Formation mechanisms of ethyl acetate and organic acids in Kluyveromyces marxianus L1-1 in Chinese acid rice soup

This study aims to explore the formation mechanism of ethyl acetate and organic acids in acid rice soup(rice-acid soup)inoculated with Kluyveromyces marxianus L1-1 through the complementary analysis of transcriptome and proteome.The quantity of K.marxianus L1-1 varied significantly in the fermentation process of rice-acid soup and the first and third days were the two key turning points in the growth phase of K.marxianus L1-1.Importantly,the concentrations of ethyl acetate,ethanol,acetic acid,and L-lactic acid increased from day 1 to day 3.At least 4231 genes and 2937 proteins were identified and 610 differentially expressed proteins were annotated to 30 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)pathways based on the analysis results of transcriptome and proteome.The key genes and proteins including up-regulated alcohol dehydrogenase family,alcohol O-acetyltransferase,acetyl-CoA C-acetyltransferase,acyl-coenzyme A thioester hydrolase,and down-regulated aldehyde dehydrogenase family were involved in glycolysis/gluconeogenesis pathways,starch and sucrose metabolism pathways,amino sugar and nucleotide sugar metabolism pathways,tricarboxylic acid(TCA)cycle,and pyruvate metabolism pathways,thus promoting the formation of ethyl acetate,organic acids,alcohols,and other esters.Our results revealed the formation mechanisms of ethyl acetate and organic acids in rice-acid soup inoculated with K.marxianus L1-1.

Integrative proteomic-transcriptomic analysis revealed the lifestyles of Lactobacillus paracasei H4-11 and Kluyveromyces marxianus L1-1 under co-cultivation conditions

Compared with the rice-acid soup inoculated with single starter,the synergistically intensifi ed rice-acid soup inoculated with Lactobacillus paracasei H4-11(L.paracasei H4-11)and Kluyveromyces marxianus L1-1(K.marxianus L1-1)contained more fl avor compounds.Organic acids mainly included L-lactic acid and the main volatile fl avor component was ethyl acetate.Moreover,the signal intensity of astringency and bitterness and the total concentration of volatile sulfur compounds were reduced.The combined analysis results of RNA sequencing(RNA-seq)technology and 4D label-free quantitative(4D LFQ)proteomics explained the fl avor formation pathways in rice-acid soup inoculated with L.paracasei H4-11 and K.marxianus L1-1.In L.paracasei H4-11,L-lactate dehydrogenase,phosphoglucomutase,acetate kinase,alcohol dehydrogenase and acetyl-CoA were up-regulated and D-lactate dehydrogenase and N-Acetyltransferase were down-regulated.In K.marxianus L1-1,Acetyl-CoA,acetaldehyde dehydrogenase,acyl-coenzyme A,N-acetyltransferase,and L-lactate dehydrogenase were up-regulated and hexokinase,alcohol dehydrogenase,and alcohol O-acetyltransferase were down-regulated.The above up-regulation and down-regulation synergistically promoted the formation of characteristic fl avor compounds(mainly L-lactic acid and ethyl acetate).Enzyme-linked immunoassay(ELISA)and parallel reaction monitoring(PRM)quantitative analysis respectively verifi ed that 5 key metabolic enzymes and 27 proteins in L.paracasei H4-11 and K.marxianus L1-1 were associated with the characteristic fl avor of rice-acid soup,as confi rmed by the quantitative results of 4D LFQ.

Kluyveromyces fragilis LFS-8611 β-D-半乳糖苷酶的摇瓶培养条件

脆壁克鲁维酵母(Kluyveromycesfragilis)LFS 8611合成的β D 半乳糖苷酶具有较高的催化半乳糖基转移反应活力.脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)LFS 8611细胞生长和β D 半乳糖苷酶的合成同步.该菌株生长和产酶的最适碳源为半乳糖,乳糖次之;最适氮源为蛋白胨F403;最适培养条件为:发酵培养基的初始pH值为7.0,摇床的转速为200r/min.培养基中碳源和氮源质量浓度对菌体生物量和β D 半乳糖苷酶活力有重要影响,以12mg/mL乳糖为碳源,16mg/mL蛋白胨(F403)为氮源,在最适培养条件下培养32h后,菌体生物量和β D 半乳糖苷酶活力分别为7.56g/L和18.83U/mL.

纤维素降解产物对Kluyveromyces marxianus 1727共发酵葡萄糖和木糖的影响

研究纤维素酸水解产生的4种副产物乙酸、甲酸、糠醛、5-羟甲基糠醛及发酵产物乙醇对Kluyveromyces marxianus 1727共发酵葡萄糖和木糖的影响。结果表明:5.0 g/L乙酸和1.0 g/L甲酸对葡萄糖和木糖共发酵具有明显的抑制作用;1.0 g/L糠醛和5-羟甲基糠醛基本不影响K.marxianus 1727发酵葡萄糖,且能够被K.marxianus1727转化为毒性相对较低的物质。由于5-羟甲基糠醛的转化速率慢,对K.marxianus 1727发酵木糖的抑制程度大于糠醛。乙醇对K.marxianus 1727发酵木糖具有抑制作用,当乙醇质量浓度大于20 g/L时,生物量及木糖利用率约是对照的44%和70%。

影响kluyveromyces fragilisβ-D-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的因素

研究了酶反应的温度、pH值、底物浓度和反应时间等对kluyveromycesfragilisβ-D-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的影响.结果显示,以乳糖为底物,kluyveromycesfragilisβ-D-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的最适温度为60℃,最适pH值为6.0.酶法合成低聚半乳糖的产率随着底物浓度增加而增加.kluyveromycesfragilisβ-D-半乳糖苷酶催化低聚半乳糖合成的初速度较快,随着反应时间延长,反应速率降低,反应20h酶反应达到平衡.以660mg/mL乳糖为底物,在最适酶反应条件下,酶法合成低聚半乳糖的产率为207.12mg/mL.

产乳糖酶酵母Kluyveromyces lactis培养产酶发酵条件的研究

通过正交试验和单因素试验确定了本实验室乳酸克鲁维酵母菌株产乳糖酶的发酵培养基组分(W/V,%)为乳糖8、葡萄糖0.5、酵母膏0.7、尿素0.15、KH2PO41.5、MgSO40.1、MnCl20.01,并考察了其发酵工艺条件,优化得到的最高产酶量平均达到1.930ONPGU/ml。

Kluyveromyces marxianus菊粉外切酶的制备及其水解菊粉的研究

采用超滤、DEAE-Cellulose阴离子交换色谱、SephadexG-100凝胶色谱等蛋白分离技术,从马克斯克鲁维酵母粗酶液中分离到2种菊粉外切酶Ⅰ(ExoⅠ)和Ⅱ(ExoⅡ)。经分步纯化后,酶活回收4.92%,纯化了51倍。用纯化的2种菊粉外切酶进行分解菊粉,ExoⅠ酶解菊粉的产物主要是果糖和少量葡萄糖;ExoⅡ酶解菊粉的能力很弱,只有少量的还原糖生成。结果表明,ExoⅠ是主要的菊粉外切酶。SDS-PAGE测定ExoⅠ的分子量为85ku。ExoⅠ水解菊粉的优化表明,在加酶量80 U/g、菊粉浓度10%、pH4.6条件下,50℃酶解8h,其酶解率达73.52%。菊粉外切酶快速水解菊粉的特性,为利用菊粉发酵生产燃料乙醇提供了条件。

一株Kluyveromyces lactis酵母胞内乳糖酶性质的研究

源自乳酸克鲁维酵母的β-半乳糖苷酶为胞内酶,其具有乳糖水解能力和半乳糖苷的转移作用。本实验运用单因素试验方法研究乳酸克鲁维酵母乳糖酶的性质。结果表明该酶在pH值为6.0~7.0和37℃~48℃间比较稳定,酶作用最适pH值在6.5,最适反应温度为43℃,Mn2＋、Mg2＋等对酶有明显的激活作用,而Zn2＋、Cu2＋等对酶活有抑制作用。该酶以ONPG底物的米氏常数为4.186mmol/L。

一株乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)发酵条件的优化及其胞内乳糖酶性质的研究

作为益生元的低聚半乳糖（Galacto-oligosaccharide,简称GOS）可促进肠道内乳酸菌和双歧杆菌的增殖,有利于人体健康。GOS是利用乳糖酶转移半乳糖苷的作用生成的。本实验通过正交试验研究了产乳糖酶乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis 2.1494）的培养条件及其乳糖酶的性质。结果表明,该株乳酸克鲁维酵母的最佳培养条件为：温度28℃,自然pH,接种量3%,乳糖添加量2%,装液量40mL,摇床转速80 r/m in,培养时间22h。在此条件下培养,乳糖酶比活力最高可达24.54U/mg。此酶最适温度为50℃,最适pH为6.6,最适底物浓度为0.6mol/L,在40℃以下,pH6.2-7.0具有较高的稳定性,Mn^2＋、Mg^2＋和Zn^2＋对该酶有一定的激活作用,而重金属Cu^2＋对该酶有强烈抑制作用。

中压液相色谱快速分离纯化Kluyveromyces fragilis β-D-半乳糖苷酶

应用AKTA explorer 100型中压液相色谱快速纯化工艺,系统分离纯化了脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)β-D-半乳糖苷酶。K.fragilis发酵生产的菌体细胞经过破碎、离心后的上清液中含有K.fragilis β-D-半乳糖苷酶。粗酶经过AKTA explorer 100中压液相色谱的HiprepR16/10 Source 30Q强阴离子交换柱和Hioad26/60 Superdex凝胶过滤色谱连续两步纯化,酶的回收率为27%,纯化倍数为42。纯化的K.fragilis β-D-半乳糖苷酶在垂直板十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上,呈现一条染色谱带,表明纯化的酶具有较高的纯度。K.fragilisLFS-8611 β-D-半乳糖苷酶相对分子质量约为60000。

Kluyveromyces marxianus发酵己糖和戊糖生产乙醇

对利用底物广泛的乙醇发酵菌株马克斯克鲁维(Kluyveromyces marxianus)DL1菌株与工业用乙醇发酵菌株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)6525利用己糖(葡萄糖、甘露糖、半乳糖)和戊糖(木糖、阿拉伯糖)的情况进行对比研究。结果发现:以己糖为底物时,K.marxianus DL1均表现出细胞生长快、乙醇得率高的特点;在不通气、糖20 g/L条件下,K.marxianus DL1的最大乙醇质量浓度均比S.cerevisiae 6525高出10%左右,细胞量及乙醇生产强度分别是S.cerevisiae 6525的近2和1.7倍。当以戊糖为底物时,K.marxianus DL1可以利用木糖和阿拉伯糖;在不通气、糖20g/L条件下,K.marxianus DL1利用木糖产木糖醇和乙醇,乙醇终质量浓度可达7.68 g/L,木糖醇质量浓度为9.12 g/L;以阿拉伯糖为发酵底物时,阿拉伯糖醇的产量可达6 g/L左右;而S.cerevisiae 6525不能利用戊糖。马克斯克鲁维酵母比酿酒酵母更适合纤维乙醇生产。

马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)对发酵乳蛋白、质构的影响

在以保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌为发酵剂的基础上,添加一定比例的马克思克鲁维酵母进行共同发酵,研究其对发酵乳发酵及后熟过程中pH、蛋白含量、各乳蛋白相对含量及质构的影响并研究其相关性,为开发添加马克思克鲁维酵母的新产品提供数据参考。结果表明,酵母能促进发酵乳凝乳,降低凝乳时间、显著降低发酵乳pH;酵母的添加降低了蛋白含量、增加了发酵乳中蛋白的水解情况,并对发酵与后熟过程中蛋白的代谢产生影响,其中对κ-酪蛋白影响显著,除此之外,添加酵母后增加了发酵乳硬度、稠度、黏性等,相关性分析表明,pH、蛋白含量、κ-酪蛋白、β-乳清蛋白、α-乳白蛋白与发酵乳质构具有显著相关性,且添加酵母后相关性增加。

脉冲磁场对Kluyveromyces fragilis生长及菊糖酶合成的影响

研究了脉冲电磁场对Kluyveromycesfragilis细胞生长和菊糖酶生物合成的影响.结果发现:94Hz,14mT,脉宽为1300μs,间歇时间为8700μs,上升和下降时间为200μs的矩形脉冲磁场的作用使菊糖酶活力提高了23%.这种脉冲电磁场对酶的诱导合成作用使菊糖酶的合成总量是对照样的136%.同时发现这种作用使对应菊糖酶mRNA合成量增大,而且菊糖酶mRNA合成量增大与菊糖酶生成量的增加相关.可以认为脉冲电磁场促进了Kluyveromycesfragilis菊糖酶基因的转录与表达.

产乳糖酶酵母Kluyveromyces marxianus发酵条件的研究

筛选得到一株产乳糖酶的马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus),通过正交试验和单因素试验确定了培养基(%)为乳糖8、尿素0.375、酵母抽提物0.35、KH2PO4 1.5、NaCl 0.01、MnCl2 0.01,并考察了发酵工艺,将产酶水平从21.6u/ml提高到120.5u/ml(500ml摇瓶)。

乳酸克鲁维酵母Kluyveromyces lactics整细胞催化苯乙酮制备(R)-1-苯乙醇工艺研究

在研究乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactics)生长特性基础上,确定了该菌株最佳碳源和用量为蔗糖23.8g/L,最佳氮源和用量为酵母浸粉10.0g/L;研究发现,与静息细胞催化相比,乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactics)在培养18h后添加底物苯乙酮催化更加有利于转化为(R)-1-苯乙醇;最后对苯乙酮催化工艺进行了5因素4水平的正交实验优化.结果表明,Kluyveromyces lactics细胞采用蔗糖23.0g/L,酵母浸粉10.0g/L,磷酸二氢钾2.0g/L,七水合硫酸镁1.5g/L,30℃条件下培养18h后,每隔4h分3次添加底物苯乙酮,底物容量为249mmol/L,整细胞催化24h,(R)-1-苯乙醇化学收率95%,光学收率均达到99.5%以上.

固定化渗透乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces Lactis)连续水解乳清的研究

研究了一种利用固定化渗透乳酸克鲁维酵母催化水解乳清中乳糖的技术,分析了制备工艺、水解条件对于固定化细胞活性的影响。结果表明,在细胞添加量为60%、交联剂为1%BaCl2,凝胶颗粒大小为1～1.5mm时,固定化细胞的活性可达到78.819 U/g,固定化细胞最适反应温度为36℃,最适pH值7.0,相对于游离细胞,固定化细胞在对温度及pH的适应性上均有所提高,具有较好的应用前景。此外初步探索了一种复合流速连续水解的工艺,即在水解不同阶段,采用了不同的流速进行水解。结果表明,这种复合流速连续水解工艺可以在一定程度上缩短水解时间,提高水解的效率。

Optimization of Medium Composition for Production of Recombinant Calf Chymosin from Kluyveromyces lactis in Submerged Fermentation

Response surface methodology was applied to optimize medium components for production of recombinant calf chymosin by Kluyveromyces lactis GG799.The previous data indicated that the most suitable carbon source,nitrogen source,salt and vitamin were glucose,yeast extract,KH2PO4 and Ca D-Pantothenate,respectively.The concentration of four media components were optimized by using central composite design of response surface methodology.The optimum medium composition for recombinant calf chymosin production was found to contain glucose 29.84 g· L-1,yeast extract 19.85 g·L-1,KH2PO4 0.1 g·L-1 and Ca D-Pantothenate 4.49 mg·L-1.The enzyme activity of recombinant calf chymosin was 722 U· mL-1,which was in an excellent agreement with the predicted value（723 U·mL-1）.The production of recombinant calf chymosin from Kluyveromyces lactis GG799 was effectively increased by response surface methodology.

不同预处理甘蔗渣混菌固态发酵制备生物发酵饲料研究

本研究以不同预处理后甘蔗渣为固态发酵培养基基质,利用可分泌纤维素酶的丝状真菌及单细胞蛋白生产菌进行混菌固态发酵,探究不同预处理甘蔗渣对生物发酵饲料品质的影响。结果显示:不同预处理的甘蔗渣对制备的生物发酵饲料营养价值影响较大,以甘蔗渣、瞬时蒸汽爆破处理后甘蔗渣及连续蒸汽爆破处理后甘蔗渣为固态发酵培养基的基质,均不利于黑曲霉、马克思克鲁维酵母对非粮生物质原料中纤维素和半纤维素的利用,制备的生物发酵饲料,其微生物蛋白含量低,营养价值低。以瞬时蒸汽爆破处理后甘蔗渣与连续蒸汽爆破处理后蔗渣组合为固态发酵培养基的基质,制备的生物发酵饲料,微生物蛋白含量高,粗蛋白质含量达到22.07%,氨基酸含量达到16.06%,马克思克鲁维酵母含量增加至7.4×10~8CFU/g,其营养价值高。

乳酸克鲁维酵母表面展示系统研究

酵母表面展示技术通过将目标蛋白锚定在细胞表面,广泛应用于疫苗制备、药物筛选、环境治理、菌株筛选等领域。为在乳酸克鲁维酵母中进行医药蛋白的高效生产并开展蛋白质工程研究,利用酿酒酵母来源的Sed1作为锚蛋白,His Tag作为检测靶标,在乳酸克鲁维酵母中进行表面展示系统的构建,并利用间接法免疫荧光标记和全细胞流式分析相结合的方法进行高通量表征。激光扫描共聚焦显微镜成像结果进一步证实了人血清白蛋白的成功表达。优化检测条件后,最高展示效率达89.8%。研究首次在乳酸克鲁维酵母中建立并系统优化了酵母表面展示系统,为在乳酸克鲁维酵母中开展高效蛋白质生产和蛋白质工程研究奠定了基础。

3株商业克鲁维酵母对贺兰山东麓赤霞珠干红葡萄酒增酸效果及酒品质的影响

为探究商业化的克鲁维酵母对葡萄酒增酸效果及酒品质的影响,以贺兰山东麓的赤霞珠葡萄为原料,选取了3株商业化的克鲁维酵母:2株耐热克鲁维酵母(Lachancea thermotolerans,1株商品名Excellence X-FRESH,简称“卓越X”;1株商品名ZYMAFLORE OMEGALT,简称“ZO”)和1株乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces thermotolerans,商品名CV E-7,简称“CV E-7”),将它们与酿酒酵母(商品名Excellence XR,简称“XR”)以10∶1的接种量进行顺序发酵实验。分析了3株克鲁维酵母对葡萄酒中有机酸含量、基本理化指标、香气成分组成及感官特性的不同影响。结果表明,卓越X酒样和CV E-7酒样具有显著的增酸效果,特别是乳酸的质量浓度有所提高。所有接种克鲁维酵母的葡萄酒的基本理化指标均符合GB/T 15037—2006要求。卓越X酒样和CV E-7酒样的紫红色色调有显著提高(P<0.05)。相比仅使用酿酒酵母的对照组酒样,混菌发酵制得的酒样中香气化合物种类更丰富,质量浓度更高,尤其是乳酸乙酯、高级醇和脂肪酸的总质量浓度有显著提高(P<0.05)。对OAV大于1的香气活性化合物进行主成分分析,表明卓越X酒样具有更丰富的酯类化合物、高级醇和脂肪酸;CV E-7酒样增加了癸醛、2,3-丁二酮、己酸异戊酯等化合物的质量浓度;ZO酒样中酯类化合物丰富并且异戊醇质量浓度较高。主观评价结果表明,卓越X酒样和CV E-7酒样的得分较高,其次是ZO酒样,最低是未混菌发酵的对照组。研究表明,3株商业克鲁维酵母对贺兰山东麓“赤霞珠”葡萄酒品质都具有积极影响,特别是卓越X和CV E-7的增酸效果良好,可作为贺兰山东麓低酸赤霞珠原料的增酸菌株。希望研究可为赤霞珠葡萄酒的增酸酿造技术提供参考,为葡萄酒品质的提高提供理论依据。