多功能降解菌Pseudomonas putida KT2440-DOP的构建与降解特性研究

三唑磷水解酶基因为研究发现的一个新的广谱有机磷水解酶基因,通过PCR从有机磷降解菌株Ochrobactrumsp.mp-4总DNA扩增了tpd,将tpd定向克隆到pBBRMCS-5载体上,构建重组质粒pTPD,在辅助质粒pRK2013的帮助下,通过三亲接合将pTPD转移到模式菌株Pseudomonas putidaKT2440中,获得的工程菌PseudomonasputidaKT2440-DOP可以降解多种有机磷农药及芳香烃化合物;KT2440-DOP的有机磷水解酶活较出发菌株MP-4提高了一倍左右,且遗传性状稳定。

重组工程法敲除恶臭假单胞菌KT2440的染色体基因

恶臭假单胞菌KT2440是在生物降解环境有机物和表达异源基因等方面具重要作用的环境微生物.基因敲除是研究基因和蛋白功能的必要手段.常规的基因敲除方法往往会烦琐耗时且易引入突变的基因克隆操作.本研究采用重组工程(即重组酶催化的PCR产物与基因组上同源片段之间的同源重组)来实现恶臭假单胞菌KT2440的基因敲除.本方法高效、简便、快捷且可以同时进行多个基因的操作,可成为通用的恶臭假单胞菌KT2440的遗传研究方法.

以菌株Pseudomonas putida KT2440为宿主构建多功能农药降解菌

通过富集培养法分离到的农药降解菌株存在稳定性差、底物谱窄、安全性不明等问题.Pseudomonas putida KT2440分离自根际土壤,是国际上公认的环境安全型菌株.利用同源重组方法将4种农药降解酶基因pytH、mpd、chd和amy A同时整合到P.putida KT2440的染色体上,获得了一株无抗性基因残留的工程菌P.putida KT-pmca.工程菌KTpmca能够同时降解拟除虫菊酯类杀虫剂、有机磷类杀虫剂、百菌清和氯代酰胺类4种农药,百菌清降解率大于95%,甲氰菊酯、毒死蜱和敌稗的降解率均达到80%以上.此外,传代实验证明4种降解酶基因能够在遗传中稳定存在.本研究表明工程菌KT-pmca可为微生物原位修复消除农药污染提供新的菌株资源.

恶臭假单胞菌KT2440高效电转化方法

恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT2440是模式环境微生物菌株,也是异源表达的良好宿主菌.高效率的电转化方法对于基因的引入及后续实验非常关键.通过条件优化,建立了高效的电转化方法.EM培养基培养菌体至D600nm=0.6～0.75,冰冷的3mmol/L4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES,pH=7.0)的缓冲液洗涤菌体3次,菌体浓缩300倍,50μL分装并用于一次电转化.电转化条件:1.2kV,200Ω,25μF.1mL SOC培养基悬浮后,转至15mL聚丙烯离心管培养2h,转化效率可高达3.0×108转化子/μg,比目前为止文献报道的该菌株电转化效率高出30倍左右.实验结果还表明,转化DNA浓度与转化子数目呈线性关系.

AI-2通过甲基化趋化受体McpU调控恶臭假单胞菌KT2440的趋化运动及生物膜形成

【背景】广泛存在于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌中的自诱导物autoinducer-2(AI-2)能够介导细菌种内和种间通讯,并调节细菌的多种生理过程。然而恶臭假单胞菌KT2440能否感知AI-2信号还未见报道。【目的】挖掘介导恶臭假单胞菌KT2440对AI-2趋化反应的趋化受体,检测AI-2信号通过趋化受体对恶臭假单胞菌KT2440生物膜形成的调控作用。【方法】本研究首先检测恶臭假单胞菌KT2440对AI-2信号的趋化反应,随后表达纯化了与铜绿假单胞菌AI-2受体高度同源的甲基化趋化受体McpU的配体结合结构域(ligand-binding domain,LBD),利用哈维氏弧菌的生物发光实验和等温滴定量热法(ITC)分析McpU-LBD与AI-2的相互作用;软琼脂平板法和毛细管定量分析法分析KT2440及mcpU敲除菌株(ΔmcpU)对AI-2的趋化反应;结晶紫染色法检测AI-2对KT2440及ΔmcpU生物膜形成能力的影响。【结果】软琼脂平板法和毛细管定量分析发现KT2440对AI-2信号表现出明显的正趋向性。哈维氏弧菌的生物发光实验和ITC分析发现AI-2与McpU-LBD具有高亲和力相互作用。进一步研究发现KT2440对AI-2的趋化反应是通过McpU介导的。生物膜测定结果显示,AI-2能通过其受体McpU显著增强KT2440的生物膜形成能力(P<0.05)。【结论】以上结果表明,甲基化趋化受体McpU介导了恶臭假单胞菌KT2440对AI-2的趋化作用,并且AI-2通过作用于该受体显著提高恶臭假单胞菌KT2440的生物膜形成能力。