KLFs对珠蛋白基因表达和红系分化的调控作用

Krüppel样因子(Krüppel-like factors,KLFs)是一组与真核基因转录调控密切相关的锌指蛋白.KLFs高度保守的羧基末端含3个串联的Cys2His2型锌指结构,用于结合GC盒和CACCC盒等DNA序列.红细胞中特异表达的珠蛋白基因和许多红系调控因子中都含有CACCC盒.已有研究发现,多个KLFs通过结合CACCC盒参与调控珠蛋白基因表达和红系分化,例如,KLF1通过结合β-珠蛋白启动子和位点控制区(locus control region,LCR),促进β-珠蛋白的表达、γ-向β-珠蛋白基因的转换和红系分化;KLF2、KLF11和KLF13分别促进ε-和γ-珠蛋白基因的表达;KLF4促进α-和γ-珠蛋白基因的表达;KLF3和KLF8则抑制ε-和γ-珠蛋白基因的表达.本文综述了KLFs调控珠蛋白基因表达和红系分化的研究进展.

锌指蛋白转录因子KLFs家族与心血管疾病

心血管疾病（cardiovasculardisease）是一系列与心脏血管相关的循环系统疾病。循环系统是指人体内运送血液的器官和组织，主要包括心脏和血管（动脉、静脉、微血管）。心血管疾病以血管病变为主要病理特征，其主要诱因包括炎症反应、内皮细胞损伤、脂代谢异常、血栓和动脉粥样硬化等。在诸多心血管疾病中，危害性最大患病人数最多的有心肌肥大、动脉粥样硬化、糖尿病、冠心病及肥胖等。

肝细胞癌相关转录激活因子KLFs的研究进展

锌指蛋白转录因子(Krüppel-like factors,KLFs)家族共17个成员,在肿瘤发生、发展中起促进或抑制作用,其中家族成员中KLF4、KLF5、KLF6、KLF8、KLF9、KLF10及KLF17与肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)关系密切,显示HCC相关KLFs异常表达在HCC诊断、治疗中具有应用前景。本文综述了7种HCC相关KLFs研究新进展。

转录因子KLFs家族与口腔鳞状细胞癌关系的研究进展

本文综述了近年来国内外学者对转录因子KLFs家族与人类口腔鳞状细胞癌(OSCC)关系的研究,探讨KLFs家族中各KLFs的结构和功能及其与OSCC的关系,为寻找OSCC早期发现与诊断的新指标和OCSS的靶向治疗提供依据。

宫颈癌组织中KLF12、STAT3的表达及其与临床病理特征和预后的相关性

目的:分析宫颈癌中Krüpple样转录因子12(KLF12),信号转导和转录激活因子3(STAT3)的表达,并探讨其与临床病理特征和预后的相关性。方法:收集2017年07月至2020年07月收治于本院的82例宫颈癌患者活检及手术宫颈癌标本。采用免疫组化法检测患者宫颈癌组织及宫颈癌KLF12、STAT3表达情况。通过χ^(2)检验分析KLF12、STAT3表达与宫颈癌患者临床病理特征的关系。采用多因素Cox回归分析宫颈癌患者预后的相关因素。绘制Kaplan-Meier曲线分析KLF12、STAT3表达与宫颈癌患者3年生存率的关系。结果:宫颈癌组织KLF12阳性表达率高于癌旁组织(P<0.05),STAT3阳性表达率高于癌旁组织(P<0.05)。不同年龄、产次、月经状态、肿瘤直径、组织学分类、浸润深度患者宫颈癌组织中KLF12、STAT3表达差异无统计学意义(P>0.05)。FIGO分期Ⅱ期、低分化、有淋巴结转移的宫颈癌患者组织中KLF12、STAT3阳性表达率较高(P<0.05)。多因素Cox回归分析显示,FIGO分期Ⅱ期、KLF12、STAT3阳性表达均是宫颈癌患者3年内死亡的独立危险因素(P<0.05)。Kaplan-Meier曲线结果显示,KLF12阳性表达患者3年生存率66.66%(28/42)低于KLF12阴性表达患者90.00%(36/40)(P<0.05),STAT3阳性表达患者3年生存率70.49%(43/61)低于STAT3阴性表达患者100%(21/21)(P<0.05)。结论:宫颈癌组织中KLF12、STAT3阳性表达升高,两者异常表达与FIGO分期、分化程度、淋巴结转移及预后有关,可作为用于评估预后的生物标志物。

KLFs与肿瘤发生发展的关系

Krüpple是果蝇分节基因"间隙基因"类的一个成员,它编码一个包含一个DNA结合序列的蛋白质,该序列由几个Cys2/His2型的锌指构成,一群与Krüpple的锌指结构高度同源的蛋白质被发现,命名为Krüpple样因子(Krüpple-like factor,KLFs),它们通过调控多种富含GC或CACCC的启动子的基因的表达,参与细胞增殖、分化、凋亡和肿瘤发生、发展等多种生理、病理过程。本文综述KLFs的结构、表达调控功能、主要家族成员及其在肿瘤研究中的现状,探讨其与肿瘤发生发展的关系。

KLF4通过mTOR/P70S6K途径激活细胞自噬减轻高糖诱导的足细胞损伤

目的:分析Krüppel样转录因子4(KLF4)对高糖诱导的足细胞损伤的影响及相关分子机制。方法:体外培养MPC5细胞,将MPC5细胞分为对照组(Control组)、高糖组(HG组)、高糖+空载质粒对照组(HG+NC组)、高糖+KLF4过表达组(HG+KLF4组)。采用qRT-PCR法检测细胞中KLF4 mRNA表达水平,CCK-8法测定细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot法检测细胞中相关蛋白表达水平。结果:与Control组比较,HG组MPC5细胞中KLF4 mRNA和蛋白表达量降低,细胞增殖活性降低,细胞凋亡率升高,细胞中突触足蛋白(synaptopodin)、足蛋白(podocin)、肾蛋白(nephrin)、微管相关蛋白轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)、Beclin1蛋白表达量降低,P62蛋白表达量、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)/mTOR和磷酸化核糖体40S小亚基S6蛋白激酶(p-P70S6K)/P70S6K比值升高;差异均有统计学意义(P<0.05)。与HG组比较,HG+KLF4组MPC5细胞中KLF4 mRNA和蛋白表达量升高,细胞增殖活性升高,细胞凋亡率降低,细胞中synaptopodin、podocin、nephrin、LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白表达量升高,P62蛋白表达量、p-mTOR/mTOR和p-P70S6K/P70S6K比值降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:KLF4通过激活足细胞自噬减轻高糖诱导的足细胞损伤,其作用机制可能与调控mTOR/P70S6K信号通路有关。

间充质干细胞来源的外泌体调控miR-143对大鼠颅内动脉瘤形成的影响机制

目的 研究间充质干细胞(MSCs)来源的外泌体调控miR-143对大鼠颅内动脉瘤(IA)形成的影响及机制。方法 原代分离大鼠骨髓MSCs(BMSCs)和脑血管平滑肌细胞(VSMCs)。将VSMCs分为PBS组、外泌体-miR-NC组(ExosomemiR-NC)、Exosome-miR-143组、Exosome-miR-143+GW4869组、过表达对照组(oeNC)、过表达KLF5组(oeKLF5)和oeKLF5+Exosome-miR-143组。超速离心法分离BMSCs来源的外泌体,并用透射电镜和纳米示踪分析鉴定外泌体。PKH26染色检测外泌体转移。miR-143 mimic和miR-NC转染BMSCs或VSMCs。实时荧光定量PCR检测miR-143和KLF5 mRNA的表达,Western blot检测相关蛋白的表达。CCK-8实验、EdU实验、流式细胞术实验、划痕实验和Transwell迁移实验检测VSMCs的活力、增殖、凋亡和迁移能力。双荧光素酶报告基因系统分析miR-143与KLF5的关系。构建大鼠IA模型,研究BMSCs来源的外泌体miR-143在体内对IA形成的影响。结果 与细胞裂解液组相比,miR-143在BMSCs外泌体中表达显著增加(P<0.01),且可通过外泌体转移到VSMCs中。与Exosome-miR-NC组相比,Exosome-miR-143组VSMCs的活力增加(P<0.01),而EdU阳性细胞数、S期细胞数、凋亡和迁移数显著减少(P<0.01);与Exosome-miR-143组相比,Exosome-miR-143+GW4869组细胞活力降低(P<0.01),而EdU阳性细胞数、S期细胞数、凋亡和迁移数明显增加(P<0.01)。与miR-NC或Control组相比,miR-143、Exosome-miR-143和ExosomemiR-NC组WT-KLF5的荧光素酶报告基因活性及KLF5的mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.01),而MUT-KLF5的荧光素酶报告基因活性不变(P>0.05)。与oeNC组相比,oeKLF5组细胞活力显著降低(P<0.01),EdU阳性细胞数、S期细胞数、凋亡和迁移数明显增加(P<0.01);与oeKLF5组相比,oeKLF5+Exosome-miR-143组细胞活力明显增加(P<0.01),而EdU阳性细胞数、S期细胞数、凋亡和迁移数明显减少(P<0.01)。体内实验结果与细胞实验相一致。结论 BMSCs来源的外泌体miR-143通过靶向KLF5抑制大鼠IA的形成。

老年胃癌患者癌组织KLF17、TP53蛋白表达及临床意义

目的观察老年胃癌患者组织Krüppel样因子17(KLF17)、TP53蛋白表达及分析其临床意义。方法选取2021年9月—2023年5月哈尔滨医科大学附属第四医院消化内科接诊的108例老年胃癌病例,采用免疫组织化学法测定患者的癌组织、癌旁组织KLF17、TP53蛋白表达,并分析其与胃癌患者临床病理参数、预后的相关性。结果癌组织KLF17、TP53蛋白表达阳性率分别为37.04%、12.96%,均低于癌旁组织66.67%、44.44%(均P<0.05);癌组织中KLF17蛋白表达水平与肿瘤直径、TNM分期、淋巴结转移、脉管侵犯呈负相关,TP53蛋白表达与肿瘤直径、TNM分期呈负相关(P<0.05);癌组织KLF17、TP53蛋白阳性表达者无进展生存时间(PFS)、总生存时间(OS)均长于阴性表达者(均P<0.05)。结论老年胃癌患者癌组织KLF17蛋白、TP53蛋白阳性表达比例可能低,且二者均与其临床病理可能呈独立负相关,并影响患者预后,有一定临床检测意义。

异土木香内酯通过miR-5195-3p/KLF5/N-cadherin对肝纤维化的作用机制

目的探讨异土木香内酯(isoalantolactone,IAL)通过miR-5195-3p/KLF5/N-cadherin对肝纤维化的作用机制。方法将SD大鼠随机分为正常组、模型组、IAL低、中、高剂量(IAL组)、IAL+miR-5195-3p mimic组和奥贝胆酸组,每组20只。采用ELISA法检测炎症因子水平,HE染色和天狼星红染色观察病理学改变情况和纤维化分级、评分情况,比色法测定氧化和抗氧化酶水平;qRT-PCR和Western blotting检测肝脏组织各因子mRNA和相关蛋白表达。结果与正常组相比,模型组ALT、AST、IL-6、IL-β、TNF-α、MDA、KLF5 mRNA、N-cadherin mRNA水平及肝纤维化分级、Ishak评分明显升高(P均<0.05)。与模型组相比,IAL低、中、高剂量组和奥贝胆酸组的以上各项指标依次显著降低(P均<0.05)。与正常组相比,模型组的SOD、GSH-Px、miR-5195-3p水平明显降低(P均<0.05),与模型组相比,IAL低、中、高剂量组和奥贝胆酸组的以上指标水平依次显著升高(P均<0.05)。与正常组相比,模型组大鼠肝脏小叶炎症明显升高,并发生严重损伤,与模型组相比,IAL低、中、高剂量组和奥贝胆酸组肝脏病理状态依次减轻。荧光素酶报告发现,KLF5是miR-5195-3p的重要靶点。与IAL组相比,IAL+miR-5195-3p mimic组肝脏损伤明显减轻,纤维化程度明显改善。结论IAL可以明显改善肝功能及炎症因子水平,增强肝脏的抗氧化能力,减轻肝脏脂质过氧化损伤程度,对肝脏纤维化具有一定的防治疗作用,这可能与IAL通过提高miR-5195-3p表达,降低KLF5和N-cadherin水平有关。

miR-29b通过KLF4调控血管平滑肌细胞增殖及表型蛋白表达

目的探讨微小RNA-29b(microRNA-29b,miR-29b)通过靶向作用于Krüppel样因子4(Krüppel-like factor 4,KLF4)信号通路对血管平滑肌细胞增殖及表型蛋白表达的影响。方法将血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)分为4组:无义序列对照组(control+NC)、miR-29b过表达对照组(control+miR-29b)、无义序列模型组(ox-LDL+NC)、miR-29b过表达模型组(ox-LDL+miR-29b)。对照组细胞正常培养;模型组细胞采用80 mg/L氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)诱导24 h建立模型。细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)检测VSMCs的增殖情况;实时荧光定量PCR检测miR-29b、单核细胞化学趋化因子1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)、MCP-3、α平滑肌肌动蛋白(smooth muscleα-actin,SMα-actin)、平滑肌肌球蛋白重链(smooth muscle myosin heavy chain,SM MHC)及KLF4的mRNA表达水平;酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒检测培养上清中MCP-1、MCP-3水平;Western blot检测蛋白表达水平;双荧光素酶报告基因实验检测miR-29b对KLF4的靶向作用。结果ox-LDL刺激VSMCs后,细胞中miR-29b表达量显著下降。与ox-LDL+NC组相比,ox-LDL+miR-29b组细胞增殖减少,炎症因子MCP-1和MCP-3的表达降低,收缩表型蛋白SMα-actin、SM MHC的表达显著升高,KLF4表达下降。双荧光素酶报告基因实验结果表明,miR-29b能与KLF4 mRNA的3′端非翻译区(3′UTR)结合。过表达KLF4可抑制miR-29b的作用。结论miR-29b可靶向作用于KLF4,调控ox-LDL诱导的VSMCs增殖、炎症因子的表达及表型蛋白表达的变化。

巨噬细胞迁移抑制因子对人胚胎干细胞存活、增殖和分化的影响

背景:巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)是一种具有多效性作用的细胞因子,可以在不同类型干细胞中自分泌并且能调控细胞的增殖、分化和迁移。课题组前期研究证实人胚胎干细胞自分泌MIF,且在培养液中浓度基本固定。然而,MIF是否参与了人胚胎干细胞的存活、增殖和分化尚不清楚。目的:探究MIF对人胚胎干细胞存活、增殖和分化的作用。方法:(1)培养人胚胎干细胞H9,CCK-8法检测并绘制细胞生长曲线,采用酶联免疫吸附法定量检测培养基中MIF水平。(2)为了明确外源性MIF对人胚胎干细胞存活、增殖的影响,分为:对照组,细胞在干细胞培养基中正常培养;外源性MIF组,在干细胞培养基中分别添加30,100,300 ng/m L的MIF;MIF抑制剂ISO-1组,在干细胞培养基中分别添加2,7,21μmol/L的ISO-1;MIF+ISO-1组,在不同浓度ISO-1组中分别添加100 ng/m L MIF,采用CCK-8法检测上述各组细胞活力。(3)为进一步阐明MIF基因对人胚胎干细胞存活、增殖的影响,采用CRISPRCas9技术构建MIF敲除的H9细胞系,观察建系情况。(4)为了明确高浓度MIF对人胚胎干细胞初步分化是否有影响,在培养基中分别添加100 ng/m L MIF和100 ng/m L CXCR4中和抗体,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-q PCR)、免疫细胞荧光、蛋白质印迹法(Western blot)检测干细胞自我更新因子(KLF4、c-MYC、NANOG、OCT4、SOX2)及分化转录因子(FOXA2、OTX2)的表达水平。结果与结论:(1)人胚胎干细胞H9的对数生长期为3-6 d,正常生长的情况下自分泌MIF水平约为20 ng/m L,与细胞量无关;(2)与对照组相比,添加不同质量浓度MIF对人胚胎干细胞的增殖无影响(P>0.05);ISO-1明显抑制人胚胎干细胞的增殖,ISO-1浓度越大,抑制越明显(P<0.05);ISO-1中添加MIF可以减少ISO-1的抑制作用(P<0.05);(3)RT-q PCR检测MIF基因敲除约50%后,人胚胎干细胞生长活力显著降低并且无法建系成功;(4)在培养基中添加100 ng/m L外源性MIF,自我更新转录因子KLF4的m RNA、蛋白及荧光表达水平均下降;分化因子FOXA2的m RNA、蛋白及荧光表达水平均上升;(5)在培养基中添加100 ng/m L CXCR4中和抗体,KLF4的m RNA及蛋白表达水平均上升;FOXA2的m RNA及蛋白表达水平均下降,与MIF组表达趋势相反。综上所述,人胚胎干细胞自分泌的MIF是其存活所必需的;培养基中额外添加MIF并不能促进人胚胎干细胞增殖,但可以使自我更新因子KLF4表达下降,转录因子FOXA2表达上升,为下一步探明MIF对人胚胎干细胞分化的影响及机制提供了线索,MIF-CXCR4轴在其中起到一定的调控作用。

山羊KLF8生物学特征及对肌内前体脂肪细胞增殖的影响

旨在克隆山羊KLF8基因序列,阐明组织表达特性,并初步揭示过表达KLF8后对山羊肌内前体脂肪细胞增殖的潜在影响.利用逆转录PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)方法克隆获得山羊KLF8基因启动子和CDS区序列(coding sequence,CDS),并运用生物信息学方法分析其序列特征;利用基因重组方法构建山羊pcDNA3.1-KLF8真核过表达载体,利用CCK-8、EdU检测方法和实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)明确KLF8对山羊肌内前体脂肪细胞增殖的影响.结果显示,获得包含2个潜在的核心启动子、多个TATA-Box和GATA-Box的山羊KLF8基因启动子2 001bp和包含KLF家族典型的锌指结构域、发挥转录抑制/激活基序的CDS序列1 062 bp.KLF8高表达于山羊脾脏组织,极显著高于其他组织(P<0.01),中度表达于肾脏和肺脏组织,低表达于背最长肌和股二头肌.过表达KLF8抑制山羊肌内前体脂肪细胞增殖,并且这种作用可能是通过上调CCND1的表达来实现的.结果为明确山羊KLF8基因生物学特征及对山羊肌内前体脂肪细胞增殖的影响提供重要的数据支撑.

基于CRISPR/Cas9技术构建猪KLF4基因敲除细胞系及其对细胞活性的影响分析

【目的】试验旨在利用CRISPR/Cas9技术构建Krüppel样因子4(Krüppel-like factor 4,KLF4)基因敲除的猪小肠上皮细胞,并探究KLF4基因敲除对于细胞活性和细胞周期的影响。【方法】在猪KLF4基因转录本第1外显子区域设计3条sgRNAs(sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3),经退火形成的双链DNA与线性化pGK1.1载体连接,产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞进行鉴定,并将重组载体转染至猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)。PCR扩增敲除位点附近序列,并通过测序判断sgRNA敲除效率;利用CruiserTMEnzyme酶切鉴定阳性细胞克隆,通过TA克隆测序鉴定敲除序列;利用Western blotting检测基因敲除细胞中KLF4蛋白表达情况。利用CCK-8和流式细胞术检测KLF4基因敲除后细胞活性和细胞周期的变化。【结果】重组载体测序结果显示,sgRNAs与pGK1.1成功连接。分析敲除效率发现,3个sgRNAs均可对靶序列进行敲除,其中sgRNA3有较高的敲除效率。PCR产物经CruiserTMEnzyme酶切筛选出2个阳性单克隆细胞。TA克隆测序分析发现,KLF4基因2个等位基因序列分别缺失116和137 bp。Western blotting结果表明,KLF4基因敲除细胞中未见KLF4蛋白表达。细胞活性及细胞周期分析显示,敲除KLF4基因极显著抑制了细胞活性(P<0.01),并导致G0/S细胞周期阻滞。【结论】本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了KLF4基因敲除的IPEC-J2细胞,且KLF4基因敲除可抑制细胞活性,并引起G0/S细胞周期阻滞。KLF4基因敲除细胞可为进一步探究KLF4基因功能及分子机制提供材料。

小鼠Klf11基因真核表达载体的构建、结构功能预测与初步验证

【目的】旨在克隆小鼠Kruppel样转录因子家族成员11(KLF11)基因并构建其真核表达载体,在小鼠AML12肝实质细胞系中过表达Klf11后探究其对脂代谢相关基因的调控作用。【方法】以小鼠肝脏组织cDNA为模板,通过PCR扩增小鼠Klf11基因的蛋白编码区(CDS),随后将其连接至pcDNA3.1-Puro-N-3HA载体,构建重组质粒。利用酶切、PCR及测序对重组质粒进行鉴定,将鉴定正确的质粒命名为pcDNA3.1-mKLF11。利用在线软件对Klf11序列及其编码蛋白进行生物信息学分析。使用免疫组化技术检测KLF11在小鼠肝脏组织中的表达。将pcDNA3.1-Puro-N-3HA与pcDNA3.1-mKLF11质粒分别转染至HEK293T和AML12细胞,利用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)和蛋白质印迹技术(Western blotting)对小鼠Klf11基因的表达效果进行检测。最后通过qPCR和油红O染色,检测游离脂肪酸(FFA)处理后Klf11的过表达对AML12细胞脂质代谢的影响。【结果】(1)PCR、酶切及测序结果显示,成功克隆了小鼠Klf11基因的CDS区片段并构建了pcDNA3.1-mKLF11重组质粒;(2)生物信息学分析结果显示,小鼠Klf11基因的编码区序列与大鼠和人类的相似性较高,小鼠KLF11蛋白表现出亲水性特征,二级结构包括无规卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角,不存在信号肽,且不存在跨膜区;小鼠KLF11蛋白的三级结构与人类和大鼠的KLF11蛋白相比均存在显著差异;(3)免疫组化结果表明,KLF11主要表达于小鼠肝细胞细胞核;(4)qPCR和Westren blotting结果显示,在HEK293T和AML12细胞中,pcDNA3.1-mKLF11转染组Klf11基因的mRNA和蛋白表达水平均显著高于对照组;此外,在FFA处理的条件下,Klf11过表达后小鼠AML12细胞中脂代谢相关基因Fasn、Acaca和Plin2的表达量显著升高,并且过表达组中细胞内脂滴数量增加。【结论】成功构建了小鼠Klf11基因的真核表达载体,对小鼠Klf11基因及其编码蛋白进行了生物信息学分析。免疫组化结果表明KLF11主要表达于小鼠肝细胞细胞核。此外,在AML12细胞中成功过表达KLF11蛋白,并证明Klf11的过表达显著促进了AML12细胞的脂质沉积,为后续探究Klf11基因调控哺乳动物肝脏脂质代谢的作用机制提供依据,为开发家畜脂质代谢障碍疾病防治的新药物提供新思路。

miR-10b通过激活KLF4/Notch-1/STAT3信号途径加速腹主动脉瘤的进展

目的:miR-10b促进动脉瘤的进展但其机制未明确,本实验通过检测miR-10b对KLF4/Notch-1/STAT3途径的影响阐明其机理。方法:双荧光素酶实验验证miR-10b的靶基因。取20只apoE-/-小鼠构建腹主动脉瘤模型,其中10只尾静脉注射miR-10b过表达的慢病毒,分别记为模型组和miR-10b组。另取10只apoE-/-小鼠作为假手术组,28 d后解剖小鼠腹主动脉行病理学染色、Western-blot实验。将血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)作用后的THP-1巨噬细胞根据是否转染miR-10b mimic及其Nc对照、是否添加抑制剂分组:(1)Nc组;(2)miR-10b mimic组;(3)Nc+KLF4抑制组;(4)miR-10b mimic+KLF4抑制组;(5)Nc+Notch-1抑制组;(6)miR-10b mimic+Notch-1抑制组;(7)Nc+STAT3抑制组;(8)miR-10b mimic+STAT3抑制组,检测细胞内蛋白水平。结果:检测双荧光素酶活性得知miR-10b可靶向作用于基因KLF4。小鼠血管病理实验发现,与正常小鼠相比,动脉瘤模型小鼠的血管明显增粗、组织结构异常,miR-10b可加重血管病变;CD68+巨噬细胞、蛋白Notch-1、p-STAT3、MMP-2、MMP-9在假手术组、模型组与miR-10b逐渐增多,而α-SMA、蛋白KLF4逐渐减少。(1)、(2)两组细胞间,后者KLF4表达较少、而Notch-1、p-STAT3、MMP-2、MMP-9表达显著偏多;KLF4抑制剂抑制KLF4表达,而Notch-1显著增多;Notch-1被抑制而减少表达,p-STAT3也随之减少;p-STAT3被抑制表达,MMP-2与MMP-9表达量也明显降低。结论:miR-10b通过作用于KLF4/Notch-1/STAT3信号途径,引起动脉瘤组织中MMP-2、MMP-9表达增加,从而加速动脉瘤的进程。

NaNO_(2)对HDM预处理的气道上皮细胞氧化损伤的影响及其机制

目的探究NaNO_(2)对经屋尘螨(house dust mite,HDM)预处理的人支气管上皮细胞氧化损伤的影响及其机制。方法体外培养人支气管上皮细胞16HBE,经HDM预处理后用不同浓度NaNO_(2)染毒处理,CCK-8检测细胞存活率,确定NaNO_(2)最适浓度及处理时间;将细胞接种于6孔板中随机分为3组(n=3):正常对照组、HDM组(HDM预处理)、NaNO_(2)组(HDM预处理后进行NaNO_(2)染毒处理)。Western blot和RT-PCR检测各组细胞Krüppel样锌指转录因子2(Krüppel-like transcription factors 2,KLF2)、低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)和Notch1的表达水平;ELISA法检测细胞炎症因子白介素-6(interleukin-6,IL-6)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)的表达水平;荧光探针法检测细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平;微量法测定丙二醛(malondialdehyde,MDA)与谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量。结果CCK-8实验确定NaNO_(2)最适干预方式为500μmol/L处理24 h。与正常对照组比较,HDM组KLF2蛋白和mRNA水平减少,HIF-1α蛋白和mRNA水平(P<0.01)、Notch1的蛋白(P<0.05)、mRNA水平和ROS含量升高(P<0.01),MDA、TNF-α和IL-6含量均增高,GSH含量降低(P<0.05);与HDM组比较,NaNO_(2)组KLF2蛋白和mRNA水平明显减少,HIF-1α蛋白和mRNA水平(P<0.01)、Notch1的蛋白(P<0.05)和mRNA水平、ROS含量显著升高(P<0.01),MDA(P<0.05)、TNF-α(P<0.001)和IL-6含量显著增高,GSH含量明显减少(P<0.05)。结论NaNO_(2)可能通过调控KLF2的表达加重HDM诱导的人支气管上皮细胞氧化应激损伤。

花斑裸鲤红细胞发育相关基因KLF17启动子区域互作蛋白筛选

为了进一步解析鱼类在高原低氧环境下的适应性进化机制,确定相关基因KLF17是否在红细胞发育过程中发挥功能。将高原裂腹鱼亚科鱼类的代表物种——花斑裸鲤(Gymnocypris eckloni)作为实验对象,以实验室前期花斑裸鲤全基因组测序数据为基础,鉴定出红细胞发育相关基因KLF17启动子序列,以其启动子DNA为诱饵,对花斑裸鲤肾脏组织蛋白进行筛选,采用LC-MS/MS技术对候选结合蛋白进行鉴定分析,并进行生物信息学分析。结果表明,在花斑裸鲤肾脏组织中共筛选到576个与KLF17启动子区域特异性结合的蛋白,去除未能鉴定到的蛋白,共有306个候选结合蛋白,其中包括真核翻译起始因子2、细胞色素P450酶、转铁蛋白、含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶、丙酮酸脱氢酶、红细胞膜蛋白带4.1蛋白等与红细胞或造血相关的蛋白。GO功能富集分析表明,这些候选结合蛋白涉及多种生物学功能,包括参与细胞生长、细胞周期、免疫反应、信号传导、核酸与转录因子结合等过程。KEGG通路分析表明,以上蛋白参与多条信号通路,包括氨基酸代谢通路、细胞凋亡信号通路、PPAR信号通路、Hippo信号通路、细胞色素P450代谢信号通路、HIF-1信号通路及神经营养因子信号通路等。研究筛选出的KLF17启动子候选结合蛋白主要有参与红细胞发育相关的真核翻译起始因子2、细胞色素P450酶、转铁蛋白等,经过功能分析发现它们参与HIF-1信号通路,通过调控血红素、珠蛋白基因表达、铁代谢、血管生成、糖酵解等途径激发红细胞的生成与发育,提示KLF17在转录水平上参与调控红细胞中血红素、铁和珠蛋白间的相互作用,为红细胞分化机制研究提供重要信息。同时,转铁蛋白作为参与铁和氧调节的交叉调控因子,它能够促进血液中铁的运输和增强血氧的结合能力,使得机体在低氧环境中长期生存,这也揭示了花斑裸鲤的低氧适应机制与HIF-1下游的转铁蛋白有关。研究可对下一步验证该蛋白与KLF17的互作机制提供研究基础,为解析高原土著鱼类造血系统发育和低氧环境适应性进化的分子机制提供科学数据。

基于KASP技术快速检测略阳乌鸡MSTN和KLF7基因SNP及其与体质量性状关联性分析

为高效、低成本对略阳乌鸡SNP变异位点进行准确分型并评价其选育效果,采用KASP技术对略阳乌鸡群体MSTN基因外显子1的g.233A>G位点和KLF7基因内含子2的g.1022C>T位点,进行连续四个世代SNP多态分析。结果显示:MSTN基因检测到AA、AG、GG 3种基因型,KLF7基因检测到CC、CT、TT 3种基因型;两个位点均为中度多态,MSTN基因位点P1代、KLF7基因位点P3和P7代偏离Hardy--Weinberg遗传平衡状态,其余各代均处于平衡状态;体质量与多态位点关联分析表明,MSTN基因位点AA型体质量显著高于AG和GG型,KLF7基因位点杂合型体质量显著高于纯和型,且体质量性状随世代显著提高(P<0.05),研究结果表明经过世代选育后略阳乌鸡体质量性状选育效果显著,同时表明两个位点均可以作为略阳乌鸡肉用性状选育的有效选择位点。

水牛KLF 15基因克隆、分子特征和组织差异表达分析

【目的】试验旨在获取水牛Krüppel样因子15(Krüppel-like factor 15,KLF15)基因,分析其分子特征和组织差异表达,初步揭示该基因的结构和功能。【方法】克隆水牛KLF 15基因编码区,对该基因的结构、氨基酸序列一致性、理化特性、基序、保守结构域、生物学功能等进行比较分析,并采用实时荧光定量PCR法检测KLF 15基因在水牛各组织中的表达水平。【结果】克隆得到水牛KLF 15基因编码区长为1212 bp,编码403个氨基酸。生物信息学分析显示,水牛KLF15与其他牛科物种氨基酸序列的一致性较高,是核内的亲水性蛋白,无信号肽序列及跨膜结构,包含KLF15_N、COG5048和zf-C2H2锌指结构等保守结构域。水牛KLF15的主要功能是调控DNA转录、结合DNA、结合锌指结构等。KLF 15基因在泌乳期水牛的脂肪中表达量最高,在非泌乳期水牛的肌肉中表达量最高,但在2个时期的水牛中均为在乳腺、心脏、肝脏、脾脏等组织中中度表达,在肺脏、肾脏、瘤胃和小肠等组织中低表达或几乎不表达。【结论】水牛KLF15是细胞核内的蛋白,可结合锌指结构调控DNA的转录,在脂合成旺盛的组织中发挥功能。