点阵CO_2激光作用皮肤光老化模型后表皮干细胞的分布特征

背景:临床应用点阵CO2激光治疗面部光老化已取得显著疗效,但点阵CO2激光作用于皮肤光老化模型创面修复过程中表皮干细胞的变化规律尚无研究。目的:观察点阵CO2激光作用小鼠皮肤光老化模型后创面愈合过程中表皮干细胞数量及其在表皮中的分布变化规律。方法:将10只昆明小鼠以UVB紫外线照射,制备成皮肤光老化模型,行点阵CO2激光(DeepFX)干预,观察激光创面愈合情况,并且于干预前、干预后第1,3,7,15天取材,行免疫组织化学染色观察角蛋白19和基因物质P63阳性表达。结果与结论:干预后第15天,点阵CO2激光创面基本愈合。激光干预后第3天角蛋白19和基因物质P63阳性细胞率高于干预前及干预第1天,并出现阳性细胞分布范围扩大。第7天阳性细胞率明显高于第1,3天,为最高值,排列结构紊乱,分布到表皮各层。第15天阳性细胞率下降,仅集中于表皮的基底层和毛囊隆突,阳性表达与干预前及干预后第1天无明显差别。结果可见表皮干细胞参与了点阵CO2激光干预小鼠光老化皮肤的修复过程,可能在该过程中发挥重要作用。

不同发育阶段人皮肤表皮干细胞增殖分化特征及其与创面修复结局关系的研究

为从细胞分化角度研究人胎儿期、少儿期、成年人期皮肤中表皮干细胞增殖分化特征 ,以及这些特征与创面修复结局的关系 ,分别取因创伤等原因致流产的 2 2～ 2 4周龄胎儿和 4～ 12周岁少儿、35～ 5 3岁成年人 3组全层皮肤。采用免疫组化方法检测表皮干细胞特异表达的β1整合素和细胞角蛋白 19(K19)。结果发现 ,胎儿期皮肤表皮基底层细胞β1整合素和K19染色均为强阳性 ,少儿期表皮基底层细胞中 6 0 %～80 %的细胞表达β1整合素和K19,成年人表皮基底层中表达β1整合素和K19的细胞较少儿组进一步减少 ,且染色强度较弱。结果提示 ,胎儿期表皮基底层增殖细胞均为表皮干细胞和短暂扩充细胞 ,而少儿期表皮基底层中部分细胞为干细胞和短暂扩充细胞 ,成年人期干细胞与短暂扩充细胞所占的比例则进一步降低。

表皮干细胞表型的成纤维样细胞在瘢痕中的表达

目的:探寻正常皮肤与增生性瘢痕中表皮干细胞标记物的表达,从组织学角度探讨表皮干细胞参与瘢痕增生的证据。方法:术中切取8例伤后6月增生性瘢痕患者的瘢痕组织及同例患者的正常皮肤,将其制备切片并分组,用Elivision二步法免疫组织化学检测表皮干细胞表面标志物β1整合素和CK19的表达,计数阳性细胞并进行统计学处理。结果:瘢痕组织真皮层中,表达阳性细胞数β1整合素和CK19较正常皮肤β1整合素和CK19明显增多(P<0.05),成纤维细胞数显著增多。结论:在病理性瘢痕的发生中,表皮干细胞可能在细胞因子作用下分化为成纤维细胞,从而参与瘢痕形成。

人表皮干细胞的体外分离和培养

目的:建立人表皮干细胞的体外分离和培养体系的方法,探索表皮干细胞体外大量扩增的途径。方法:采用0.375%的DispaseII和0.05%胰蛋白酶二步酶消化法从小儿包皮中分离表皮细胞,采用MTT法筛选表皮细胞基础培养基和表皮细胞生长因子(epidermalgrowthfactor,EGF)的最适浓度,建立表皮干细胞培养的干预体系。逐日观察培养的细胞呈表皮干细胞样的形态,免疫组化方法检测β1整合素和角蛋白19的表达。结果:以表皮细胞数量和活性作指标,不同浓度EGF干预条件细胞活性不同,以15ng/mLEGF的无血清SFM培养液为最适培养液,可使细胞呈表皮干细胞克隆样生长,β1整合素和角蛋白19表皮干细胞活性表达呈阳性。结论:采用0.375%的DispaseII和0.05%胰蛋白酶二步酶消化法从小儿包皮中分离表皮细胞,以15ng/mLEGF的无血清SFM培养液培养,此方法是一种简便、快速、经济的表皮干细胞分离和培养的方法。

雷公藤甲素体外对人表皮干细胞增殖的调控作用

目的:探讨雷公藤甲素体外对人表皮干细胞增殖的影响。方法:应用中性蛋白酶-Ⅳ型胶原黏附方法分离正常人的包皮表皮干细胞,采用细胞免疫组化法检测培养传代细胞的角蛋白19(CK19)、角蛋白10(CK10)、β1整合素表达,鉴定人表皮干细胞。培养传代细胞中加入不同浓度的雷公藤甲素,用倒置显微培养后观察细胞的形态学变化,应用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞的增殖情况,探索雷公藤甲素对人表皮干细胞增殖的影响。结果:免疫组化法检测提示培养传代细胞,β1整合素、CK19表达阳性,CK10表达阴性,MTT法检显示雷公藤甲素能显著抑制人表皮干细胞的增殖,且存在一定的浓度依赖性。结论:雷公藤甲素能有效抑制人表皮干细胞增殖。

不同发育阶段人皮肤表皮干细胞增殖分化特征及其与创面修复结局关系的研究

目的:从细胞分化角度研究人胎儿期、少儿期、成年人期皮肤中表皮干细胞增殖分化特征,以及这些特征与创面修复结局的关系。方法:分别取因创伤等原因致流产的22～24周龄胎儿和4～12周岁少儿、35～53岁成年人3组全层皮肤。采用免疫组化方法检测表皮干细胞特异表达的β1整合素和细胞角蛋白19(K19)。结果:胎儿期皮肤表皮基底层细胞β1整合素和 K19染色均为强阳性。少儿期表皮基底层细胞中60%～80%的细胞表达β1整合素和 K19。成年人表皮基底层中表达β1整合素和 K19的细胞较少儿组进一步减少,且染色强度较弱。结论:本实验结果提示,胎儿期表皮基底层增殖细胞均为表皮干细胞和短暂扩充细胞,而少儿期表皮基底层中部分细胞为干细胞和短暂扩充细胞,成年人期干细胞与短暂扩充细胞所占的比例则进一步降低。这种干细胞增殖分化的差异可能与三种不同发育阶段皮肤损伤的完全与不完全修复有关。

矾冰纳米乳对烧伤表皮干细胞增殖分化的影响

目的观察矾冰纳米乳对烧伤表皮干细胞(ESCs)增殖分化的调控作用。方法利用酶解法分离表皮和真皮,用IV胶原贴壁法获得ESCs进行离体培养,用MTT法检测不同浓度(8.15mg/L、16.3mg/L、32.6mg/L)的矾冰纳米乳及湿润烧伤膏(MEBO)在不同时间点(24h、48h、72h、96h)对ESCs增殖的影响,免疫荧光法检测矾冰纳米乳干预前后ESCs角蛋白19(CK19)及整合素β1的表达。结果所培养的细胞免疫荧光检测整合素β1和CK19双重染色,80.12%细胞为双标记阳性细胞,即ESCs。MTT法发现矾冰纳米乳及MEBO均能促进ESCs的增殖和分化,MEBO明显优于矾冰纳米乳各组,但与8.15mg/L的矾冰纳米乳比较没有统计学意义(P>0.05),与其他各组比较有显著地统计学意义(P<0.05),8.15mg/L的矾冰纳米乳在72h的增殖率为(86.498±0.333)%,调控作用最明显。免疫荧光发现8.15mg/L的矾冰纳米乳阳性细胞评分4.50±0.577,与MEBO比较没有统计学意义(P>0.05),与其他各组比有统计学意义(P>0.05)。结论 MEBO和矾冰纳米乳均对烧伤表皮干细胞增殖分化有调控作用,8.15mg/L为矾冰纳米乳的最优浓度,与MEBO比较疗效相当,没有统计学意义。

The Mechanism of Burn Regenerative Therapy and Wound Healing

Objective: From molecular, cell and systemic clinical treatment three levels, this report revealed the mechanism of wound healing, the basic theory and the importance of clinical practice for the Burn Regenerative Therapy with MEBT/MEBO (BRT & MEBT/MEBO).Method: This report analyzed the importance and clinical curative effect for standardized appliance of BRT & MEBT/MEBO from two key points: 1) Liquefaction of necrotic tissue from burn wound; 2) Skin regeneration in situ . Result: There are three necessary conditions for skin physiologically repair and regeneration of burn wound: 1) The formation of moist physiological environment on burn wound; 2) The material foundation of life regenerative substances and histology for keratin-19 stem cells’ regeneration in situ ; 3) Standardized procedures and appliance of BRT & MEBT/MEBO, which is the guarantee of burn wound healing physiologically. Conclusion: The theory of “Potential Regenerative Cell" and the technique of “Stem cell in situ regeneration" are the basic theory and clinical treatment for BRT. Full-thickness burn skin can be healed physiologically and the skin tissues and organs can be regenerated ONLY by standardized procedures and timely appliance of BRT & MEBT/MEBO.

白蛋白和角蛋白19双标记胚胎干细胞的建立及其向肝祖细胞的分化

目的建立白蛋白（Alb）和角蛋白19（CK19）双标记的胚胎干细胞系，并探讨其在肝祖细胞分化中的应用。方法构建含有Alb启动子的绿色荧光蛋白载体，并带有新霉素抗性，同时构建由CK19启动子启动红色荧光的载体，带有潮霉素抗性；将构建好的载体线性化后，同时电转胚胎干细胞E14.1，利用新霉素和潮霉素双筛选后，建立双标记基因修饰胚胎干细胞系E14．1—2；通过拟胚体形成及生长因子（骨形态发生蛋白4和碱性成纤维细胞生长因子）刺激的方法诱导产生肝祖细胞，经过流式细胞术和逆转录-聚合酶链反应检测诱导效率。结果构建了含有Alb启动子启动绿色荧光和CK19启动子启动红色荧光的载体，并证明了Alb和CK19启动子能特异启动各自蛋白的表达}建立了Alb和CK19双标记胚胎细胞系，并证明其具有多能性，显著表达多能性基因八聚体结合转录因子4和阶段特异性胚胎抗原1，在E14．1—2诱导分化22d后通过流式细胞术分选成功得到21．27％Alb和CK19双阳性的肝祖细胞。结论双标记胚胎干细胞的建立可以纯化和定量肝祖细胞，便于改进肝向诱导的方法及研究肝祖细胞特性。