大鼠细小病毒H-1株和KRV株双重PCR检测方法的建立及应用

目的建立大鼠细小病毒H-1和KRV株双重PCR方法并对方法进行初步应用。方法根据NCBI发表的H-1(NC_001358)和KRV(U790330)基因组序列分别设计特异引物,以H-1和KRV病毒DNA为模板建立双重PCR方法,对方法进行优化后验证方法的敏感性和特异性;经口感染大鼠,分为H-1和KRV单独感染组和混合感染组,感染后第2,4,6,8,10天采集大鼠粪便,第10天处死所有大鼠,采集心、肝、脾、肺、肾和盲肠内容物等组织,用建立的方法对粪便和组织样本进行检测。结果建立的双重PCR方法以H-1和KRV为模板能够分别扩增出183 bp和302 bp 2个条带,敏感性验证显示能够检测到的最低H-1量为3.8 pg/m L,最低KRV量为0.73 pg/m L;在以小鼠微小病毒、犬细小病毒和猫细小病毒为模板时无任何条带扩增出,特异性良好。感染第2天在所有大鼠粪便中均检测到病毒核酸,感染大鼠均无明显临床症状,感染第10天采集组织,H-1在各组织的检出率分别是心50%(4/8),肝50%(4/8),脾62.5%(5/8),肺50%(4/8),肾37.5%(3/8),盲肠内容物62.5%(5/8),且单独感染组检出率高于混合感染组;KRV在各组织的检出率分别是心0(0/8),肝25%(2/8),脾87.5%(7/8),肺12.5%(1/8),肾25%(2/8),盲肠内容物62.5%(5/8),混合感染组检出率高于单独感染组。结论建立的H-1和KRV双重PCR方法能够高效的检测大鼠粪便及组织中的病毒感染,可作为实验动物国家标准的有力补充。

岩藻多糖体外抗KRV活性初步研究(英文)

目的 研究岩藻多糖体外抗 Kilham rat virus(KRV)病毒的活性以及抑制炎症因子 IL-1、IL-6 的表达。方法 CCK-8 法测得岩藻多糖对大鼠肾细胞(NRK)的半数细胞毒性浓度(CC;);通过细胞病变效应测定药物的抗病毒活性,计算药物的半数抑制浓度(IC;)以及治疗指数(SI);建立 KRV感染大鼠肾细胞(NRK)细胞模型,设置阴性对照、病毒感染组以及治疗实验组,通过实时荧光定量 PCR 检测病毒以及 IL-1、IL-6 的表达水平。结果 CCK-8 法测得药物的 CC;> 2 500 μg/mL,岩藻多糖的 IC;为(114.8 ± 8.1) μg/mL,SI > 21.78;qPCR 结果表明 KRV 病毒衣壳蛋白 2(VP2)的转录水平实验组较阳性对照组明显降低,且 IL-1、IL-6 的转录水平亦显著降低。结论 岩藻多糖具有较小的细胞毒性以及良好的抗 KRV 病毒的效果,并且能够减轻病毒诱导的炎症反应,为防治病毒感染导致的糖尿病提供理论基础。

大鼠细小病毒双重PCR检测方法的建立

目的建立快速检测大鼠细小病毒的PCR方法。方法根据大鼠细小病毒基因序列的特点,建立鉴别检测大鼠细小病毒(RPV)与其他三种大鼠细小病毒(H-1、KRV、RMV)的双重PCR方法。根据RPV核酸序列的性质,在VP2基因筛选了一对用于特异扩增RPV株的引物,在NS1基因设计了一对用于特异性扩增H-1、KRV和RMV的引物。结果两对引物组成的二重PCR方法可以特异性的扩增RPV而不扩增核酸同源性高的小鼠细小病毒和多种其他病原微生物;敏感性实验表明,二重PCR的最低检测限可达1 000拷贝/μL。双重PCR结合测序在检测23份临床样本中,检测出7份RMV阳性,包括1份与RPV共感染阳性样本。结论本研究建立的检测RPV的双重PCR方法具有特异性好、灵敏度高及操作简单等优点,是一种简便、可靠的检测方法。