应用Q-PCR定性检测KIR基因有无方法的建立

目的建立定性检测KIR基因有无的Q-PCR方法。方法根据高分辨水平中国人群KIR等位基因的多态性,并参考国际IPD-KIR数据库,针对16种KIR基因及2DS4-Normal、2DS4-Deleted两种亚型,设计KIR基因特异性引物用于Q-PCR扩增反应;同时设置一孔阴性对照、一孔阳性对照(特异性扩增人体生长激素HGH基因片段),以监控假阳性、假阴性的结果。为验证Q-PCR方法的可靠性,随机选择302份已采用KIR PCR-SSP商品化试剂盒检测的标本,采用Q-PCR方法盲检和对比。结果300人份的Q-PCR检测结果与已知的PCR-SSP检测结果相符,有2份标本结果不一致,其中1例标本的2DS5基因Q-PCR检测结果为阴性,而PCR-SSP检测结果为阳性;另一例标本2DS1基因Q-PCR检测结果为阳性,而PCR-SSP检测结果为阴性。对2份标本分别进行2DS5、2DS1基因测序分型,证实Q-PCR定性检测结果正确。结论本文建立的KIR Q-PCR方法结果准确、可靠,可用于KIR基因有无的定性检测。

体外抗体功能修饰抑制性KIR对人NK细胞的影响

目的:检测抗体封闭抑制性受体KIR2DL1和KIR2DL2/2DL3对人NK细胞功能的影响。方法:应用Rosettesep人NK分选试剂盒分选外周血NK细胞,观察抗体封闭KIR2DL1和KIR2DL2/2DL3受体后,NK细胞对不同白血病细胞(人肿瘤细胞株NB4、Raji和K-562)及同种异体的成熟树突状细胞(DC)的杀伤活性;检测混合淋巴细胞反应中NK细胞对T淋巴细胞增殖的影响;检测细胞因子TGF-β1的表达水平。结果:任何一个抗体封闭KIR后,NK细胞杀伤NB4细胞活性均增强,并与抗体浓度呈现量效关系(P<0.05),2个抗体联用能增强NK细胞的杀伤活性;对Raji细胞的杀伤活性则改变较小;NK细胞对K-562细胞具有很强的杀伤活性,但经抗体封闭后,这种活性并没有提高。经抗体封闭KIR后,NK细胞对成熟DC的杀伤活性明显增强,并与抗体浓度呈现量效关系(2.20%±1.10%vs 37.59%±5.06%),各组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。经抗体封闭后的NK细胞在混合淋巴细胞反应中能明显提高对T细胞的增殖抑制(77.85%±8.31%vs 43.05%±5.95%,P<0.05),上清液中细胞因子TGF-β1的含量增加。结论:以抗体修饰抑制性KIR受体有助于提高NK细胞杀伤肿瘤及同种异体成熟DC的能力,活化的NK细胞通过分泌TGF-β1,抑制T细胞的增殖、活化。

吉林地区朝、满、汉3个民族KIR基因的分布频率研究

目的通过分析吉林地区汉族、满族及朝鲜族的杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)基因的频率与多态性,为探究KIR基因与疾病关联提供基础数据支持。方法采用聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)技术对吉林地区129名满族、198名朝鲜族及201名汉族人群的KIR基因进行分型。结果KIR3DL2、KIR3DL3、KIR3DP1及KIR2DL4在所有检测对象中均为100%检出。KIR2DL1、KIR2DL3、KIR2DS4、KIR3DL1及KIR2DP1等基因在这3个民族中的检出频率较高,介于93%~98%之间。相比之下,KIR2DL2、KIR2DL5、KIR3DS1、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3及KIR2DS5的检出率较低,分布在13%~45%。特别是满族KIR2DL5(17.83%)与KIR2DS1(17.83%)的基因检出频率显著低于吉林地区朝鲜族(42.93%、47.47%)和汉族(33.83%、33.33%);吉林地区朝鲜族KIR2DL5(42.93%)与KIR2DS1(47.47%)的检出频率显著高于汉族(33.83%、33.33%)和满族(17.83%、17.83%);吉林地区汉族单体型KIRAA的频率在吉林3个受检民族中是最高的为61.19%,显著高于朝鲜族(42.93%),以上各组差异比较P<0.05,经Bonferroni校正后,Pc<0.05。结论吉林地区的朝鲜族、满族与汉族在KIR基因分布方面既体现了中国人群KIR基因多态性,又各自展示了独特的民族遗传特性和地域性。

慢性HBV感染者干扰素治疗应答与KIR基因型相关性研究

目的探讨慢性HBV感染者对干扰素抗病毒疗效反应性差异与KIR基因型的相关性。方法对56名慢性HBV感染α-干扰素有效应答者(实验组)和57名慢性HBV感染干扰素无应答或部分应答者(对照组)分别进行KIR基因分型,比较2组间KIR基因型及单体型的差异。结果 AH基因型在实验组中的分布频率明显高于对照组(2χ=7.222 4,P<0.01),AF基因型及1型单体型在对照组中的分布频率明显高于实验组(2χ=10.057 5,P<0.01;2χ=16.328 3,P<0.01)。A组单体型在对照组中的分布高于实验组(2χ=5.982 8,P<0.05)。而B组则相反,在实验组中的分布高于对照组(2χ=5.983 0,P<0.05)。结论 AH基因型及B组单体型可能与α-干扰素抗病毒有效应答有关,AF基因型及1单体型和A组单体型可能与α-干扰素抗病毒疗效无应答或部分应答有关。

实时定量PCR检测KIR转录水平的方法构建

目的构建可定量检测杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)转录水平的方法。方法筛选KIR3DS1和KIR3DL1保守区特异性引物,利用RT-PCR和熔解曲线法对引物特异性进行检验,建立可定量的标准内参,应用SYBR Green RT-PCR方法检测标本中KIR3DS1和KIR3DL1的mRNA含量。结果通过电泳和实时定量PCR的熔解曲线明确了KIR3DS1和KIR3DL1引物,其特异性好,无杂带。应用TA克隆建立的KIR定量标准品线性关系好,可检测待测物的范围大。应用临床标本可检测出两组标本有显著差异,符合临床预期。结论本文建立的KIR mRNA定量检测方法,可以定量检测活化和抑制性KIR,可以进一步研究不同疾病进展的机制以及预测疾病的临床转归。

KIR2DL4-IgFc融合蛋白基因真核细胞表达载体的克隆及鉴定分析

目的 构建人KIR2DL4-IgFc段融合蛋白基因真核细胞表达载体。方法 用RT-PCR从孕妇蜕膜组织单个核细胞的总mRNA中逆转录扩增KIR2DL4胞外段cDNA,经Nhe I和Bam HI双酶切后,定向插入真核细胞表达载体CD51negl中,然后经酶切和测序鉴定。结果 限制性内切酶酶切和序列分析表明已成功构建CD51negl-KIR2DL4载体。结论 本研究成功构建KIR2DL4-IgFc融合蛋白真核细胞表达载体,为研究KIR2DL4与其配体之间的关系奠定了基础。

内向矫正性钾通道Kir4．1和Kir7．1在大鼠睫状体的分布

目的:在蛋白水平探讨Kir4.1和Kir7.1在大鼠睫状体的分布情况。方法:用间接免疫荧光组织化学和免疫荧光双标记在冰冻切片上检测Kir4.1和Kir7.1在大鼠睫状体的分布和定位。结果:Kir4.1蛋白分布于睫状体的色素上皮细胞和无色素上皮细胞的胞质和胞膜,内层的无色素上皮细胞免疫活性较强,免疫双标显示Kir4.1蛋白与谷氨酰胺合成酶蛋白重叠分布,Kir4.1蛋白免疫活性在睫状体的扁平部和睫状突上无明显差异。Kir7.1蛋白分布于睫状体的无色素上皮细胞和睫状肌,与特异性标记睫状上皮的Ezrin蛋白双标显示Kir7.1分布在无色素上皮的基底面,其免疫活性在睫状突强表达,在睫状体扁平部弱表达。结论:Kir4.1和Kir7.1均分布于大鼠睫状体的无色素上皮的基底面,可能与房水的生成有重要关系。睫状肌的Kir7.1分布,与调节睫状肌的舒缩、参与房水的排出密切相关。

上海地区汉族人群KIR2DL5基因多态性及单元型分析

KIR2DL5基因是杀伤细胞免疫球蛋白样受体 (KIR )单元型B的特征性标志 ,至少有 4个变异体 ,其中 2DL5A 0 0 1和2DL5B 0 0 3是表达型 ,统称为KIR2DL5 1;2DL5B 0 0 2和 2DL5B 0 0 4是不表达型 ,统称为KIR2DL5 2。本文用序列特异性引物PCR法 (PCR SSP )分析了KIR2DL5表达型KIR2DL5 1和不表达型KIR2DL5 2在上海地区正常汉族人群的分布及其在KIR单元型的组成。结果发现 (1)在 87名健康汉族人和 14个家族中表达型KIR2DL5 1和不表达型KIR2DL5 2基因频率分别为0 1977和 0 0 4 11;(2 )KIR2DL5基因变异体在不同单元型中分布不同 ,有 5种不同组合 ,其中单元型 1、 2、 3、 4、 11、 12、15和 16不含KIR2DL5及其变异体 ;单元型 5和 14只含有KIR2DL5 1;单元型 13和 17只含有KIR2DL5 2 ;单元型 6含有单一KIR2DL5 1或二者兼有 ;单元型 8和 9同时含有KIR2DL5 1和KIR2DL5 2。

HLA-Bw4及其KIR与宫颈癌的相关性研究

目的了解江苏汉族人群HLA-Bw4及其相应的抑制性杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)和激活性KIR与宫颈癌是否存在关联性。方法收集117例宫颈内皮样瘤变3级(CIN3)/宫颈癌患者和124例相匹配的无血缘关系健康女性外周血标本,采用PCR-SSP方法进行HLA-Bw4检测和SYBR GreenⅠreal-time PCR方法进行KIR3DL1和3DS1分型,分析HLA-Bw4及其KIR在2组人群间的差异。结果宫颈癌组与对照组相比,HLA-Bw4、KIR3DL1和3DS1的频率分布无显著性差异(P>0.05)。HLA-Bw4与KIR3DL1和3DS1形成的不同配对组合在病例组与对照组中的频率分布,差异也无统计学意义(P>0.05)。结论江苏汉族人群HLA-Bw4及其KIR3DL1和KIR3DS1可能与宫颈癌的发生无关。

大鼠心肌缺血再灌注损伤对Kir6.1和Kir6.2通道亚基表达的研究

目的探讨缺血再灌注损伤大鼠心肌中,Kir6.1与Kir6.2通道亚基基因及蛋白水平表达的改变。方法雄性SD大鼠14只,体重250～300g,随机分为:假手术组、缺血再灌注损伤(IRI)组,每组各7只。RT—PCR方法检测。Kir6.1、Kir6.2mRNA的表达;WesternBlot方法检测细胞膜Kir6.1与Kir6.2蛋白的表达;同时应用放免法检测血浆AngⅡ与缺血区、非缺血区的心肌AngⅡ含量。结果(1)IRI引发缺血区及非缺血区Kir6.1mRNA水平明显升高,而Kir6.2mRNA水平没有明显改变;(2)IRI引发缺血区及非缺血区心肌细胞膜Kir6.1蛋白水平明显升高,而Kir6.2蛋白水平没有明显改变。结论IRI导致心肌KATP通道亚基构成发生了改变,可能与局部RAS的激活有一定的关系。

激活性KIR受体在HLA全相合无关供体异基因造血干细胞移植中的作用

目的对不同激活性KIR受体（aKIR）在HLA全相合无关供体异基因造血干细胞移植中的作用进行研究。方法采用序列特异性引物聚合酶链反应（PCR-SSP）和基因测序（SBT）方法,对中国造血干细胞捐献者资料库中提供的74对HLA全相合供受者进行KIR及HLA高分辨分型,其中38例进行了异基因造血干细胞移植,接受移植的患者FAB分型为ALL18例、CML8例、AML12例,移植后的患者随访到2008年12月。结果在74对供受者中100﹪有KIR2DS4基因,64.87﹪有KIR2DS1基因,60.81﹪有KIR3DS1基因,45.95﹪有KIR2DS5基因,44.6﹪有KIR2DS2基因,35.14﹪有KIR2DS3基因。在AML和CML分型的移植中供者有激活性KIR2DS1、KIR2DS3和KIR3DS1基因高表达;而在ALL分型的移植中低表达。在表达KIR2DS4的供受者中,其中51.4﹪仅表达2DS4＊001/002亚型,23.6﹪仅表达2DS4＊003-007亚型,25.0﹪为两种亚型同时表达。供受者仅有2DS4＊001/002亚型的病例均在移植后死亡;供者具有2DS4＊003-007亚型的病例1年无病生存率为83.3﹪。当供者aKIR基因数目≥3个时,ALL患者的1年无病生存率为87.50﹪;当供者aKIR基因数目〈3个时,AML/CML患者1年无病生存率为83.33﹪。结论在无关供体异基因造血干细胞移植中,KIR单体型A、激活性KIR受体基因亚型和数目的差异表达,对降低GvHD的发生和移植的预后起关键作用。

大鼠kir2.1通道重组质粒的构建及其在HEK293细胞中的表达

内向整流钾电流（IK1）是心肌最主要的背景外向电流,参与静息电位的维持和心肌动作电位3 期终末的复极,进而调控心肌的兴奋性和传导性[1,2].已知心肌细胞IK1通道主要由Kir2 亚家族（Kir2.x） 中的Kir2.1、Kir2.2 和Kir2.3 构成,它们的编码基因分别是KCNJ2、KCNJ12 和KCNJ4.其中,Kir2.1是最重要的亚型[3], 也是组成人类心肌细胞IK1电流的主要亚单位[4],大量研究表明IKir2.1减弱或增强均可导致严重的心律失常[1,2].基于此,国内外众多学者在抗心律失常药物筛选过程中将目光投向了Kir2.1 通道,Kir2.1 通道电流克隆细胞模型成为必备的研究工具.本研究利用分子克隆技术, 构建pEGFP-N1-Kir2.1 真核表达质粒, 并对其在人胚胎肾细胞（HEK293）中的表达进行检测.

慢性脑低灌注白质损伤后脑周细胞Kir6.1、Kir6.2的表达

目的:探讨慢性脑低灌注白质损伤后脑周细胞Kir6.1、Kir6.2的表达情况。方法:采用蛋白免疫印迹(Western blot)方法检测慢性脑低灌注白质损伤模型大鼠脑周细胞Kir6.1、Kir6.2在不同时间点(术后第7 d、14 d、30 d、60 d)的表达变化。结果:(1)模型组在不同时间点Kir6.1蛋白表达均升高,于30 d达到高峰,与假手术对照组相比差异有统计学意义(P<0.001);(2)模型组在不同时间点Kir6.2蛋白表达与假手术对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论:慢性脑低灌注白质损伤后脑周细胞Kir6.1表达增强,这提示Kir6.1/K-ATP通道可能参与了慢性脑白质损伤的病理生理过程;Kir6.1、Kir6.2的表达在脑周细胞出现了明显的异质性。

NK细胞表面免疫球蛋白受体KIR基因的分析

目的为了探讨人类自然杀伤(NK)细胞的自然杀伤作用机制。方法采用PCR-SSP技术,调查和分析67例国人的KIR基因型和组合型频率。结果在表达出16个KIR基因中,87.5%的KIR基因的频率>0.35;由14个KIR功能基因组成的KIR基因组合型25个,其中仅KIR-2DL1-2DL3-2DL4-3DL1-3DL2-3DL3-2DS4的分布频率达到0.373,而其余频率均≤0.09。比较本文、日本人群、韩国人群和高加索人群中已报道的56个KIR基因组合型,4个民族和地区间基因组合型共享率为8.93%;本文、韩国人群和高加索人群间为5.36%;本文和高加索人群间为1.79%;28.58%为本文首先报道的基因组合型。结论本文证实单个KIR基因多态性有较高的分布频率;在25个KIR基因组合型中,仅有以传导抑制信号为主的组合型KIR-2DL1-2DL3-2DL4-3DL1-3DL2-3DL3-2DS4的分布频率达到0.373(4%),远低于87.5%的单个KIR基因的频率。但是,KIR-2DL1-2DL3-2DL4-3DL1-3DL2-3DL3-2DS4的分布频率在四个民族和地区人群中均列第一,提示KIR基因组合型以抑制性信号通路为主是一种常态,使自身细胞不会遭受自然杀伤。研究为可能探讨改变肾移植术通过KIR基因调节NK自然杀伤作用活性的增强或抑制功能,改变终生使用免疫抑制药物的相关研究提供可利用的数据。

中国新疆维吾尔族、云南彝族KIR多态性分析

分析中国新疆维吾尔族、云南彝族健康人群的KIR基因多态性及单倍型特点。采用序列特异性引物PCR方法(PCR-sequencespecificprimer,PCR-SSP)对维吾尔族、彝族人群基因多态性进行低分辨率检测和单倍型分析。维吾尔族中共检出15种基因型,以AH(5,2)型最常见,频率为22.7%,其次为AF(1,2)和M(2,8),频率分别为13.7%,9.09%。在彝族中共检出19种基因型,以AJ(2,2)型最常见,频率为33.3%,其次为AF(1,2),频率为17.5%。此外,在维吾尔族、彝族中共发现8种新基因型,提示中国少数民族有着自己独特的KIR基因分布频率、单倍型频率和基因型频率。

抑制型KIR基因组合型与肾移植急性排斥反应的关系

目的:探讨抑制型KIR基因组合型(AA类型)传导通路在尸体肾移植受者发生急性排斥反应(AR)中可能的作用.方法:应用PCR-SSP方法,检测24对肾移植供受者的KIR基因组合型,分析供受者AA类型和非抑制型KIR基因组合型(BB,AB类型)与肾移植术后AR的相关性.结果:24对供受者中AA类型供者9例,受者10例;BB类型供者3例,受者4例;AB类型供者12例,受者10例.AA类型受者AR发生率10%(1/10),BB和AB类型受者AR发生率64%(9/14)(P<0.05).供者是AA类型受者AR发生率11%(1/9),供者是BB和AB类型受者AR发生率60%(9/15)(P<0.05).供受者为AA/AA类型配型受者AR发生率为0%(0/4),而供受者不是AA/AA类型配型受者AR发生率为50%(10/20)(P=0.114).结论:AA类型受者肾移植术后AR的发生率低,对BB或AB类型受者选择AA类型的供肾能够降低AR的发生率.AA类型可能传导抑制信号为主.

中国北方人群系统性红斑狼疮患者KIR基因多态性的研究

目的:检测和分析系统性红斑狼疮患者的杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)基因的多态性,探讨系统性红斑狼疮(SLE)从基因到临床表达的发病机制。方法:应用PCR-SSP技术检测北方62例确诊SLE患者和61例同一区域同一民族正常对照者的KIR基因位点多态性。结果:SLE患者KIR基因表型分布较常见的为KIR3DP1、2DL1、2DP1、3DL1、2DL3及1D,其次为2DS4、2DL5、3DS1、2DS2、2DS5和2DL2,较低者为2DS1、2DS3及3DP1V,SLE病例组KIR3DS1,2DL2、2DL5和2DL3基因型频率比对照组显著降低(P<0.01)。结论:中国北方人群的SLE的发生可能与多个KIR基因等位基因有相关性。

原代培养乳鼠窦房结细胞的形态和kir2.1蛋白表达

目的研究乳鼠窦房结细胞中kir2.1蛋白表达水平,建立一套可靠的乳鼠窦房结定位、细胞培养与鉴定技术,为进一步心脏生物起搏实验奠定基础。方法在石蜡切片中用HE染色、嗜银染色、髓鞘染色和Mallory磷钨酸-苏木素染色法(PTAH)进行乳鼠窦房结定位和形态学观察;取SD乳鼠的窦房结组织进行原代细胞培养,观察培养细胞的形态和搏动频率,免疫组织化学检测其kir2.1蛋白表达。结果综合嗜银染色、髓鞘染色和PTAH染色3种方法可准确定位乳鼠窦房结组织。在培养的窦房结细胞中观察到梭形细胞、三角形细胞和不规则形细胞3种有自发性收缩的细胞,其中梭形细胞最多且形态结构特点和搏动频率符合起搏细胞的特点,三角形和不规则细胞与心房肌细胞特征相似。乳鼠窦房结细胞的kir2.1蛋白表达低于心房和心室肌细胞。结论综合嗜银染色、髓鞘染色和PTAH染色3种方法可以准确定位SD乳鼠窦房结,乳鼠窦房结细胞中kir2.1蛋白表达水平低于心房和心室肌细胞。

慢性乙型肝炎患者HBV特异性CTLs的KIR表达研究

目的检测慢性乙型肝炎患者外周血中HBV特异性CTL细胞表面杀伤细胞抑制性受体(KIR)的表达情况。方法利用MHC-Ⅰ-肽-五聚体(pentamer)技术结合流式三色分析技术,直接离体情况下检测(directex vivo)慢性乙型肝炎患者不同HBV特异性CTL细胞表面KIR的表达情况。结果在慢性乙型肝炎患者,KIR阳性的CD8+T细胞明显增加;KIR阳性的HBcAg(18-27)特异性CTL、HBeAg(335-343)特异性CTL、HBp(575-583)特异性CTL的百分比分别为12%、20%、35%。结论慢性乙型肝炎患者不同HBV特异性CTL表达KIR,这可能与慢性乙型肝炎患者HBV特异性CTL功能低下密切相关。

Kir 4.1基因沉默对U-251细胞周期的影响

目的:针对人内向整流性钾离子通道(inwardly rectifying potassium channel protein,Kir)4.1基因构建si RNA干扰载体,探讨其对U-251细胞增殖、生长的影响,为临床治疗及开发新的抗肿瘤药物提供实验依据。方法:采用细胞培养、质粒转染、流式分选、RT-PCR、Western blot及流式细胞仪对构建的质粒进行鉴定并观察对照组和干扰组细胞周期的变化。结果:对DH5α中抽提的重组载体测序验证结果和插入序列一致;成功筛选出一个有效质粒;质粒转染U-251细胞后,细胞周期中的G2期细胞数量由19.39%降至1.5%,明显减少(P=0.018),S期细胞数量由36.32%升至51.22%,明显增多(P=0.027)。结论:成功构建针对人Kir 4.1基因的si RNA干扰载体;Kir 4.1干扰载体可能是通过抑制U-251细胞周期中的G2期,使U-251细胞的生长停滞在S期,从而达到干扰U-251细胞的增殖能力。