构建基于Keima蛋白的细胞自噬评价体系

目的:构建表达Cyto-Keima蛋白的宫颈癌细胞系HeLa及小鼠原代神经元,作为新的细胞自噬评价体系。方法:包装pCDH-Cyto-Keima慢病毒,感染HeLa细胞和小鼠原代神经元,采用激光共聚焦荧光显微镜观察Cyto-Kei?ma蛋白在HeLa细胞和小鼠原代神经元中的表达情况,用已知自噬诱导剂和抑制剂处理细胞,检测该体系对自噬的响应。结果:感染Cyto-Keima慢病毒48 h后,通过激光共聚焦荧光显微镜观察,细胞表达Cyto-Keima蛋白;在Earle平衡盐溶液或自噬诱导剂雷帕霉素处理下,HeLa-Cyto-Keima细胞和Cyto-Keima原代神经元自噬水平明显增强;在自噬抑制剂巴弗洛霉素A1和氯喹处理下,细胞自噬水平明显降低。结论:构建了基于Cyto-Keima蛋白的细胞自噬评价体系。

基于Keima荧光蛋白的线粒体自噬评价体系的建立

目的:探讨建立一种基于Keima荧光蛋白评价线粒体自噬的体系。方法:由于Keima蛋白具有在酸性和中性pH中荧光信号不同的特性,因此定位于线粒体的Keima(mt-Keima)可显示通过自噬途径进入溶酶体中的线粒体,以此可以直观反映线粒体自噬的程度。构建定位于线粒体的Keima(mt-Keima)稳定表达载体,利用慢病毒感染的方式获得稳定表达细胞系。以CCCP刺激诱导线粒体自噬,观察刺激0~8 h 440 nm通道(指示中性pH下的Keima)和586 nm通道(指示酸性pH下的Keima)激发荧光信号的变化。结果:电泳结果显示mt-Keima基因片段扩增成功,酶切质粒鉴定结果显示重组质粒构建成功。不同pH条件下440 nm和586 nm激发光激发出的荧光信号不同,表明Keima蛋白表达正常并能够指示酸碱变化。在线粒体自噬诱导剂CCCP刺激下,细胞的酸性荧光信号随刺激时间逐步增加,表明线粒体自噬程度逐渐增强。结论:构建的体系能够准确评价线粒体自噬,为进一步探讨线粒体自噬机制提供了实验基础。

去氧紫草素对小鼠原代神经元线粒体自噬的影响

目的基于定位于线粒体上的Keima(mt-Keima)荧光蛋白研究去氧紫草素对小鼠神经元线粒体自噬的影响。方法分离mt-Keima转基因和C57BL/6野生型胚胎小鼠大脑皮质神经元(分别命名为mt-Keima神经元和C57BL/6神经元)。用激光共聚焦显微镜观察mt-Keima神经元在561和458 nm激发波长下荧光信号,鉴定mt-Keima神经元mt-Keima荧光蛋白的表达。用自噬抑制剂巴弗洛霉素A1 100 nmol·L^(-1)处理mt-Keima神经元24 h,用激光共聚焦显微镜观察神经元内的荧光信号,分析561和458 nm激发波长下荧光强度比值,检测mt-Keima神经元评价线粒体自噬的可靠性。去氧紫草素100 nmol·L^(-1)处理mt-Keima神经元24 h,用激光共聚焦显微镜观察神经元荧光变化,分析561和458 nm激发波长下荧光强度比值,评价去氧紫草素对线粒体自噬活性的影响。去氧紫草素100 nmol·L^(-1)处理C57BL/6神经元24 h,免疫荧光法检测C57BL/6神经元线粒体外膜受体蛋白Tom20的表达,四甲罗丹明甲酯染料染色后用激光共聚焦显微镜检测线粒体膜电位的变化。结果激光共聚焦显微镜结果显示,分离的mt-Keima神经元表达mt-Keima蛋白。与二甲亚砜(DMSO)对照组相比,巴弗洛霉素A1 100 nmol·L^(-1)处理组561和458 nm激发波长下的荧光强度比值下降(P<0.01),表明线粒体自噬水平降低,mt-Keima神经元可用于检测神经元线粒体自噬活性。与DMSO对照组相比,去氧紫草素100 nmol·L^(-1)处理组mt-Keima神经元在561和458 nm激发波长下荧光强度比值增强(P<0.01),表明mt-Keima神经元线粒体自噬水平增加。免疫荧光结果表明,去氧紫草素100 nmol·L^(-1)处理,可使C57BL/6神经元Tom20蛋白表达降低(P<0.01);激光共聚焦显微镜观察结果显示,去氧紫草素100 nmol·L^(-1)处理,对C57LB/6神经元线粒体膜电位无明显影响。结论去氧紫草素在不造成线粒体损伤的前提下可促进小鼠原代神经元线粒体自噬。

阿司咪唑对宫颈癌细胞HeLa自噬的影响

该研究利用蛋白质免疫印迹法(Western blot)、稳定表达m Cherry-EGFP-LC3B(microtubuleassociated proteins 1A/1B light chain 3B,LC3)自噬双标荧光细胞、mt-Keima荧光探针活细胞扫描技术在人宫颈癌细胞He La中检测了多种自噬相关标志物,探究了阿司咪唑(astemizole,AST)对He La细胞自噬的影响。结果表明,阿司咪唑在He La细胞中引起自噬标志蛋白质LC3-II与SQSTM1/p62的显著累积,并存在剂量和时间依赖性效应;阿司咪唑导致He La细胞存活率显著降低;用自噬抑制剂Bafilomycin A1(Baf-A1)阻断自噬流(autophagic flux)后,再加入阿司咪唑不能促进LC3-II进一步累积;阿司咪唑处理细胞后自噬体与自噬溶酶体的数量均显著增加;此外,阿司咪唑显著抑制了线粒体氧化磷酸化解偶联剂羰基氰化物间氯苯腙(carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone,CCCP)导致的线粒体标志蛋白质TOMM20(translocase of outer mitochondrial membrane 20)的降解,其线粒体自噬水平显著低于对照组。以上结果证明了阿司咪唑有抑制自噬流的作用,导致损伤的线粒体不能被顺利降解,并且提示该作用可能是通过抑制溶酶体功能实现的。

形态学检测在自噬研究中的应用

自噬是降解损伤及丧失功能的细胞器或蛋白,维持细胞更新和稳态的关键细胞过程。自噬可分为三个相对独立的步骤:自噬泡起始形成阶段、自噬小体形成阶段以及成熟降解阶段,每个阶段都有其相对独特的形态学特征或分子标志物变化。本文综述了自噬研究中常用的形态学研究方法、结果阐释及这些过程中的关键注意事项。