电针对中枢Stat5敲除所致肥胖小鼠瘦素水平和下丘脑Kctd15、Sh2b1 mRNA的影响

目的观察电针对中枢Stat5条件性敲除Stat5Nestin-Cre（Stat5NKO）肥胖小鼠下丘脑Kctd15、Sh2b1基因表达的影响。方法 20只肥胖的Stat5NKO小鼠随机分为肥胖组和电针组,每组10只;10只Stat5fl/fl小鼠作为正常组。其中电针组选取单侧后三里、内庭穴进行针刺治疗,每日1次,双侧交替进行,每次30min,韩氏电针仪频率2/15Hz,疏密波,6d为1个疗程,共治疗4个疗程。运用ELISA法检测血清中瘦素（Leptin）含量,qPCR技术检测下丘脑中肥胖相关基因Kctd15、Sh2b1mRNA的表达。结果与正常组小鼠比较,肥胖组小鼠体质量明显增加（P〈0.01）伴随血清Leptin含量升高（P〈0.05）,下丘脑Leptin水平下降（P〈0.05）,同时下丘脑Kctd15、Sh2b1mRNA表达下调（P〈0.05～0.01）;与肥胖组小鼠比较,电针组小鼠的体质量明显下降（P〈0.01）,血清Leptin含量降低（P〈0.01）,且下丘脑Leptin水平回升（P〈0.01）,Kctd15、Sh2b1mRNA表达水平上调（P〈0.01）。结论电针可能通过调节Leptin水平并促进Kctd15、Sh2b1表达,实现对Stat5NKO小鼠的减肥效应。

鲤KCTD15基因的克隆和表达

通过克隆得到鲤Cyprinus carpio含钾离子通道四聚化结构域15(KCTD15)两个基因KCTD15a和KCTD15b,其开放阅读框(Open read frame,ORF)均为774 bp,编码含257个氨基酸的多肽,编码的蛋白质相对分子量均为29 000,PI分别为7.0和6.5。经氨基酸比对和进化树分析表明:鲤KCTD15基因与斑马鱼Danio rerio、人Homo sapien、食蟹猴Macaca fascicularis、牛Bos taurus、小鼠Mus musculus、家鼠Rattusnorvegicus、爪蟾Xenopus laevis等的KCTD15基因具有高度同源性,均含有一个BTB(Broad-Complex,Tramtrack and Bric a brac)模块,鱼类比哺乳动物少26个氨基酸。采用半定量RT-PCR法分析了KCTD15基因在鲤组织中的表达,结果表明:KCTD15a基因只在头肾中表达且较低,在其他组织中均不表达;KCTD15b基因在卵巢中表达最高,在鳃和皮肤中次之,在脑、肝胰脏、头肾、肠等组织中表达较低。采用实时荧光定量PCR法检测KCTD15在鲤胚胎发育时期的表达,结果表明:KCTD15a和KCTD15b基因都在受精后0 h表达量最高(P<0.05),在受精后6 h和12 h均迅速下降(P<0.05);KCTD15a基因在受精后36 h有所上升,但未达到6 h的水平,在受精后72 h及破膜后3 d、10 d时表达量逐渐降低;而KCTD15b基因在受精后36 h降至最低,在受精后72 h及破膜后3 d时逐渐升高,但幅度不大,破膜后10 d时再次下降;KCTD15b基因的表达量总体高于KCTD15a基因的表达量。

KCTD15基因调控3T3-L1脂肪前体细胞分化的研究

目的探讨含钾通道四聚化结构域15(KCTD15)基因在3T3-L1脂肪前体细胞分化过程中的作用。方法①采用半定量逆转录PCR检测在3T3-L1脂肪前体细胞分化过程中KCTD15mRNA表达变化。②在3T3-L1脂肪前体细胞增殖早期通过RNA干扰技术靶向敲低KCTD15基因的表达,在靶向敲低KCTD15基因后的转染KCTD15siRNA48h后通过半定量逆转录PCR验证KCTD15基因的敲低效果。用油红O染色法观察KCTD15敲低后3T3-L1细胞第0天和第10天的细胞形态学改变。③采用半定量逆转录PCR检测KCTD15基因敲低后PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ、C/EBPδ成脂基因的变化。结果在3T3-L1脂肪前体细胞分化过程中,KCTD15mRNA表达水平逐渐降低(P<0.05);KCTD15敲低能显著抑制3T3-L1脂肪前体细胞分化;KCTD15敲低后PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ、C/EBPδ成脂基因无明显变化。结论在分化早期阶段敲低KCTD15基因能抑制3T3-L1脂肪前体细胞分化。

表达谱芯片分析KCTD15对3T3-L1前体脂肪细胞的影响

目的通过筛选分析3T3-L1前体脂肪细胞中KCTD15基因敲低后的差异表达基因研究其细胞生物学功能,探讨KCTD15基因与肥胖发生的关联。方法①运用RNA干扰技术在3T3-L1前体脂肪细胞中特异性敲低KCTD15基因表达,并用半定量RT-PCR技术检测KCTD15基因敲低效率。②用Illumina表达谱芯片检测基因表达。③筛选差异表达基因后,运用Gene Ontology(GO)和KEGG pathway进行功能聚类分析。④挑选部分差异表达基因进行半定量RT-PCR验证。结果①KCTD15基因敲低后筛选到833个差异表达基因(差异倍数值≥2或≤0.5)。②GO功能分析显示差异表达基因主要富集在以下相关通路:细胞黏附(34个)、细胞骨架组装(26个)、生物膜组装(26个)、染色体组装(20个)、脂肪细胞分化(6个);KEGG pathway分析则显示半乳糖代谢和二羧酸代谢受到影响。③对MTHFD1、MDH1、VSP4B、CUX1、ABCA7 5个基因表达的半定量RT-PCR与芯片测试结果相符。结论 KCTD15基因功能与生物膜和细胞骨架有关且能够影响细胞能量代谢过程。

miR-17-3p靶向KCTD15调控延边黄牛前体脂肪细胞分化

旨在探究miR-17-3p是否可以通过靶向KCTD15调节延边黄牛前体脂肪细胞的分化。本研究使用生物信息学软件鉴定miR-17-3p的同源性,预测miR-17-3p的靶基因;通过在延边黄牛的前体脂肪细胞中转染miR-17-3p mimic或miR-17-3p inhibitor及阴性对照实现细胞内miR-17-3p过表达或抑制表达;采用双荧光素酶报告基因检测系统确定miR-17-3p与KCTD15的靶标关系;使用qRT-PCR和Western blot技术在mRNA和蛋白水平上检测miR-17-3p对KCTD15基因以及脂代谢标志基因PPARγ和C/EBPα表达水平的影响。结果表明,生物信息学软件预测KCTD15可作为miR-17-3p的靶基因,且miR-17-3p在哺乳动物中具有较高的同源性;转染miR-17-3p mimic后脂代谢标志基因PPARγ和C/EBPα的mRNA和蛋白表达量显著或极显著高于转染NC-mimic的对照组(P<0.05或P<0.01);抑制miR-17-3p的表达后,PPARγ和C/EBPα的表达量则显著或极显著低于对照组(P<0.05或P<0.01);双荧光素酶报告基因验证分析显示,过表达miR-17-3p极显著抑制了含有KCTD153′UTR片段的载体的荧光活性(P<0.01);过表达miR-17-3p也会显著或极显著抑制候选靶基因KCTD15 mRNA和蛋白质的表达量(P<0.05或P<0.01);而抑制miR-17-3p的表达则会显著提高靶基因KCTD15的mRNA和蛋白质的表达量(P<0.05)。这些结果说明,miR-17-3p可能通过抑制KCTD15的表达促进延边黄牛前体脂肪细胞分化。

含钾通道四聚化结构域15基因多态性与冠心病的关系及意义

目的探讨含钾通道四聚化结构域15(KCTD15)基因单核苷酸多态性(SNP)位点rs11084753与冠心病的遗传易感性的关系。方法确诊的冠心病患者426例(男216例,女210例)为病例组,非冠心病患者及正常体检者436例(男224例,女212例)作为对照组,利用聚合酶链式反应(PCR)分析技术及DNA直接测序技术,对2组EDTA抗凝血KCTD15基因rs11084753(A/G)多态位点进行分型,按该位点等位基因A和G的出现情况将基因型分为AA、AG、GG三种类型。采用因素回归分析统计该多态位点与冠心病易感性的关系。检测所有研究对象的血脂水平。结果病例组血脂指标中TC、TG、LDL-C与对照组比较明显升高,而HDL-C则明显低于对照组;病例组患者吸烟、饮酒及阳性家族史的比例均高于对照组(P均<0.05)。AA、AG、GG基因型在病例组中的分布频率分别为52.4%、32.6%和15.0%,在对照组中分别是76.1%、18.4%和5.5%,2组基因型频率分布差异有统计学意义(χ2=8.174,P=0.0098)。多因素分析显示,携带rs11084753(A/G)多态位点G变异等位基因与冠心病的遗传易感性有明显相关关系(OR=5.94,95%CI=3.02～22.31,P<0.01)。结论 KCTD15基因rs11084753(A/G)多态位点与河北地区汉族人冠心病遗传易感有关。