TA克隆测序结果表明4个位点的突变效率分别为70%、90%、65%和100%。结论根据数据库筛查的人KRT14强致病位点,成功构建了高效靶向小鼠Krt14的CRISPR/Cas9系统,为深入研究KRT14的功能以及建立KRT14基因编辑小鼠模型、探讨疾病的机制和治疗方法奠定基础。

KRT14基因突变伴KLHL24基因正常的中国汉族手足复发型大疱性表皮松解症一家系

目的对一个中国汉族手足复发型单纯型大疱性表皮松解症(Weber-Cockayne type epidermolytic bullosa simplex,EBS-WC)家系进行致病基因检测,探讨KLHL24基因和KRT14基因在EBS发病机制中的相关性,为产前诊断和遗传咨询提供依据。方法提取该家系中4例患者以及5例健康人外周血基因组DNA,扩增KRT5和KRT14基因的全部外显子,以及KLHL24基因的启动子,并测序。以寻常性银屑病外显子测序研究中的676例正常人群为对照。收集先证者皮损组织进行病理检查。结果先证者病理诊断支持单纯型大疱性表皮松解症。所有患者均出现KRT14基因第6外显子第1162位错义突变(c.1162C>T),导致388位胞嘧啶(C)被胸腺嘧啶(T)替换,角蛋白结构中精氨酸被半胱氨酸取代。家系中的正常人和676例无血缘关系的健康人没有发现相同的碱基改变。家系中没有发现KLHL24基因起始密码子突变。结论KRT14基因第6外显子的错义突变是该中国汉族EBS-WC家系患者的致病基因。

KRT14基因新突变导致的单纯型大疱性表皮松解症家系的研究

目的探讨一个包含4代9例患者的单纯型大疱性表皮松解症家系的遗传学病因以及表型特点。方法应用高通量目标区域捕获测序分析先证者大疱性表皮松解症的相关基因。在发现疑似突变后，用Sanger测序对其家系进行分析，同时应用Mutationtaster、Poly Phen-2、Provean、SIFT等软件以及NCBI网站对突变位点的致病性和保守性进行预测，并用100名正常人作为对照。结果先证者KRTj4基因存在一个新的C．1234A〉G（P．Ile412Val）杂合突变。家系分析提示所有患者均携带同样的突变。值得注意的是，3名成员（包括2例患者和1名正常个体）的KRT14基因存在一个人类基因突变数据库收录的c．1237G〉A（P．Ala413 Thr）杂合突变，而在其余7例患者中未发现该突变，提示C．1237G〉A（P．Ala413Thr）并非致病突变。在100名正常对照中均未检测到上述两种突变。NCBI保守性分析提示，两个位点均高度保守，而c．1234A〉G（P．11e412Val）为强致病性，c．1237G〉A（P．Ala413Thr）则可能为多态。结论KRT14基因c．1234A〉G（P．Ile412Val）杂合突变很可能是该家系的遗传学病因。C．1237G〉A（P．Ala413Thr）氨基酸改变可能是一种多态。对于有多个致病基因的遗传病，高通量目标区域捕获测序比传统的Sanger测序更高效、准确、省时和低廉，更适合用于临床检测。

单纯型大疱性表皮松解症3个家系角蛋白14/角蛋白5基因突变研究

目的:检测单纯型大疱性表皮松解症(EBS)的基因突变情况,探讨EBS的基因型与表型的关系。方法:收集3个EBS家系的临床资料,提取外周血DNA、通过PCR扩增角蛋白KRT14和KRT5基因编码区的全部外显子及其侧翼序列并测序,以表型正常家系成员及50例健康人为正常对照。结果:全部患者均存在KRT14或KRT5基因的错义突变,分别为KRT14的c.1151T>C、c.1207G>T和KRT5的c.1261G>A,在家系中正常人及对照者未发现上述突变。结论:错义突变KRT14的c.1151T>C、c.1207G>T和KRT5的c.1261G>A可能分别为导致该3个家系临床表型的原因。

KRT5基因新突变(p.Gly207Asp)导致一家系伴斑状色素沉着的单纯性大疱性表皮松解症

目的:对伴斑状色素沉着的单纯性大疱性表皮松解症一家系进行KRT5和KRT14致病基因突变筛查。方法:提取家系中每一位成员的DNA样本,应用聚合酶链式反应(PCR)扩增KRT5和KRT14基因编码区及外显子-内含子交界区,对PCR产物进行DNA测序。选择100例正常人群作为对照组,将突变结果在The Genome Aggregation Database(gnomAD)和The Exome Aggregation Consortium(ExAC)等多个大样本数据库中查询突变频率。结果:该家系中KRT14基因检测未发现异常;KRT5基因在先证者中检测到1个未报道的错义突变c.620G>A(p.Gly207Asp),患儿父亲及弟弟均检测到该突变。该家系中该突变和表型共分离,该突变c.620G>A(p.Gly207Asp)在GenBank及人类基因突变数据库(HGMD)等国际数据库中尚未见报道。结论:KRT5基因全新点突变c.620G>A(p.Gly207Asp),可能是引起该家系中伴斑状色素沉着的单纯性大疱性表皮松解症患儿发病的原因。

阳离子脂质肽用于单纯型大疱性表皮松解症基因治疗的初步评价

目的合成两亲性阳离子脂质肽(RLS),通过报告绿色荧光蛋白基因(pEGFP)及治疗基因野生型角蛋白14(KRT14)的表达水平检测,考察其在小鼠成纤维细胞L929、小鼠胚胎成纤维细胞NIH-3T3和人永生化角质形成细胞HACAT中的基因递送效率。方法利用1HNMR和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱表征RLS的化学结构。采用溶剂注入法制备RLS自组装体,检测其与基因复合前后的粒径、电位。将RLS自组装体与pEGFP静电吸附形成的基因复合物转染至L929、NIH-3T3、HACAT,利用EGFP表达平均荧光强度(MFI)半定量法评估复合物的转染效率,并在转染48 h后,采用CCK-8试剂法考察复合物对以上3种细胞的毒性。实时荧光定量PCR(q-PCR)检测KRT14 mRNA的表达水平。结果成功制备了粒径为142.8±0.9 nm,Zeta电位为28.7±0.4 mV的RLS自组装体。将其与DNA复合后,粒径增至167.1±2.3 nm,Zeta电位降至20.2±0.5 mV。RLS基因复合物在3种细胞中均未显示明显毒性。在转染L929、NIH-3T3和HACAT细胞后,RLS组的pEGFP的平均荧光强度分别为96、46、33。q-PCR结果显示:在L929、NIH-3T3、HACAT细胞中,RLS组KRT 14 mRNA的表达水平分别约是Lipo2000的130、100和5倍,是PEI的1.7×10^(5)、120、5倍,证明了阳离子脂质肽具有高的基因递送效率。结论RLS作为一种高效、安全的基因递送载体。在由KRT14基因突变引起的单纯型大疱性表皮松解症遗传性皮肤疾病中,具有一定的应用潜力。

蒽醌四环类化合物调控甲状腺癌细胞增殖的机制

[目的]探讨蒽醌四环类化合物调控甲状腺癌细胞增殖的机制。[方法]高通量测序检测人甲状腺滤泡上皮细胞和人甲状腺癌组织源细胞中的差异表达基因。选择15个甲状腺癌细胞中均表达上调的基因,将其与蒽醌四环类化合物进行分子对接,筛选抑制甲状腺癌细胞增殖的潜在化合物。[结果]差异基因KRT14在这15个癌细胞中均上调(P<0.05)。过表达KRT14后,甲状腺癌细胞TPC-1的增殖水平上升(1.92±0.21 vs 2.69±0.12,P<0.05)。敲低KRT14后,甲状腺癌细胞TPC-1的增殖水平下降(1.90±0.10 vs 1.32±0.20,P<0.05)。1μmol/L蒽醌类化合物处理后,对接结果阳性的doxorubicin的抑制甲状腺癌细胞TPC-1的增殖效果最明显(1.30±0.20 vs 0.33±0.01,P<0.05)。分子对接结果显示doxorubicin与KRT14的K352、E356、N357、E360存在潜在结合。构建甲状腺癌细胞TPC-1 KRT14敲除细胞系后,再过表达KRT14野生型和KRT14突变型(突变上述位点)。KRT14-MT过表达的甲状腺癌细胞TPC-1对doxorubicin的敏感性降低(P<0.05)。[结论]蒽醌四环类化合物doxorubicin能够与KRT14的K352、E356、N357、E360位点结合,减少甲状腺癌细胞TPC-1的增殖水平。