甲酸脱氢酶在Klebsiella pneumoniae中的表达和功能分析

在甘油厌氧发酵生产1,3-丙二醇的过程中,需要消耗还原当量NADH,NADH的有效供给决定了1,3-丙二醇的产量和得率。采用PCR方法从Candidaboidinii基因组中克隆编码甲酸脱氢酶基因fdh,将fdh基因片段插入载体pMALTM-p2X中,构建表达载体pMALTM-p2X-fdh,并转入1,3-丙二醇生产菌Klebsiella pneumoniae YMU2,获得重组菌Klebsiella pneumoniae F-1。研究了重组质粒的稳定性和IPTG诱导fdh基因过量表达的条件。结果表明,重组质粒具有良好的稳定性;fdh基因表达的蛋白分子量为40.2kDa;IPTG诱导表达研究表明,在IPTG浓度为0.5mmol/L时,诱导4h后甲酸脱氢酶表达明显;发酵过程中甲酸脱氢酶比酶活达到5.47U/mg;与出发菌株K.pneumoniae YMU2相比,重组菌F-1合成1,3-丙二醇的浓度提高了12.5%。

质粒介导的克雷伯菌耐喹诺酮类药物机制研究

目的了解华南地区qnr基因介导的克雷伯菌耐喹诺酮类药物的情况并研究其耐药机制。方法收集临床分离的克雷伯菌株共200株,其中产酸克雷伯菌6株。PCR方法筛查基因,琼脂稀释法测MIC,质粒结合试验,聚合酶链反应(PCR)通用引物扩增各组基因及测序。结果200株细菌中筛查到带qnr基因的菌株共2株(其中产酸克雷伯菌1株),均对环丙沙星敏感。进一步确证实验中证实2菌株都含qnr基因。2菌株经结合实验后在选择平板上都有菌生长,而且对环丙沙星的MIC值均有30倍以上的的提高。2株菌均有gyrASer83→Tyr突变,产酸克雷伯菌株有parCSer80→Ile突变。2株菌质粒PCR扩增的qnr产物测序结果与NCBI中qnr基因比对吻合率达100%。结论华南地区已有质粒介导的耐喹诺酮类菌株存在,它们能够跨种属转移,值得临床医生重视。

生物被膜肺炎克雷伯杆菌AmpC酶、超广谱β-内酰胺酶的检测

目的:探讨生物被膜(BF)菌的耐药机制,为临床合理应用抗生素提供理论依据。方法:应用改进的平板培养法建立肺炎克雷伯杆菌BF模型,用银染法和扫描电镜观察鉴定。采用改良三维试验法检测超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)及AmpC酶。结果:浮游肺炎克雷伯杆菌单产AmpC酶,单产ESBLs酶及同时产ESBLs和AmpC酶的菌株分别为2.5%(1/40)、20.0%(8/40)、2.5%(1/40);BF肺炎克雷伯杆菌单产AmpC酶,单产ESBLs及同时产ESBLs和AmpC酶的菌株分别为20.0%(8/40)、45.0%(18/40)、22.5%(9/40)。对浮游组和BF组的检出率两两分别进行χ2检验,BF组各酶的检出率均明显高于普通浮游组各酶的检出率(P<0.05)。产酶BF肺炎克雷伯杆菌对8种抗生素(除亚胺培南全部敏感外)的耐药率均较高。结论:BF的形成和产生ESBL及AmpC酶的协同作用是肺炎克雷伯杆菌耐药的主要原因之一。

克雷伯氏菌N-5对三苯基锡的降解性能

通过耐受性实验,得到三苯基锡(TPT)高耐受性细菌N-5、N-6和酵母菌Ja、Jc.经初步测试,发现克雷伯氏菌N-5菌株的降解性能较为理想.性能研究表明,当菌龄为36 h且水样中菌质量浓度、TPT质量浓度、外加碳源葡萄糖质量浓度分别为14 g/L、5、5 mg/L时,该菌对TPT的降解效果最好,5 d降解率达到50%左右.扫描电镜观察显示,该菌在有TPT存在的环境中,细胞发生明显变化,其变化程度随着TPT质量浓度的提高和处理时间的延长而加大,刺激强度较大时细胞变皱.且该菌体有集中起来抵御不良生长环境的自我保护机制.

产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌耐药基因分析

目的了解邢台地区产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)肺炎克雷伯菌的分子流行病学特点,为临床感染预防和治疗提供依据。方法采用最小抑菌浓度(MIC)法检测产ESBLs肺炎克雷伯菌的耐药性,选取13种特异性引物采用聚合酶链反应(PCR)的方法检测产ESBLs肺炎克雷伯菌的基因类型。结果 2013年1月至2014年3月从邢台人民医院分离出的125株非重复的产ESBLs肺炎克雷伯菌菌株,耐药基因以blaCTX-M的阳性率最高,为92.0%,blaSHV和blaTEM次之,为82.9%和73.2%。所有菌株均携带1种或1种以上的耐药基因。结论产ESBLs肺炎克雷伯菌多重耐药现象严重,耐药基因以bla_(CTX-M)、bla_(SHV)和bla_(TEM)为主。医院应加强对ESBLs的监测,降低ESBLs的感染率以及耐药基因的突变,提高治疗感染的效率,防止医院感染的发生。

产ESBLs肺炎克雷伯菌的耐药基因谱及遗传学特征

目的:了解产ESBLs肺炎克雷伯菌的耐药基因谱及其遗传学特征。方法:对35株产ESBLs肺炎克雷伯菌,采用聚合酶链反应(PCR)检测aac(3)-Ⅰ,aac(3)-Ⅱ,aac(6′)-Ⅱ,ant(3″)-Ⅰ,ant(2″)-Ⅰ,aac(6′)-Ⅰ,aac(6′)-Ⅰb等7种氨基糖苷类修饰酶基因,TEM,SHV,LEN,OKP,CTXM-1,CTXM-2,CTXM-9,GES,PER,VEB,OXA-10,OXA-1,OXA-2,DHA,ACT-1等15种β-内酰胺酶基因,intI1,intI2,intI3等3种整合子基因,tnpA(TnA转座子标记),merA(Tn21/Tn501转座子标记),qacEΔ1-sul1消毒剂耐药基因,qnr喹诺酮类耐药基因,共检测29种耐药基因并对部分产物进行测序。结果:35株肺炎克雷伯菌中检出β-内酰胺酶基因22株,阳性率62.9%。整合子基因阳性22株,阳性率62.9%。氨基糖苷类修饰酶基因阳性26株,阳性率74.3%。tnpA全部阴性。merA阳性2株,阳性率5.7%。qacEΔ1-sul1阳性13株,阳性率37.1%。qnr全部阴性。在测序中发现一种新的基因型,并以aac(6′)-Ⅰb-Suzhou型命名,登录于美国NCBI(登录号:EF375621)。结论:产ESBLs肺炎克雷伯菌的耐药基因及耐消毒剂基因的携带率非常高,耐药基因谱及其遗传学特征非常复杂。

产ESBLs的肺炎克雷伯菌耐药性及脉冲场凝胶电泳分型研究

目的探讨产超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases,ESBLs)肺炎克雷伯菌的耐药性状况和分子流行病学特点。方法采用Kerby-Bauer纸片扩散法测定49株临床分离的产ESBLs肺炎克雷伯菌对19种抗菌药物的耐药性;并采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术对其做同源性分析。结果49株产ESBLs肺炎克雷伯菌对美罗培南和亚胺培南敏感率达100%,对其他17种抗菌药物均表现不同程度耐药;PFGE图谱有6组(A￣F),以A型(27株)、B型(10株)、C型(9株)流行为主,49株产ESBLs肺炎克雷伯菌中共有19株和重症监护病房(ICU)相关,占38.8%,流行菌株在各病房之间传播。结论产ESBLs肺炎克雷伯菌呈多重耐药,其对美罗培南和亚胺培南的敏感率为100%,可作为治疗感染的首选药物,其他药物可根据药敏结果选择;浙江大学医学院附属第一医院在2006年2-8月有产ESBLs肺炎克雷伯菌流行,ICU是高发区域,普外科、呼吸内科、综合病房和干部病房中的分离率也较高,需加强检测和控制。

吉林地区大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌ESBLs的基因分型

目的对产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌携带的ESBLs耐药基因进行分型,为临床合理应用抗生素提供理论依据。方法收集住院患者标本中分离出的51株大肠埃希菌和32株肺炎克雷伯菌,经PCR对上述菌株所携带的ESBLs耐药基因进行分型。结果产ESBLs大肠埃希菌中耐药质粒编码TEM型、SHV型和非TEM非SHV型超广谱β-内酰胺酶基因的百分率依次为80.4%,7.8%和11.8%;而在肺炎克雷伯菌中的百分率依次为78.1%,71.9%和25.0%。多数产ESBLs肺炎克雷伯菌同时产生一种以上的β-内酰胺酶。结论获得了吉林地区大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌ESBLs的不同基因型,ESBLs基因型具有地区性差异。

水貂肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定

本研究从临床上水貂肺出血死亡的病例中分离到1株优势菌,通过细菌常规鉴定方法对该菌进行了形态特征、生化特性和16SrRNA测序等试验,并对该菌株进行了耐药分析和人工感染试验。结果显示,该菌是1株肺炎克雷伯氏菌,具有高度的耐药性,并且能致小鼠死亡。由此推断,该菌是致水貂死亡的主要致病菌。

医院产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌的检测及耐药性

目的:了解我院产超广谱β-内酰胺酶(extended spectrum β-lactamase,ESBLs)肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌的检出率及其耐药特征,为临床合理使用抗生素提供依据。方法:对我院2003年1月～2005年12月住院病人分离的肺炎克雷伯菌122株、大肠埃希菌313株,采用NCCLs推荐的纸片扩散表型确证试验进行ESBLs检测,用K-B法做药敏试验。结果:435株肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌中检出产ESBLs菌139株,总检出率31.95%,其中肺炎克雷伯菌检出率33.61%、大肠埃希菌检出率31.31%;ESBLs检出率有逐年上升趋势;呼吸道标本ESBLs检出率最高,占59.71%;产ESBLs菌对抗生素的耐药率显著高于不产ESBLs菌(P<0.005),并对氨基糖苷类、喹诺酮类等抗生素呈多重耐药,对含β-内酰胺酶抑制剂的复合抗生素耐药率有增高趋势,均对亚胺培南敏感。结论:肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌的ESBLs检出率逐年增加,应及时对ESBLs菌进行检测,以指导临床用药。亚胺培南可作为ESBLs菌治疗的首选药。

同一地区不同医院新生儿科产超广谱β-内酰胺酶细菌感染的对比分析

目的:了解同一地区不同医疗机构新生儿科产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)细菌感染的临床对比分析及耐药性分析,为临床治疗及预防提供依据。方法:回顾性分析同一地区不同医院(A院为三级甲等综合性医院,B院为三级甲等儿童专科医院)2010年1月～2011年12月新生儿科产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)细菌感染的情况及其药敏结果。结果:两所医院新生儿科产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)细菌感染率2011年高于2010年,B院感染率高于A院;肺炎克雷伯菌感染率超过大肠埃希菌;肺炎克雷伯菌以痰液检出率高,大肠埃希菌以血液检出占首位,药敏实验结果显示:(ESBLs)+肺炎克雷伯菌对头孢菌素类耐药率高(81.8%～100%),对青霉素+酶抑制剂耐药率也偏高(约70%),对氨基糖苷类、喹诺酮类、碳青霉烯类耐药率低(0～9.1%),对亚胺培南基本敏感,在B院发现4例耐药;产(ESBLs)+大肠埃希菌对亚胺培南普遍敏感,在B院发现2例耐药。结论:产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)细菌感染率逐年上升,其中B院稍高于A院;肺炎克雷伯菌感染率高于大肠埃希菌;对多种抗菌药物耐药,同一地区不同医院耐药性总体上相同,但是也存在一定差异,临床治疗应根据病原学检查及药物敏感试验合理选用抗菌药物。

肺炎克雷伯菌产超广谱β-内酰胺酶基因分型研究

目的调查广州地区下呼吸道感染肺炎克雷伯菌产超广谱β-内酰胺酶(ESBL)的分离率及各种基因型的流行病学分布。方法收集广州地区13家医院2001-10～2002-12临床分离的肺炎克雷伯菌511株,采用美国临床实验室标准化委员会规定的ESBL表型筛选和确证试验确定ESBL的发生率、PCR扩增对产ESBL菌初步分型,然后对部分PCR扩增阳性产物测序,序列分析进一步确定基因型。结果肺炎克雷伯菌产ESBL分离率为40.1%。TEM型49株占21.9%,均为TEM-1型;CTX-M型59株占28.8%;SHV型96株占46.8%。结论SHV型是广州地区下呼吸道感染肺炎克雷伯菌产ESBL流行的常见基因型。

玉米秸秆水解液发酵联产氢气与2,3-丁二醇的初步研究

选用实验室自行筛选的Klebsiella pneumoniae ECU-15,进行了玉米秸秆水解液发酵联产氢气和2,3-丁二醇的初步研究。结果表明:以葡萄糖为碳源时,两目标产物随培养条件的改变呈现相同的变化趋势,且最佳发酵温度为37℃,最佳pH为6.0,最佳初始糖浓度为30 g/L;不同比例葡萄糖/木糖为混合碳源时,均能实现氢气和2,3-丁二醇的联产过程,但随着木糖含量的增加,细胞产量、氢气产量和2,3-丁二醇的产量都有所下降,并且木糖的存在会降低葡萄糖的消耗速率;实验最后以玉米秸秆水解液和同比例模拟合成培养基为底物,初步探明了该菌株利用水解液发酵联产氢气和2,3-丁二醇的可行性,最终氢气产量为0.65 v/v,产氢得率为0.43 mol/mol sugar;2,3-丁二醇产量为5.05 g/L,得率为0.82 mol/mol sugar。

老年人克雷伯杆菌肺炎68例临床分析

目的探讨老年人肺炎克雷伯杆菌肺炎早期诊断及治疗。方法对2000年1月-2006年6月60岁以上住院的老年人肺炎克雷伯杆菌肺炎68例进行回顾性分析。结果患者多见于男性，临床表现以发热、咳嗽、咳痰多见，所有病例均有多种合并症。肺炎克雷伯杆菌对抗生素具有多重耐药性。结论肺炎克雷伯杆菌肺炎临床表现无特殊性，及时做细菌学检查，是提高早期诊断及治疗的关键。

外源载体高效转化肺炎克雷伯菌的新途径

研究介绍了提高Klebsiella pneumoniae电转化效率的新途径,即直接从固体平板上收集K.pneumoniae菌落制备电转化感受态细胞,完全不同于传统的试验方法。试验菌株为野生型K.pneumoniae NTUH-K2044和magA—突变型菌株。将大小不同的质粒pIP843T、pIP843TdhaB、pIP843TdhaT电转化K.pneumoniae,计算电转化效率。电转化试验结果表明:K.pneumoniaeNTUH-K2044固体菌电转化效率高达2×105±300转化子/μgDNA,而其液体菌电转化效率仅为150±10转化子/?gDNA;其magA—突变株固体菌的转化效率最高,可以达到3.4×107±500转化子/μgDNA,比液体菌电转化效率提高了104倍。同时发现质粒大小对电转化效率并没有明显影响。此外,激光共聚焦显微镜观察发现固体平板和液体培养基中的菌体存在形态学方面差异,推测固体培养菌电转化效率的显著提高和形态学方面的表现可能具有一定的相关性。

Klebsiella pneumoniae连续发酵生产1,3-丙二醇的工艺优化

微生物发酵法生产1,3-丙二醇的常用方式是批式流加发酵,但是发酵时间较长,产物的生产强度较低,而连续发酵生产1,3-丙二醇,通过物料不断流动使发酵达到动态平衡,可有效提高生产强度。该文以已建立的批式发酵动力学模型为基础,对克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae HR526)连续发酵生产1,3-丙二醇的工艺进行了研究,优化得到了使得产物浓度最大的稀释率参数,并分析比较了不同稀释率条件下的单级和多级连续发酵的实验结果。结果表明,最佳的连续发酵方式是二级连续发酵,总稀释率为0.028 h-1时产物浓度达到68.11 g/L,生产强度达到1.89 g/(L·h),与48 h的批式流加发酵相比,生产强度提高了27.7%。

一株新分离的克雷伯氏菌对三苯基锡的降解性能及离子释放规律

研究了克雷伯氏菌在无机盐培养基和去离子水中对三苯基锡(TPhT)的降解性能,考察了不同时间TPhT降解率与各离子释放量的变化关系,为论证有机锡的微生物降解机理提供实验依据.5.0 g.L-1菌体处理120 h后,3.0 mg.L-1TPhT在无机盐培养基和去离子水体系中的降解率分别高达77.3%和60.9%.在TPhT降解过程中,TPhT会促进菌体离子的释放,加剧菌体的内陷并增加凋亡细胞的数量.TPhT的降解率与NH4+、Na+、PO34-、SO24-、NO2-的释放在0.01水平下显著正相关,Na+、NH4+、Ca2+的释放规律符合准二级动力学模式.XPS分析证明菌体降解TPhT 120 h前后细胞表面元素和基团没有发生改变,但TPhT则发生了转化.

过表达醛脱氢酶对Klebsiella pneumoniae合成3-羟基丙酸的影响

克隆了肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)及大肠杆菌(Escherichia coli)各自的醛脱氢酶基因puuC和aldH,获得了重组肺炎克雷伯氏菌K.p(pET-PK-puuC)和K.p(pET-PK-aldH),这两株菌均能以甘油为唯一碳源生产3-羟基丙酸(3-HP)。发酵实验结果显示K.p(pET-PK-puuC)的甘油转化率和单位菌体产量与野生菌相比分别提高了135%和18%;K.p(pET-PK-aldH)的3-HP产量达1.43 g/L,是K.p(pET-PK-puuC)的1.8倍,比野生菌提高了81%,甘油转化率和单位菌体产量比野生菌分别提高了150%和88%。

小儿肺炎克雷伯菌耐药率监测及临床意义(附72例分析)

目的分析肺炎克雷伯菌药敏特点及对临床指导意义。方法通过痰培养获得该菌药物敏感试验结果,同时积累临床病例资料。结果共分离肺炎克雷伯菌72株,其中不产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)58株,产超广谱β-内酰胺酶14株,多来自重症肺炎、难治性肺炎、院内感染性肺炎。选择敏感抗生素治疗痊愈病例增多。结论肺炎克雷伯菌耐药率增加,其感染引起重症肺炎、难治性肺炎,院内感染机会多。痰培养结果与临床结合利于指导用药。

大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌质粒AmpC酶基因型及流行病学分析

目的研究大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中产质粒型 AmpC 酶株的比率、酶的基因型及其流行病学状况。方法收集本院、福建省立医院两家医院2004年9月至2005年3月的67株耐头孢西丁不重复大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌,用酶提取物三维试验检测高产 AmpC 酶;抽提高产 AmpC酶株质粒,用 PCR 及产物序列分析确定质粒 AmpC 酶和β内酰胺酶的基因型;质粒转化试验定位耐药基因;ERIC-PCR 指纹图确定产酶株间的同源关系。结果福州两家医院耐头孢西丁菌中产质粒型 AmpC 酶的发生率,大肠埃希菌分别为16.7%和10.5%,肺炎克雷伯菌则分别为8.0%和0。2株肺炎克雷伯菌产 DHA-1型、4株大肠埃希菌产 CMY-2型、1株大肠埃希菌产 CMY-22型质粒 AmpC酶;5株产 CMY 型 AmpC 酶的大肠埃希菌还分别同时产 CTX-M-14、CTX-M-27、TEM-144和 TEM-1型β内酰胺酶。7株菌中,1株肺炎克雷伯菌和3株大肠埃希菌可将头孢西丁耐药性转移给受体菌。7株产酶菌 ERIC-PCR 指纹图显示,2株肺炎克雷伯菌来自相同克隆,其余菌株来自不同克隆。结论福州地区发现产 DHA-1型 AmpC 酶肺炎克雷伯菌和产 CMY-2型及 CMY-22型 AmpC 酶大肠埃希菌。CMY-22型 AmpC 酶和 TEM-144型β内酰胺酶是国内外首次报道,GenBank 登录号为 DQ256079和DQ256080。