黄褐斑病损的组织学特征及角蛋白10的表达

目的:研究黄褐斑皮肤的组织学改变及角蛋白10(CK10)的表达情况。方法:取黄褐斑患者睑袋术后外眦多余皮肤,行石蜡切片的HE染色、Fontana-Masson染色和CK10的免疫组化染色,观察此处皮肤的病理学改变和CK10的分布情况。结果:黄褐斑皮损处表皮变薄,基底层细胞周围可见明显色素颗粒,基底上层、毛囊上段、真皮层也有色素颗粒分布,真皮胶原紊乱、断裂,皮肤附属器数量较少。CK10主要分布在表皮的基底上层和皮脂腺细胞的胞浆和腺泡的外层。结论:黄褐斑病损皮肤各层黑色素含量增多,皮肤组织结构多有老化表现。CK10在基底上层表达增强,其表达增强可能与表皮细胞过度分化、皮肤老化有关。

小鼠角蛋白10(K10)基因启动子的克隆及活性分析

【目的】角蛋白10(K10)是黑色素细胞中黑素体向周围角化细胞迁移的分子标记之一,在研究基因在黑色素细胞与角化细胞相互作用的功能时,可以作为特异的启动子。本研究欲筛选K10较强的启动子片段,为研究K10以及相关基因的功能提供理论依据和奠定理论基础。【方法】从小鼠尾巴提取基因组DNA,经质量鉴定后,采用PCR法扩增K10的6个不同片段(F1—F6),并将其分别亚克隆到p MD18-T载体,经测序验证是否正确;将K10的6个亚克隆片段再克隆到p GL0载体中,产生p GL0-F1—F6构建,用脂质体法转染293T细胞,转染结束后将细胞裂解,并通过双荧光素酶报告基因检测6个片段转染细胞后引起的荧光素酶活性变化,以筛选启动效果最好的启动子片段;用筛选到的K10启动子片段作为特异启动子,替换p GL0载体上的CMV强启动子,并与周期素依赖蛋白激酶5(CDK5)基因进行重组,形成p GL0-F-CDK5构建,用脂质体法转染小鼠皮肤角化细胞,待转染结束后,分别进行细胞爬片、细胞裂解和细胞总RNA的提取,之后用免疫荧光化学、双荧光素酶报告基因检测法和实时荧光定量PCR法检测CDK5的表达定位、表达水平及荧光素酶活性,以检测其在角化细胞中的启动效果;用生物信息法Promoter Scan分析所得到的活性最强的K10启动子片段,发现其可能的转录因子结合位点。【结果】PCR扩增、克隆得到K10启动子的6个片段(F1—F6),片段大小分别为1 201、908、664、787、790、656 bp;质粒p GL0-F1—F6分别转染293T细胞后,通过双荧光报告检测发现长度为787bp的F4启动子活性最强;但F1—F6启动子的活性均弱于p GL0-basic中CMV的启动活性;F4序列中含有基本启动子保守区域的共同序列即TATAAAA,经Promoter Scan分析发现F4序列中含有C/EBPβ、GATA、HSF、CAP等多个转录因子的结合位点,这些位点利于K10在角化细胞中表达;p GL0-F4-CDK5转染角化细胞后,通过荧光蛋白的表达检测载体上GFP报告基因的表达,发现p GL0-F4-CDK5转染角化细胞后引起GFP的表达量明显强于p GL0-basic-CDK5转染组;同时用荧光素酶活性检测p GL0-F4-CDK5在角化细胞中的启动效果,结果发现p GL0-F4-CDK5转染组的荧光比值明显高于对照组,差异显著(P<0.01);经实时荧光定量PCR检测CDK5的表达变化,结果发现p GL0-F4-CDK5转染角化细胞后引起CDK5 m RNA表达量明显高于对照组,差异呈极显著(P<0.01)。上述结果说明F4具有较强的启动子活性,是K10启动子的核心区。【结论】成功筛选了K10的核心启动子区域F4,在角化细胞里具有启动目标基因CDK5表达的功能,因此,F4可作为黑色素细胞与角化细胞相互作用过程中基因功能研究的特异性启动子,为研究K10基因功能提供理论依据。

FY-10诱导培养HaCat细胞分化的实验研究

目的：观察FY-10对无血清培养HaCat细胞分化的影响。方法：选择不同浓度的FY-10（10^-5～10^-9mol／L）分别添加于无血清培养的HaCat细胞培养液中，并在添加后24h回收总RNA，用逆转录PCR（RT—PCR）方法检测Hacat细胞分化的特异性标记TGase1、KRT6的mRNA表达情况。结果：FY—10添加后24h能显著的上调TGasel的mRNA的表达，其上调的程度与药物浓度成良好的线性关系；而FY-10对KRT6的mRNA表达呈显著的抑制作用，呈一定的剂量依赖性。结论：一定浓度下FY-10能上调无血清培养HaCat细胞对分化特异性标记蛋白TGase1mRNA的表达，而对KRT6mRNA有下调其表达的作用，促进HaCat细胞的分化，而抑制其增殖。

组胺对人角质形成细胞增殖、凋亡和分化的影响

目的探讨组胺对体外培养人角质形成细胞(HKC)增殖、凋亡和分化的影响及其机制。方法采用MTT法和蓝染色法检测组胺对HKC体外生长的影响,流式细胞仪检测细胞周期和细胞早期凋亡,细胞DNA梯度降解法检测凋亡,激光扫描共聚焦显微镜结合钙荧光探针技术检测HKC胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i),SABC免疫细胞化学法检测HKC分化标志物角蛋白10(K10)及内披蛋白表达。结果高浓度组胺抑制HKC生长,以10-4mol/L抑制率最大(细胞存活率65.6%);低浓度组胺则促进HKC生长,以10-8mol/L作用显著(细胞存活率130.7%)。10-4mol/L组胺致HKCG0/G1期比例增高30.97%,S期比例减少73.81%,抑制G1/S期转换,并明显促进细胞凋亡,早期凋亡率18.64%明显高于对照组(5.60%,P<0.05)。10-4mol/L组胺使HKC[Ca2+]i上升58.9%,H2组胺受体拮抗剂西咪替丁则使[Ca2+]i下降24.5%。10-4mol/L组胺下调HKCK10及内披蛋白表达,但与对照组无显著性差异(P>0.05)。结论高浓度组胺阻抑HKC细胞周期进程、诱导[Ca2+]i增加及其显著的促凋亡作用可能是使HKC体外生长受抑的部分机制。在生理条件下,组胺可能具有调节表皮组织更新的作用;在炎症、损伤等病理条件下,大量的组胺可能抑制表皮的再生和KC的分化。

Jarid1b对食管鳞癌KYSE-150细胞增殖及分化的影响

目的研究去甲基化酶Jarid1b对食管鳞癌细胞增殖及分化的影响,为食管鳞癌治疗提供新的靶点。方法采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)以及Western-blot方法检测低分化食管鳞癌细胞系KYSE-150和高分化食管鳞癌细胞系TE-1中去甲基化酶Jarid1b、细胞角蛋白10(CK10)、细胞角蛋白13(CK13)的表达。采用慢病毒转染的方式获得能够在药物诱导时过表达Jarid1b的KYSE-150稳转细胞系,应用CCK8细胞毒性实验检测过表达Jarid1b对该细胞系增殖能力的影响;采用RT-qPCR和Western-blot方法检测过表达Jarid1b后细胞系CK10和CK13表达量的变化。结果 RT-qPCR检测结果表明,和低分化KYSE-150细胞系相比,高分化TE-1细胞系中CK10和CK13高表达(t=22.07、38.44,P<0.05);Western-blot检测结果表明,和KYSE-150细胞系相比,TE-1细胞系中Jarid1b的蛋白表达水平明显增高。CCK8实验结果显示,与未诱导的KYSE-150细胞系相比,诱导KYSE-150细胞系过表达Jarid1b24、48h后,该细胞的增殖能力明显下降(t=10.94、16.71,P<0.05)。RT-qPCR和Western-blot方法检测结果表明,诱导KYSE-150细胞系过表达Jarid1b以后,与未诱导的KYSE-150细胞系相比CK10和CK13的表达明显增高(t=9.706、5.23,P<0.05)。结论去甲基化酶Jarid1b过表达可以抑制低分化食管鳞癌细胞KYSE-150的增殖并促进其分化。

燃煤型砷中毒患者口腔黏膜脱落细胞角蛋白10和相关基因表达及肝功能变化

目的观察燃煤型砷中毒患者口腔黏膜脱落细胞角蛋白10（K10）、c—myc和环氧化酶（cox2）的表达以及肝功能变化。探索燃煤型砷中毒的外周生物学标志。方法收集贵州省兴仁县交乐病区燃煤型砷中毒患者及病区健康人群（对照）口腔黏膜脱落细胞，以荧光实时定量PCR方法检测K10、c—myc、cox2基因的表达，同时抽取两组人群外周静脉血检测肝功能。结果砷中毒组患者口腔黏膜脱落细胞中K10基因表达（3．60±0．94）明显比对照组（1．82±0．68）增加（t=2．15，P〈0．05），c—myc、cox2表达未见明显变化（c—myc：3．50±2．77、3．39±2．07；cox2：5．90±1．40、4．73±1．91；t值分别为1．26、1．65，P〉0．05）；血清谷丙转氨酶较对照组明显增加（25．83±2．45、36．86±17．35；t=2．55，P〈0．05）。结论K10基因表达改变可能为燃煤型砷中毒患者一项敏感的外周生物学指标：肝脏是无机砷毒性作用的一个敏感的靶器官。

氨基酮戊酸光动力疗法抑制成纤维细胞生长因子10诱导的HaCaT细胞过度角化及增殖的机制研究

目的 探讨氨基酮戊酸光动力疗法（ALA-PDT）对成纤维细胞生长因子10（FGF-10）诱导的HaCaT细胞过度角化及增殖的作用及其机制。 方法 将培养的HaCaT细胞分为4组：空白对照组（无任何处理），FGF-10组（加入FGF-10孵育24 h），ALA-PDT组（ALA孵育24 h后红光照射），FGF-10 ＋ ALA-PDT组（FGF-10孵育24 h后，再加ALA孵育24 h，红光照射）。用CCK-8法检测各组细胞增殖活性，Western印迹法检测K1、K6、K16及角质形成细胞生长因子受体（KGFR）的含量，ELISA法检测各组细胞上清液中白细胞介素1α（IL-1α）蛋白表达，免疫荧光检测各组细胞KGFR和K6蛋白表达水平。统计学分析采用析因设计的方差分析和单因素方差分析。结果 析因分析显示，ALA-PDT和FGF-10对HaCaT细胞增殖无交互作用（F交互 = 1.369，P = 0.276），FGF-10对HaCaT细胞增殖有促进作用（FFGF-10 = 20.853，P 〈 0.05），而ALA-PDT有抑制作用（FALA-PDT = 24.822，P 〈 0.05）。与空白对照组细胞增殖活性（A值为0.924 ± 0.024）比较，FGF-10组（1.233 ± 0.099）显著升高（P 〈 0.05），而ALA-PDT组（0.718 ± 0.107）显著降低（P 〈 0.05），FGF-10 ＋ ALA-PDT组（0.901 ± 0.014）较FGF-10组显著降低（P 〈 0.05）。Western印迹法显示，FGF-10可促进K1、K6、K16蛋白和KGFR的表达（均P 〈 0.05），而ALA-PDT抑制这些蛋白的表达（均P 〈 0.05），FGF-10 ＋ ALA-PDT组K1、K6、K16和KGFR的相对表达量与FGF-10组比较均显著降低（均P 〈 0.05）。ELISA法显示，FGF-10会增加HaCaT细胞IL-1α蛋白分泌（P 〈 0.05），但ALA-PDT对其没有影响（P = 0.467）。此外，免疫荧光检测显示，FGF-10增加HaCaT细胞K6和KGFR免疫荧光强度（P 〈 0.05），而ALA-PDT降低K6和KGFR免疫荧光强度（P 〈 0.05），FGF-10 ＋ ALA-PDT组K6和KGFR免疫荧光强度显著低于FGF-10组（P 〈 0.05）。 结论 ALA-PDT能抑制FGF-10诱导的HaCaT细胞过度角化及增殖，其机制与下调K1、K6、K16、KGFR及IL-1α有关。

缓激肽对人角质形成细胞增殖凋亡及分化影响的实验研究

目的观察缓激肽(BK)对体外培养的人角质形成细胞(HKC)增殖、凋亡和分化的影响并探讨其机制. 方法以1×10-4～1×10-9 mol/L BK作用于体外培养的HKC,采用噻唑蓝法、台盼蓝染色法观察到1×10-4 mol/L BK抑制作用最强,以此浓度BK进行余下实验.当HKC达对数生长期后,一部分加入1×10-4mol/L BK作为实验组,另一部分不加BK作为对照组,分别培养24、48 h后采用流式细胞仪检测细胞早期凋亡情况及细胞周期,用链霉亲和素-生物素复合物(SABC)免疫细胞化学法检测HKC分化标志物角蛋白10(K10)及内披蛋白的表达情况.用含1×10-4mol/L BK的无血清培养基KC-SFM培养HKC作为实验组,对照组细胞仅加KC-SFM,分别用激光扫描共聚焦显微镜结合钙荧光探针Fluo-3/AM 技术检测细胞内游离Ca2+浓度即[Ca2+]i的变化. 结果与对照组比较,实验组G0/G1期细胞比例相对上升34.57%,S期相对下降58.91%,其细胞早期凋亡率为15.34%,明显高于对照组(5.60%,P<0.05).实验组HKC K10阳性细胞百分比为2.20%,明显低于对照组(6.89%,P<0.05).BK作用3 min后实验组HKC [Ca2+]i较对照组上升163.0%,之后开始下降,5 min后接近对照组.结论高浓度BK可抑制HKC周期进程、明显促进其凋亡及诱导[Ca2+]i升高,这可能是其使HKC体外生长受抑的部分机制.BK还可抑制表皮再生和HKC分化.

表皮松解性角化过度型鱼鳞病两家系基因突变研究

目的探讨两个表皮松解性角化过度型鱼鳞病（EHK）家系的基因突变情况。方法收集两个EHK家系的临床资料，提取外周血DNA，通过PCR扩增角蛋白基因KRT1和KRT10编码区的全部外显子及其侧翼序列并测序，以表型正常家系成员及50例健康人作为对照。结果发现两个家系中患者均存在KRT10基因突变，分别为KRT10的剪接位点突变c．1030—2A〉G和错义突变c．467G〉A，在家系中健康人及健康对照者未发现上述突变。结论剪接位点突变c．1030—2A〉G和错义突变c．467G〉A，可能分别是导致这两个家系临床表型的原因。

亚砷酸钠对人皮肤永生化角质形成细胞角化相关基因和核转录因子红系相关因子2mRNA表达的影响

目的观察不同浓度亚砷酸钠（NaAsO2）对人皮肤永生化角质形成细胞（HaCaT）角化相关基因和核转录因子红系相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor2，Nrf2）mRNA表达的影响。方法用0．00（对照）、3．13、6．25、12．50、25．00、50．00、75．00、100．00p．mol／LNaAs02处理HaCaT细胞48h，采用2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯）-2H-四唑单钠盐（CCK-8）法检测细胞增殖率。根据细胞增殖率检测结果，选择0．00（对照）、6．25、12．50、25．00μmol／LNaAs02处理HaCaT细胞48h，采用实时荧光定量PCR法检测HaCaT细胞角蛋白1（Keratinl，K-1）、角蛋白10（Keratin 10，K-10）、总苞蛋白（Involurin，Inv）、兜甲蛋白（Loricfin，Lor）和N以的mRNA表达。结果与对照组（100．05％）比较。6．25、12．50、25．00、50．00、75．00、100．00μmol／LNaAsO2组HaCaT细胞增殖率（83．06％、51．04％、39．52％、24．51％、16．99％、9．04％）明显降低，半数致死量为12．38μmol／L。与对照组（1．06±0．28、1．00±0．12、1．00±0．08）比较，6．25、12．50、25．00μmol／LNaAsO2组HaCaT细胞K—1、Inv、LormRNA表达（0．08±0．04、0．13±0．12、0．05±0．03，0．47±0．11、0．21±0．09、0．10±0．15，0．50±0．27、0．31±0．10、0．57±0．23）明显降低（P均〈0．05），但K-10mRNA表达呈现升高趋势，其中6．25μmol／LNaAs02组（1．83±0．45）明显高于对照组（1．07±0．14，P〈0．05）；而12．50、25．00μmol／LNaAsO2组Nrf2mRNA表达（0．13±0．07、0．69±0．33）明显低于对照组（1．00±0．09，P均〈0．05）。结论NaAsO2可通过影响细胞角化相关基因和Nrf-2mRNA表达，抑制HaCaT细胞增殖与角化。

先天性大疱性鱼鳞病样红皮病基因突变检测

目的研究1例先天性大疱性鱼鳞病样红皮病散发患者的基因突变情况，探讨基因型与表现型的相关性。方法应用聚合酶链反应扩增KRT1和KRT10基因的热点突变区，通过DNA直接测序的方法，对先天性大疱性鱼鳞病样红皮病患者、家系中的正常成员和50名无亲缘关系的正常个体的KRT1和KRT10基因进行突变检测。结果在患者KRT10基因的第1外显子上发现了1个错义突变（467G→A），导致角蛋白10（KRT10）1A区的精氨酸由组氨酸替代（R156H），而家系正常成员和无亲缘关系的50名正常对照中均未发现该突变。结论KRT10基因第1外显子突变（467G→A）在该例先天性大疱性鱼鳞病样红皮病患病的分子机制中发挥重要作用。

一对先天性大疱性鱼鳞病样红皮病双胞胎患者表型与角蛋白1基因突变研究

目的 检测先天性大疱性鱼鳞病样红皮病双胞胎患者角蛋白1、10（KRT1、KRT10）基因突变情况，探讨致病基因与表型间的关系。方法 收集1对先天性大疱性鱼鳞病样红皮病双胞胎患者及家族成员的临床资料。提取该双胞胎患者及其兄、父、母的外周血DNA，PCR扩增KRT1和KRT10基因编码区全部外显子及其侧翼序列并测序，以100例健康人作为对照。结果 先证者男，11岁，全身皮肤反复起水疱、肥厚伴脱屑11年；其双胞胎弟弟有类似皮损。2例患者KRT1基因1号内含子第1位碱基发生突变（c.591 ＋ 1G 〉 A），而家系中3例正常成员和无亲缘关系的100例健康对照均未发现该突变。结论 KRT1基因1号内含子第1位碱基突变（c.591 ＋ 1G 〉 A）可能为引起该双胞胎患者临床表型的病因。

人甲母质细胞无血清原代培养方法的建立

目的建立人甲母质细胞无血清原代培养方法。方法甲母质组织来自9例2016年1-12月在北京大学深圳医院行截指(趾)术与甲床修整术的患者。采用无血清DEME/F-12培养基于37℃、5%CO2条件下培养组织块2~3d,换无血清的角质形成细胞生长(CnT-07)培养基培养原代甲母质细胞,显微镜下观察培养过程中的细胞形态。以角蛋白5(K5)、角蛋白10(K10)为标记,采用免疫荧光鉴别培养获得的细胞,流式细胞仪分析细胞纯度。结果培养2~3d时,有细胞沿组织块爬出,在第10天左右,形成了大的细胞团块,部分细胞形态为上皮样细胞,呈铺路石样排列,部分呈扁平状,形态为纺锤形或星形。免疫荧光示,部分细胞可同时表达K5与K10.证明甲母质细胞的存在。K10阳性细胞约占37.6%。结论采用组织块培养法结合无血清培养基可成功培养出人原代甲母质细胞,体外培养的人甲母质细胞可同时表达K5与K10。

鳕鱼多肽对大鼠皮肤损伤修复的作用及相关机制

目的探讨鳕鱼多肽对大鼠皮肤损伤的修复作用及相关机制。方法24只SD大鼠,每只大鼠背部近脊柱皮肤造6 mm直径损伤模型。同一只大鼠背部分为空白对照(生理盐水组)、阳性对照(重组人表皮生长因子组)、实验组(鳕鱼多肽组)。术后用数码显微镜观察创面,用硫酸坐标纸记录创面大小。于术后第3、6、9、12天分别急性处死6只大鼠,行HE染色,反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测。结果第6、12天,鳕鱼多肽组创面明显缩小,与生理盐水组比较,差异有统计学意义(P<0.05);与生理盐水组比较,鳕鱼多肽组第3天表皮细胞生长因子(EGF)、角蛋白14(K14)表达高,第6、12天EGF、K10、K14表达均较高,差异有统计学意义(P<0.05 )。结论鳕鱼多肽促进SD大鼠全层皮肤损伤的修复,可能机制为促进角质形成细胞增生,上调K10、K14、EGF基因表达。