丙戊酸钠对Kasumi-1细胞株细胞周期的影响

目的观察丙戊酸钠(VPA)对急性髓性白血病(AML)Kasumi-1细胞周期的影响,并探讨其分子机制。方法将对数生长期Kasumi-1细胞1×105/ml(观察组)分别经1、2、3 mmol/L VPA处理3 d;对照组不加药。RT-PCR法检测VPA不同浓度及不同作用时间(3 mmol/L作用0、1、2、3 d)细胞周期调节因子cyclinE1、p21WAF1/CIP1、p27KIP1mRNA及p21WAF1/CIP1蛋白变化。结果观察组cyclinE1 mRNA表达明显降低(P<0.05),p21WAF1/CIP1mRNA及其蛋白表达明显升高(P<0.05),且均呈剂量、时间依赖性;p27KIP1mRNA表达水平无明显变化。结论VPA可通过对Kasumi-1细胞周期蛋白及周期蛋白依赖性激酶抑制剂的影响调节细胞周期,使细胞阻滞于G0/G1期;本研究可为急性白血病的治疗提供理论依据。

丙戊酸抗裸鼠Kasumi-1细胞移植瘤血管新生的作用研究

本研究旨在探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸(VPA)体内、体外抑制急性髓系白血病血管新生及其作用机制。用不同浓度的VPA处理人t(8;21)急性白血病细胞株Kasumi-1细胞3 d后用RT-PCR及Western blot分析细胞Ang1、Ang2 mRNA及蛋白水平的变化;建立Kasumi-1细胞裸鼠移植瘤模型,采用RT-PCR、Western blot的方法分析对照组和VPA治疗组瘤组织Ang1、Ang2、VEGF mRNA及蛋白水平的变化,免疫组织化学的方法分析瘤组织CD34及Ang1、Ang2蛋白水平的改变。结果表明,VPA 1-3 mmol/L处理3 d能够下调Kasumi-1细胞Ang1 mRNA(3 mmol/L组0.040±0.008,对照组0.360±0.116)、Ang2 mRNA(3 mmol/L组0.146±0.038,对照组0.540±0.049)及蛋白的相对表达,呈浓度依赖性;VPA 500 mg/kg,ip,处理14 d能够明显降低裸鼠瘤组织Ang1、Ang2、VEGF mRNA及蛋白的相对表达(P<0.01),并能明显减少荷Kasumi-1细胞裸鼠移植瘤微血管密度(8.470±0.300vs 2.600±0.200)。结论:VPA可能通过调节血管生成素及VEGF的表达,阻碍白血病的血管新生,从而抑制白血病细胞浸润、迁移。

丙戊酸钠逆转Kasumi-1白血病细胞株AML1-ETO融合蛋白转录抑制的作用

本研究探讨组蛋白脱乙酰化酶抑制剂(HDAC)丙戊酸钠(VPA)逆转Kasumi-1白血病细胞株AML1-ETO融合蛋白转录抑制机制的作用。Kasumi-1细胞经不同浓度VPA处理不同时间,采用半定量RT-PCR分析AML1-ETO、AML1及cyclin D2mRNA水平的变化情况。结果表明:不同浓度VPA处理Kasumi-1不同时间,AML1-ETOmRNA水平无明显变化;1-3mmol/LVPA处理Kasumi-1细胞3天时,与对照组比较,AML1mRNA表达水平增高,呈现剂量依赖性,差别具有统计学意义。以3mmol/L VPA处理Kasumi-1细胞,与对照组比较,3mmol/L VPA组cyclin D2mRNA表达水平降低;以不同浓度VPA处理Kasumi-1细胞3天,结果发现随着VPA药物浓度加大cyclinD2mRNA表达水平降低,呈现剂量依赖性,差别具有统计学意义。结论:VPA能通过抑制HDAC的活性,消除AML1/ETO融合蛋白的转录抑制并增加aml-1基因转录,下调aml-1靶基因cyclin D2mRNA的表达。

西罗莫司抑制急性髓系白血病细胞株Kasumi-1增殖的研究

目的探讨不同浓度西罗莫司对急性髓系白血病细胞株Kasumi-1增殖、凋亡和细胞周期的影响。方法 MTT法检测西罗莫司对Kasumi-1细胞增殖的影响,流式细胞术检测西罗莫司对Kasumi-1细胞凋亡和细胞周期的变化,免疫荧光法观察西罗莫司处理前后Kasumi-1细胞核形态变化。结果不同浓度的西罗莫司均能抑制Kasumi-1细胞的增殖,促进其凋亡,并使细胞阻滞在G0/G1期。Kasumi-1细胞对西罗莫司表现为剂量依赖性,并在100 ng/mL左右达到最大效应。结论西罗莫司能够显著抑制Kasumi-1细胞增殖,并对凋亡起促进作用。

舍曲林诱导Kasumi-1细胞凋亡及其作用机制的实验研究

目的:探讨精神类药物舍曲林对人急性髓系白血病细胞株Kasumi-1的生物学效应。方法:将不同浓度舍曲林作用于Kasumi-1细胞不同时间,通过细胞计数、细胞形态学检查、流式细胞术和Western blot分别检测舍曲林处理前后Kasumi-1细胞增殖和凋亡情况、细胞周期分布以及相关蛋白的改变。结果:舍曲林能够抑制Kasumi-1细胞增殖、诱导细胞凋亡;15和20μmol/L舍曲林处理Kasumi-1细胞24 h后,生长抑制率分别达到(19.00±7.37)%和(47.90±11.19)%;流式细胞术检测结果显示,与空白对照组相比,15和20μmol/L舍曲林处理Kasumi-1细胞24 h后,Annexin V阳性细胞百分比从(9.71±2.12)%分别上升至(20.54±2.52)%和(45.37±7.88)%(P<0.01),且细胞被明显阻滞在G0/G1期和G2/M期;此外,舍曲林还可以下调细胞内翻译控制肿瘤蛋白(translationally controlled tumor protein,TCTP)。结论:舍曲林能够显著诱导Kasumi-1细胞发生凋亡,其作用机制可能与细胞内TCTP蛋白的下调相关。

基于PI3K/Akt/p53信号通路探讨白花蛇舌草乙酸乙酯萃取物诱导急性髓系白血病细胞凋亡的作用

目的通过评估白花蛇舌草乙酸乙酯萃取物(EAEHDW)对磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/p53信号通路传导调节作用,探讨其抑制急性髓系白血病M2型(AML-M2)细胞株Kasumi-1增殖及诱导凋亡的机制。方法利用乙酸乙酯从白花蛇舌草中萃取制备得到EAEHDW,高效液相色谱串联质谱装置检测样品纯度。设置空白组,将浓度分别为0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL、0.10 mg/mL的EAEHDW加入对数生长期的Kasumi-1细胞株,采用MTT法检测不同浓度EAEHDW作用不同时间后Kasumi-1细胞存活率,采用Annexin V/PI流式细胞术检测不同浓度EAEHDW作用24 h后Kasumi-1细胞凋亡情况,采用Western blot法检测不同浓度EAEHDW(0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL)作用24 h后Kasumi-1细胞中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)家族蛋白及PI3K/Akt/p53信号传导通路蛋白表达情况。结果不同浓度的EAEHDW干预后,细胞存活率较空白组明显降低,细胞凋亡率较空白组明显升高,且细胞存活率随着作用时间的延长和药物浓度的增加而下降越明显,细胞凋亡率随着药物浓度的增加而升高越明显,差异均有统计学意义(P均<0.05);不同浓度的EAEHDW作用于Kasumi-1细胞后,细胞中多聚ADP核糖聚合酶(PARP)、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、细胞色素C(Cyto-C)、p53蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05),Akt、磷酸化Akt(p-Akt)、鼠双微染色体2(MDM2)、磷酸化MDM2(p-MDM2)蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05)。结论EAEHDW可明显抑制髓系白血病Kasumi-1细胞增殖并诱导其凋亡,其机制可能与影响Caspase家族蛋白表达和抑制PI3K/Akt/p53信号通路导致p53激活有关。

丙戊酸钠逆转AML1-ETO融合蛋白转录抑制作用的研究

目的:探讨组蛋白脱乙酰化酶(HDAC)抑制剂丙戊酸钠(valproic acid,VPA)逆转AML1-ETO融合蛋白转录抑制作用。方法:VPA处理t(8;21)急性白血病细胞株Kasumi-l细胞后,应用流式细胞术检测髓系分化抗原CD11b表达水平的变化,DNA凝胶电泳检测细胞的凋亡变化,分子生物学半定量RT-PCR的方法检测粒-单核细胞刺激因子(GM-CSF)和半胱氨酸天冬氨酸酶7(Caspase7)mRNA表达水平的变化。结果:VPA诱导Kasumi-1细胞的髓系分化抗原CD11b表达的阳性率增加,并呈现时间及剂量依赖性;②VPA诱导Kasumi-1细胞凋亡,出现的典型梯形DNA条带;③VPA诱导AML1靶基因GM-CSF和凋亡相关因子Caspase7的mRNA表达水平的增加,呈时间和剂量依赖性。结论:丙戊酸钠可以通过抑制脱乙酰化酶的活性,消除AML1-ETO融合蛋白转录抑制,诱导细胞分化和凋亡。

SARI过表达对CBFL细胞凋亡的影响及其机制

目的:探讨SARI基因过表达对核结合因子白血病(CBFL)细胞增殖、凋亡的影响及其机制。方法:通过17号外显子测序验证CBFL细胞模型Kasumi-1细胞负载c-KIT N822K突变。构建SARI基因过表达慢病毒载体,并转染Kasuimi-1细胞。采用荧光定量PCR和Western blot鉴定细胞转染后SARI基因过表达效果。设置空白对照(CON)、空载体对照(NC)和SARI过表达(OE)3组。MTT法检测各组细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot检测凋亡相关蛋白BCL-2、BAX、Cyto C、Caspase 9、Caspase 3、cleaved-Caspase 3、PARP、cleavedPARP,以及PI3K/Akt通路蛋白PI3K(p85)、p-PI3K(p85)、Akt、p-Akt的表达变化。结果:Kasumi-1细胞具有c-KIT N822K突变。成功构建稳定过表达SARI基因的Kasumi-1细胞。与NC组细胞相比,OE组细胞增殖减缓,凋亡增加;抗凋亡蛋白BCL-2表达降低,促凋亡蛋白BAX表达增高;出现Cyto C蛋白的表达;Caspase 9、Caspase 3表达降低,cleaved-Caspase3表达增高;PARP表达降低,活性剪切体cleaved-PARP表达增高,PI3K/Akt通路蛋白p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt磷酸化水平下调(P<0.05)。结论:SARI基因过表达可通过线粒体途径诱导CBFL细胞凋亡,机制可能与PI3K/Akt信号通路失活有关。

丙戊酸钠对Kasumi-1细胞周期蛋白及周期蛋白依赖性激酶抑制剂的影响

目的探讨组蛋白脱乙酰化酶（HDAC）抑制剂丙戊酸钠（VPA）对t（8；21）／AML细胞株Kasumi-1细胞周期蛋白及其周期蛋白依赖性激酶抑制剂基因的影响。方法将Kasumi-1细胞经不同浓度VPA处理不同时间，应用反转录聚合酶链反应（RT—PCR）技术检测细胞周期调节因子mRNA水平的变化。结果VPA下调cyclinD1、cyclinE1及cyclinB1 mRNA水平，上调p21^WAF1/CIP1 mRNA表达，对p27^KIP1 mRNA表达无明显影响。结论VPA可通过对Kasumi-1细胞周期蛋白及周期蛋白依赖性激酶抑制剂的影响调节细胞周期，使细胞阻滞于G0／G1期。

伊马替尼体外诱导Kasumi-1细胞增殖、分化与凋亡作用

目的探讨酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼诱导携带c-k it突变的细胞增殖、分化与凋亡的作用。方法应用MTT比色法观察伊马替尼对Kasum i-1细胞的生长抑制作用,流式细胞术分析细胞周期、c-k it抗原和髓系分化抗原CD11b、CD13和CD15的表达,AnnexinⅤ标记和DNA凝胶电泳分析细胞凋亡,应用W estern b lot方法分析Kasum i-1细胞c-k it蛋白酪氨酸磷酸化水平。结果伊马替尼呈时间和剂量依赖性抑制Kasum i-1细胞生长,72 h半数抑制浓度(IC50)为4.45μmol/L;伊马替尼5.00μmol/L使Kasum i-1细胞阻滞于G0/G1期,S期细胞减少;髓系分化抗原CD11b、CD13和CD15表达增加;作用24 h,早期凋亡细胞比例由9.04%升至86.84%(P<0.05),培养第5天出现明显DNA梯形条带;作用72 h,Kasum i-1细胞中c-k it蛋白酪氨酸磷酸化水平下降。结论酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼能够抑制携带c-k it突变的细胞的生长,诱导细胞分化和凋亡。

丙戊酸钠对Kasumi-1细胞细胞周期的阻滞作用及其机制探讨

目的研究组蛋白脱乙酰化酶（HDAC）抑制剂丙戊酸钠（VPA）对白血病细胞系Kasumi-1细胞周期的影响并探讨其分子机制。方法不同浓度VPA处理Kasumi-1细胞不同时间，碘化丙锭染色流式细胞术分析细胞周期的变化。RT—PCR及Westernblot方法分析细胞周期蛋白D1（cyclin D1）及周期蛋白依赖性激酶抑制因子p21^WAF1/CIP mRNA或蛋白水平变化。结果①VPA抑制Kasumi-1细胞的细胞周期，使其阻滞于G0／G1期。3mmol／L VPA处理3d，G0／G1期细胞由（50．7±2．8）％上升至（80．7±1．7）％。②以3mmol／L VPA处理Kasumi-1细胞不同时间，与对照组比较，3mmol／L VPA组cyclin D1 mRNA表达水平下调；以不同浓度VPA处理Kasumi-1细胞3d，结果发现随着VPA药物浓度增加cyclin D1 mRNA表达水平降低，呈现剂量依赖性。③VPA诱导p21^WAF1/CIP mRNA表达明显增加，呈现时间及剂量依赖性。不同浓度VPA处理细胞3d时，随着用药浓度的增加，p21^WAF1/CIP蛋白相对表达水平增加，3mmol／LVPA处理细胞2d与0d比较，p21^WAF1/CIP蛋白相对表达水平明显增加（2．498±0．240对0）。结论VPA可以通过对cyclinD1及周期蛋白依赖性激酶抑制因子p21^WAF1/CIP调节使Kasumi-1细胞周期阻滞于G0／G1期。

热休克蛋白90抑制剂诱导Kasumi-1细胞凋亡和分化的机制探讨

目的探讨热休克蛋白90(HSP90)抑制剂17-丙烯胺-17-去甲氧格尔德霉素(17AAG)诱导白血病细胞生长抑制、分化和凋亡作用。方法应用MTT比色法观察17AAG对白血病细胞系Kasumi-1细胞的生长抑制作用,用流式细胞术分析细胞周期和分化抗原的表达,用Annexin V标记、DNA凝胶电泳和流式细胞术分析细胞凋亡,Western blot检测干细胞因子受体(KIT)蛋白水平,RT-PCR测定c-kit mRNA水平。结果17AAG明显抑制Kasumi-1细胞的生长,半数抑制浓度(IC50)为0.62μmol/L;17AAG诱导Kasumi-1细胞凋亡呈时间、剂量依赖性,17AAG处理24h早期凋亡细胞增加,48h晚期凋亡细胞增加,早期凋亡细胞减少。17AAG可诱导Kasumi-1细胞髓系分化抗原CD11b及CD15表达增加,并呈剂量和时间依赖性。经17AAG作用后细胞阻滞于G0/G1期,伴有S期细胞减少。Western blot检测发现17AAG可降低KIT水平,处理2h开始减少,处理20h后KIT基本消失,但c-kit mRNA水平并未受影响。结论HSP90抑制剂17AAG通过降解KIT蛋白抑制Kasumi-1细胞生长,使细胞阻滞于G0/G1期,诱导其发生凋亡及部分分化。

ITF2357体外对急性髓系白血病细胞增殖的抑制作用及机制探讨

目的探讨新型组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂ITF2357对急性髓系白血病（AML）细胞的增殖抑制及诱导分化和促凋亡作用及其机制。方法以AML细胞系Kasumi一1细胞（AML1-ETO阳性）为模型，应用MTr比色法观察ITF2357对白血病细胞的增殖抑制作用，并与THP1细胞（AML1-ETO阴性）进行比较；用流式细胞术分析细胞周期和分化抗原的表达；用AnnexinV标记和流式细胞术分析细胞凋亡；Westernblot法检测AML1-ETO及乙酰化组蛋白、easpase蛋白水平。结果0．5μm0L／LITF2357即能明显抑制Kasumi-1细胞增殖，48h半数抑制浓度（IC50）为0．1μmoL／L，然而对于AML1-ETO阴性的THP1细胞系的起始抑制浓度为5．0μm0L／L；ITF2357诱导Kasumi-1细胞凋亡呈时间、剂量依赖性，1TF2357处理24h早期凋亡细胞由（1．44±1．52）％增加至（24．51±5．79）％，48h晚期凋亡细胞由（2．37±2．80）％增加至（63．66±1．56）％。0．25μmoL／LITF2357即可诱导Kasu-mi-1细胞髓系分化抗原CD13及CD15表达增加，并呈剂量和时间依赖性。经5．0μmoL／LITF2357作用后细胞阻滞于G0／G1期，G0／G1期细胞由（39．69±6．56）％增加至（79．20±6．51）％，伴有s期细胞减少，由（60．12±3．29）％降低至（18．97±6．62）％。Westernblot检测发现0．5μmoL／LITF2357可降低AMLl-ETO蛋白水平，处理24h开始减少，处理96h后AML1-ETO基本消失，并依赖于easpase途径。经ITF2357处理后，组蛋白H4及H3的乙酰化水平增加。结论低剂量HDAC抑制剂ITF2357能有效抑制AML细胞的增殖，对于AML1-ETO阳性AML细胞尤为有效，通过降解AML1-ETO蛋白抑制Kasumi-1细胞增殖，使细胞阻滞于G0／G1期，诱导其发生凋亡及分化。

高三尖杉酯碱联合尼洛替尼治疗M2b型急性髓系白血病

目的:研究高三尖杉酯碱(homoharringtonine,HHT)联合尼洛替尼(nilotinib)治疗M2b型急性髓系白血病(AML-M2b)的效果。方法:应用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测药物对AML-M2b细胞株Kasumi-1的杀伤作用。蛋白质印迹检测干细胞因子受体(C-KIT)和凋亡相关蛋白的表达。通过Compu Syn软件计算药物联合作用效应。应用携带AML1-ETO融合基因与C-KIT突变的AML-M2b白血病移植小鼠模型,研究HHT和尼洛替尼在体内的作用。通过流式细胞术检测小鼠体内绿色荧光蛋白(GFP)阳性白血病细胞的增殖情况。应用Graphpad prism软件统计小鼠生存期。结果:HHT和尼洛替尼对Kasumi-1细胞株作用敏感并呈剂量依赖性(分别为r=0.933,P=0.007和r=0.897,P=0.03),两药联用时具有协同作用(协同系数<0.9)。在体内,与HHT或尼洛替尼单药组相比,HHT联合尼洛替尼可显著抑制小鼠白血病细胞的增殖,协同延长白血病小鼠生存时间(P=0.001 4和P=0.047 5)。结论:HHT联合应用尼洛替尼可协同杀伤AML-M2b白血病细胞,由此为AML-M2b提供了一种潜在的治疗策略。