PCR扩增技术用于犬内脏利什曼病病原体kDNA的检测

本文报导了用作者设计的一对寡核苷酸引物Ⅰ和Ⅱ以及文献报导的一对引物A、B检测内脏利什曼病病犬的骨髓、脾和外周血内的病原体kDNA,并和骨髓涂片检查利什曼原虫的结果进行了比较。共检测人工感染犬12只,骨髓涂片阳性者8例,其中PCR检测骨髓组织样品阳性者7例,检测脾组织样品阳性者3例;对照组犬脾、骨髓和外周血所有组织样品均为阴性。根据实验结果认为此法用于检测犬内脏利什曼病病原体kDNA有较好的效果。

伊氏锥虫动基体DNA序列比较

对伊氏锥虫新疆骆驼株（ＸＪＣＡ）、安徽水牛株（ＡＨＢ）和云南水牛株（ＹＮＢ）的动基体ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增后，用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧核糖核酸法测定扩增产物的序列。结果表明，各虫株间ＤＮＡ序列同源性为９７％。内聚分析表明，ＡＨＢ株与ＸＪＣＡ株相似性高属一类，而ＹＮＢ株与中国伊氏锥虫ＳＨ株相似性高属另一类。证明我国不同伊氏锥虫在动基ＤＮＡ序列上存在一些差别，这可能由于点突变的缘故。

伊氏锥虫动基体DNA微环的研究

采用限制性内切酶消化、琼脂糖凝胶电泳及分子杂交技术对８株中国伊氏锥虫动基体ＤＮＡ（ｋＤＮＡ）微环进行了比较研究。结果显示，我国伊氏锥虫株之间的ｋＤＮＡ微环序列具有较高的同源性，仅限制酶 ＡｌｕＩ，ＨｉｎｆＩ及 ＭｂｏＩ的酶解结果显示少数虫株的 ｋＤＮＡ微环存在异源序列。这种异源性可以作为伊氏锥虫种内分类的遗传学标志。

我国不同流行区利什曼原虫分离株动基体小环DNA序列分析

目的分析我国不同流行区利什曼原虫动基体小环DNA序列差异性。方法应用来自小环DNA保守区的一对引物KP1-KP2扩增该利什曼原虫动基体小环DNA,将扩增产物克隆于pGEM-T载体,随机选取5个阳性克隆进行双向测序,对获得的小环序列应用DNAStar软件进行比对分析,并利用Mega5.0构建系统进化树。结果应用KP1-KP2引物分别从来自我国不同流行区利什曼原虫虫株SC、KXG-Xu、KXG-65、JIASHI-1和801扩增出单一小环序列,长度分别为858bp,858bp,858bp,750bp和748bp。SC、KXG-Xu和KXG-65间序列一致性超过99%,JIASHI-1和801虫株序列均与其它虫株显示高度异质性。进化分析显示801与一杜氏利什曼原虫聚为一类,JIASHI-1与亲内脏的利什曼原虫聚为一大类,而SC、KXG-Xu和KXG-65三者聚为独自一类,和亲皮肤的利什曼原虫相比,与亲内脏的利什曼原虫有更近的亲缘关系。结论我国不同流行区利什曼原虫虫株小环序列存在较大差异性。

直接PCR法检测血液中伊氏锥虫感染

为建立伊氏锥虫动基体DNA(KinetoplastDNA,kDNA)的PCR扩增技术,血液直接PCR法检测伊氏锥虫的感染,本文以伊氏锥虫kDNA片段为靶扩增DNA设计引物,确定最适PCR反应条件,建立kDNA片段的PCR扩增技术,应用直接扩增缓冲液(Ampdirect)从感染小鼠的滤纸血标本直接PCR检测伊氏锥虫。结果发现,PCR扩增伊氏锥虫kDNA片段分子量为364bp,能检测的最小DNA量是0·06pg,与布氏锥虫、活动锥虫没有交叉反应。应用直接扩增缓冲液不需进行样本的DNA抽提,直接PCR能检测感染小鼠的早期滤纸血样本,敏感性高于镜检法。本实验建立的直接PCR法检测伊氏锥虫具有较高的敏感性和特异性,方法快捷,可进一步应用于伊氏锥虫病的早期诊断以及现场调查。

皮肤组织印迹杂交法诊断犬利什曼病研究初报

用利什曼病原虫KDNA印迹杂交法对采自甘肃省文县黑热病流行区的30只家犬耳缘皮肤组织印迹样品进行杂交试验。结果30份犬样品中有8份呈现阳性反应,阳性率为26.7％。同时进行骨髓涂片检查,有5只犬查见原虫,阳性率为16.7％。以上两种方法的符合率达76.7％(23/30)。印迹杂交法具有特异性高,取材方便,快速和结果易于观察等优点,在诊断犬利什曼病中有一定应用前途。

Detection of Kinetoplast DNA From Trypanosoma evansi by PCR

Trypanosoma evansi, an economically important haemoflagellate, infects many domestic and wild animals such as horses, camels, buffalo and deer, causing the trypanosomiasis called surra in these animals. This parasite has an extremely wide geographical distribution in the continents of Asia, Africa and South America. Surra is also one of the most important endemic diseases of animals in China, especially

马疫锥虫动基体DNA诱导抗dsDNA抗体产生条件与致病性的研究

目的研究不同免疫途径对马疫锥虫动基体DNA(kDNA)诱导正常小鼠产生抗双链DNA(dsDNA)抗体及其致病性的影响。方法将马疫锥虫kDNA与不完全弗氏佐剂乳化混合,通过皮下、腹腔、肌肉及静脉等途径注射入正常BALB/C小鼠。8周后,检测小鼠血清抗dsDNA抗体亚型及滴度、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、补体C3、24h尿蛋白浓度、肾小球免疫复合物沉积强度、肾组织病变活动指数等,并分析肾组织病理学特征。结果上述各组小鼠产生IgG型抗dsDNA抗体量及肾损害程度依次为:皮下组>腹腔组>肌肉组>静脉组(P<0.05);IgG型抗dsDNA抗体与肾组织病变活动指数呈正相关。结论不同免疫途径对马疫锥虫kDNA诱导抗dsDNA抗体产生有明显不同影响,其导致的狼疮样肾脏损害与该抗体亚型有关。

婴儿利什曼原虫汶川株动基体小环DNA序列分析

目的分析我国婴儿利什曼原虫汶川株动基体小环DNA株内序列差异性。方法应用来自小环DNA保守区的一对引物KP1-KP2扩增汶川株婴儿利什曼原虫动基体小环DNA。扩增产物克隆于pGEM-T载体,随机选取20个阳性克隆进行双向测序,应用DNAStar软件进行比对分析和开放阅读框预测,利用Mega5.0构建系统进化树。结果应用KP1-KP2引物从汶川株婴儿利什曼原虫扩增出动基体小环DNA片段,长约850bp。经序列比对可将20个阳性克隆序列区分为CQ18和CQ07两大类,进化分析显示这两类序列与杜氏利什曼原虫种团的原虫亲缘关系最近。CQ07序列含一较大开放阅读框,预计编码69个氨基酸残基的蛋白。结论婴儿利什曼原虫汶川株动基体小环DNA株内序列存在差异。

无症状感染利什曼原虫快速分子检测方法的建立与应用

目的建立适合快速检测利什曼原虫无症状感染者的分子生物学方法。方法选择利什曼原虫k DNA小环保守区的2对快速诊断特异性引物RV1-RV2、K13A-K13B,以杜氏利什曼原虫山东分离株前鞭毛体抽提的k DNA为模板进行PCR扩增,并通过对扩增条带测序比对来鉴定方法的可靠性。运用该法对四川省黑水县105例无症状家犬和新疆喀什地区部分乡镇75例无症状易感人群的静脉血样进行检测,并同时对上述地区确诊的部分病犬及病人(均为7例)进行检测,以验证该方法的可行性及准确性。结果 RV1-RV2、K13A-K13B两对引物扩增出与预期片段大小一致的条带,序列比对结果显示扩增产物在利什曼原虫种内保守性高;该方法对105例无症状家犬及75例无症状居民静脉血样的阳性检出率分别为37.14%(39/105)和82.67%(62/75),且对同地区确诊病犬及病人血样本检测的阳性率均为100%(7/7)。结论该方法适于目前我国黑热病流行区利什曼原虫无症状感染者的检测,且灵敏快速准确,具有较好的推广应用价值。

检测利什曼原虫的实时荧光定量PCR的建立及应用

建立一种快速准确检测利什曼原虫的实时荧光定量PCR(qPCR)方法。以利什曼原虫动基体小环保守序列为靶基因,设计1对特异性引物和Taq-Man探针,以利什曼原虫阳性患者骨髓样品DNA为模板进行PCR扩增,扩增产物长83 bp。扩增产物连接至pESI-T载体进行克隆、测序,测序结果在GenBank上进行BLAST比对,结果显示,其序列与婴儿利什曼原虫和杜氏利什曼原虫的序列一致性为100%。取测序正确的质粒梯度稀释至10^(2)~10^(7)拷贝/μl作为标准品进行qPCR,绘制获得标准曲线方程y=39.23-2.956 x,扩增效率为117.93%,R^(2)为0.994;当阈值循环数为35时,最低检测限为26.98拷贝/μl,理论上可检出小于1个利什曼原虫。用所建立的qPCR检测内脏利什曼病患者骨髓样品14份、血样26份,利什曼病病犬的骨髓、血液、脾、肺、淋巴结、肝、肾组织样品各1份,利什曼原虫阳性白蛉2份,患者和病犬骨髓培养物各1份,结果均为阳性;检测利什曼原虫血清抗体阳性犬骨髓9份,结果7份阳性;检测利什曼原虫血清抗体阴性人群血样56份,沙门菌、志贺菌、蜡样芽胞杆菌DNA各1份,疟疾患者血样4份,刚地弓形虫病患者血样、卫氏并殖吸虫病患者血样各1份,结果均为阴性。所建立的qPCR具有较高灵敏度及特异度,可用于利什曼病患者、宿主动物、传播媒介利什曼原虫感染与带虫状态的快速检测,可用于患者的疗效判定。