抗Ku及其他高频抗原抗体的鉴定思路

目的:通过对一例女性高频抗原抗体(抗-Ku)病例进行血清学鉴定及血型基因测序分析,为高频抗原抗体的鉴定提供一定思路。方法:运用血型鉴定、患者红细胞抗原鉴定、抗体筛选、抗体鉴定等方式检测该患者的血型及抗体。以巯基试剂处理后的血清与筛选细胞反应、患者血清与酶或巯基试剂处理的筛选细胞反应的方式来判断该抗体的类型及特点,采用基因测序的方法确定患者血型的基因型。结果:该患者血型为O型RhD^(+),其血清与抗体筛选细胞及抗体鉴定细胞在间接抗人球及盐水介质中的反应呈强反应性,且强度一致,自身阴性,直接抗人球蛋白弱阳性;其他血型为CcEe、Jk(a+b-)、P1-、Le(a-b-)、Lu(a-b+)、K-、k-、Kp(a-b-)。血清经2-ME处理后,在间接抗人球介质中仍与3组筛选细胞反应;血清与经木瓜酶、菠萝酶修饰后的筛选细胞反应强度不变,与巯基试剂DTT、2-ME处理后的筛选细胞反应为阴性。基因测序显示该患者KEL基因型为KEL*02N.24,为罕见的K0表型。结论:血清学试验和分子生物学实验鉴定出该患者为罕见的Kell-null血型(又称K0),该患者体内产生了IgG及IgM性质的高频抗原抗体抗-Ku。血清学方法及分子生物学方法在此类稀有血型及高频抗原抗体的鉴定中具有重要意义。

小麦TaKu70和TaKu80基因的克隆和分析

Ku蛋白与动植物细胞DNA损伤修复和辐射敏感性有着密切联系,其功能及表达正常与否,关系到细胞DNA双链断裂(DSBs)的修复能力。为研究Ku蛋白在小麦DNA损伤修复和对辐射敏感性中的作用,本实验室克隆了完整的小麦Ku70和Ku80 cDNA序列,分别命名为TaKu70和TaKu80。小麦TaKu70和TaKu80分别编码626个和706个氨基酸残基的Ku70/Ku80蛋白序列。多重序列分析表明小麦Ku70蛋白与水稻Ku70和拟南芥Ku70蛋白的同源性分别为94%和78%;小麦Ku80蛋白与水稻Ku80和拟南芥Ku80蛋白的同源性分别为85%和69%。结构域和功能分析表明小麦Ku70/Ku80蛋白含有Ku蛋白的核心组分———Ku70/Ku80-core结构域,以及只有真核生物Ku蛋白才有的vWA结构域。

猪带绦虫10ku蛋白基因在大肠杆菌中的表达及其初步应用

将猪带绦虫六钩蚴10 ku蛋白(TSO10)和囊尾蚴10 ku蛋白(CE10)的基因克隆到表达载体中,构建重组表达载体pGEX-4T-TSO10和pGEX-4T-CE10,经测序证明基因序列完全正确。重组表达载体转化大肠杆菌后诱导表达,用SDS-PAGE、Western-blot和薄层扫描检测表达产物。表达的目的蛋白纯化后用于血清样品ELISA检测。SDS-PAGE、Western-blot和薄层扫描检测结果表明,六钩蚴和囊尾蚴10 ku蛋白基因均能在大肠杆菌中成功表达,表达的融合蛋白的相对分子质量约为35 ku,并能被囊虫病人阳性血清所识别,具有反应原性,表达量分别占菌体蛋白总量的25%和30%。ELISA检测结果显示,10 ku蛋白可用于囊虫病的诊断。

猪旋毛虫不同发育时期虫体49ku ES抗原基因的克隆与序列分析

根据GenBank中已登录的猪旋毛虫49 ku ES抗原基因序列设计了1对引物,用SDS裂解液配合蛋白酶K方法从猪旋毛虫不同发育时期(成囊前期幼虫、肌幼虫、成虫)虫体中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增49 ku ES抗原基因,将目的基因定向克隆入pMD18-T载体,转化大肠埃希氏菌TG1。用PCR、限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ进行单、双酶切鉴定,阳性质粒的测序结果表明,成功克隆了猪旋毛虫不同发育时期虫体49 ku ES抗原基因。序列分析结果显示:49 kuES抗原基因大小为948 bp,基因的保守性很强,序列同源性比较高,不同发育时期之间的差异很小。

Ss-A/Ro核蛋白60 ku亚单位在胃癌多药耐药中的作用

目的:对Ro 60在胃癌多药耐药中的功能进行研究．方法:克隆Ro 60编码基因,构建Ro 60编码基因的正义真核表达载体,将其转导入SGC7901 细胞,应用半定量RT-PCR技术,对基因转染细胞进行鉴定,通过MTT法进行体外药物敏感性分析,借助流式细胞仪检测细胞内蓄积的阿霉素．结果:成功构建了Ro 60正义真核表达载体, 应用脂质体介导法将其转导入SGC7901,Ro 60真核表达载体转染SGC7901细胞后其表达量明显增加,体外药物敏感性试验提示其对长春新碱、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素、顺铂、阿霉素的敏感性减低,SGC7901细胞的IC50值 (mg/L)与未转染细胞和转染空白载体细胞相比,显著增加(2．28±0．11 vs 0．45±0．04,0．65 ±0．05;2．89±0．14 vs 0．61±0．21,0．90±0．11; 1．92±0．03 vs 0．54±0．03,0．75±0．21;1．41± 0．06 vs 0．45±0．03,0．54±0．03;0．28±0．03 vs 0．14±0．01,0．14±0．01;均P<0．01),细胞内阿霉素蓄积显著减少(56．30±2．49 mg/L vs 92．83 ±3．63,87．38±2．94 mg/L,P<0．01)．结论:Ro 60真核表达载体转染SGC7901细胞后显示了一些多药耐药的特性,提示Ro 60在胃癌多药耐药中发挥了一定的作用．

本地毛形线虫49 Ku ES蛋白结构基因的分子克隆及原核表达

提取Trichinella nativa(T.nativa)肌幼虫的总RNA,用RT-PCR方法扩增出了编码T.nativa 49 Ku ES蛋白的结构基因。基因克隆后测序,序列测定结果表明:目的基因TNPG长度为951 bp,核苷酸序列同已发表的Trichinella spiralis(T.spiralis)相应的序列P49同源性为97.68%,所推导的氨基酸序列同源性为95.24%。将目的基因TNPG插入到原核表达载体pET-30a的BamHⅠ酶切位点处,并转化到感受态表达菌中进行诱导表达。结果显示TNPG在原核表达菌BL-21中获得了高效表达,表达产物为40.8 Ku的融合蛋白,表达量达到菌体总蛋白的22.8%。通过Western blot分析,表达产物可以被小鼠T.nativa和T.spiralis阳性血清以及它们的中国地理株的小鼠血清特异性识别。

辐射敏感细胞ku80基因突变及其DNA结合活性研究

RT PCR克隆辐射敏感细胞及其亲本细胞的ku80基因cDNA ,发现辐射敏感细胞的ku80基因与双链断裂DNA末端相互作用的位置存在基因突变 ,用凝胶阻滞和DNA 蛋白质印迹进一步证实突变ku基因编码蛋白结合双链断裂末端DNA的能力下降 。

结核杆菌19ku脂蛋白的表达与纯化

目的:通过基因工程技术获得重组结核分枝杆茵19 ku蛋白。方法:应用PCR技术扩增卡介苗的19 ku蛋白DNA序列;以质粒pET28a为表达栽体,构建19 ku重组质粒,然后转化大肠埃希菌BL21(DE3);在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下,分别对不同诱导时间的表达产物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),凝胶经考马斯亮蓝染色检测蛋白。通过镍柱纯化后获得目的蛋白。结果:重组质粒pET28a-p19测序表明与报道的序列相同。它在大肠埃希菌BL21(DE3)细胞内以可溶性形式表达。不同IPTG诱导时间实验表明重组结核分枝杆茵l9 ku蛋白诱导4 h在大肠埃希菌中的表达量最高。结论:pET28a-p19大肠埃希菌工程株可高表达结核分枝杆菌重组19 ku蛋白。

本地毛形线虫49kuES蛋白结构基因在昆虫细胞中的表达

根据BAC-TO-BAC杆状病毒表达系统的供体质粒,设计表达引物,从克隆质粒上扩增本地毛形线虫(Trichinella nativa)49kuES结构蛋白基因TNPG,酶切后与供体质粒连接,在大肠杆菌中克隆,将克隆有外源基因的供体质粒转化DH10Bac感受态菌,该菌含有杆状病毒穿梭载体,供体质粒中的外源基因在辅助质粒编码的转座酶作用下,通过转座而插入杆状病毒基因组中,筛选含有重组质粒的Bacmid DNA,用脂质体介导法转染昆虫细胞获得重组病毒。SDS-PAGE电泳显示表达蛋白为36ku的融合蛋白,Western blot检测表明表达的融合蛋白能够被小鼠旋毛虫的阳性血清识别。实验结果表明,本地毛形线虫的ES融合蛋白的制备将在诊断方法的建立和免疫研究方面具有很好的应用前景。

Ss-A/Ro 60 ku亚单位变异体1在胃癌多药耐药中的作用

目的:对Ro 60变异体1在胃癌多药耐药中的功能进行研究.方法:克隆Ro 60变异体1编码基因,构建Ro 60变异体1编码基因的正义真核表达载体,将其转导入SGC7901细胞,应用半定量RT-PCR技术,对基因转染细胞进行鉴定,通过MTT法进行体外药物敏感性分析,借助流式细胞仪检测细胞内蓄积的阿霉素.结果:成功构建Ro 60变异体1正义真核表达载体:应用脂质体介导法将其转导入SGC7901,其表达量明显增加;体外药物敏感性试验提示,与SGC7901和SGC7901-pcDNA3.1细胞相比,转染细胞对长春新碱(IC_(50):2.87±0.10 mg/L vs 0.47±0.07 mg/L,0.63±0.08 mg/L,P<0.01)、5-氟尿嘧啶(IC_(50):3.89±0.12 mg/L vs 0.59±0.17 mg/L,0.92±0.12 mg/L,P<0.01)、丝裂霉素(IC_(50):1.02±0.06 mg/L vs 0.50±0.04 mg/L,0.73±0.09 mg/L,P<0.05)、顺铂(IC_(50):1.15±0.06 mg/L vs 0.46±0.04 mg/L.0.52±0.05 mg/L,P<0.01)、阿霉素(IC_(50):0.45±0.03 mg/L vs 0.15±0.03 mg/L,0.16±0.02 mg/L,P<0.01)的敏感性减低;流式细胞仪检测结果显示,转染细胞内阿霉素的蓄积减少(50.39±2.09 mg/L vs 94.99±4.07 mg/L,88.06±2.67 mg/L,P<0.01).结论:Ro 60变异体1真核表达载体转染SGC7901细胞后,显示多药耐药特性.

Ku基因在微生物中的研究进展

ku基因介导的非同源末端连接(NHEJ)途径是DNA双链断裂(DSBs)的一种修复机制,它不依赖于同源重组,且通过与之竞争而削弱同源重组。由于ku基因在生物进化过程中的高度保守性,其功能在很多微生物中已经得到研究,尤其在丝状真菌中,将ku基因敲除,在NHEJ途径缺陷的背景下,同源重组发挥主要作用,基因敲除的频率大为提高,从而方便了对基因功能的研究。

白纹伊蚊(广州株)唾液Aalb_56 ku基因克隆表达与免疫原性分析

探讨Aalb_56 ku基因在白纹伊蚊(广州株)不同组织中的表达差异;对唾液腺中Aalb_56 ku基因进行克隆表达并探索其免疫原性。采用实时荧光定量RT-PCR法对雌蚊中肠、脂肪体、唾液腺不同组织中Aalb_56 ku基因的表达差异进行分析。针对Aalb_56 ku基因序列设计特异性引物,以唾液腺RNA为模板获得56 ku全长基因序列,构建重组质粒并测序,将测序序列进行生物信息学和抗原表位预测分析。IPTG诱导表达,亲和层析法纯化重组蛋白;制备小鼠特异性抗Aalb_56 ku蛋白抗血清。结果显示,Aalb_56 ku在白纹伊蚊(广州株)唾液腺(SG)中高表达。克隆所获唾液腺56 ku基因全长1 593 bp,可编码530个氨基酸,信息学分析提示该基因含有信号肽序列,等电点为8.40,抗原表位预测提示含有23个表位。p ET30a(+)-56 ku重组质粒可表达约56 k Da大小的融合蛋白,且呈包涵体形式表达,Western blotting鉴定具有His标签。纯化蛋白免疫Balb/c小鼠后可获得1∶100效价的特异性抗血清,提示该重组蛋白具有一定的免疫原性。

乳牛布鲁氏菌病病原DNA快速检测技术的研究

在国内首次建立了乳牛原乳中布鲁氏菌外膜蛋白(OMP)25 ku基因套式聚合酶链反应(nested-PCR)检测技术。结果显示,本方法的特异性好,只能扩增布鲁氏菌DNA,而不能扩增同样能引起乳牛流产的鹦鹉热衣原体、弓形虫、胎儿弯杆菌DNA;乳样的检测灵敏度达50 CFU/mL,重复试验35次,可重复性和稳定性均十分理想;对 4 批 331 头凝集试验阳性(24 份)或阴性(307 份)乳牛的乳样用本方法检测,符合率为100%。在48 h内即可获得诊断结果。本方法同样可用于血液或其他流产病料中布鲁氏菌DNA的检测。

布鲁氏菌pcDNA3.1-omp17.3基因疫苗的研制

采用PCR方法扩增了布鲁氏菌17.3 ku外膜蛋白编码基因,并将该基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1-omp17.3。pcDNA3.1-omp17.3转染COS-7细胞后,通过Western-blotting检测到了17.3 ku蛋白的瞬时表达。将pcDNA3.1-omp17.3免疫小鼠,三免后经ELISA、流式细胞仪以及ELISPOT技术检测到pcDNA3.1-omp17.3在小鼠体内诱导产生了以Th1型为主的细胞免疫应答。结果表明,构建的基因疫苗可作为潜在的布鲁氏菌新型疫苗,有进一步研究的意义。

拟穴青蟹GRP78基因的克隆与应激表达

葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78 ku,GRP78)是热休克蛋白70家族成员之一,在调节蛋白质折叠和维持内质网稳态过程中起着分子伴侣作用。采用RT-PCR、RACE等技术,首次从拟穴青蟹获得了GRP78的cDNA全长序列。该序列全长2 284 bp,开放阅读框(ORF)为1 962 bp,编码653个氨基酸残基。同源分析显示,该基因编码的蛋白含有HSP70家族的签名序列,C末端为内质网蛋白滞留信号KDEL,与其他物种具有很高相似性。实时荧光定量PCR结果表明,GRP78基因在拟穴青蟹多个组织中均有表达。第一期仔蟹在不同的温度和盐度下暴露12 h后,GRP78基因表达量随环境温度升高而增加;在高盐(30)条件下GRP78表达量较高,进而推测拟穴青蟹GRP78参与蛋白质折叠和环境胁迫的应答。

小鼠FAAP蛋白对细胞黏附的影响

黏着斑相关蛋白(focal adhesion associated protein,FAAP)由小鼠D10Wsu52e基因编码,在进化上十分保守,但该蛋白质的生物学功能并不清楚.为此,首先通过细胞组分分离的方法研究了FAAP蛋白分布的细胞组分,结果表明FAAP主要存在于细胞质和细胞膜中.细胞蛋白表达量分析表明,细胞中FAAP与黏连蛋白受体(LR)表达量呈现正相关性.同时,细胞黏附实验表明,FAAP与LR对细胞黏附影响类似,也能够抑制细胞的黏附.这些实验结果为深入研究FAAP蛋白功能提供了依据.

The Construction of Schistosoma Japonicum Vaccine BCG-Sj26GST and Its Identification

Summary: The expression of foreign gene, Schistosoma Japonicum 26 ku antigen (Sj26GST), in Bacillus Calmette Guerin (BCG), Mycobacterium ( M. smegmatis ) and Escherichia coli ( E. coli ) were studied. The cDNA fragment encoding Sj26GST was amplified by PCR using plasmid pGEX, which could express Sj26GST in E. coli as template. The Sj26GST cDNA was cloned into the downstream of human M. tuberculosis heat shock protein (hsp) 70 promoter with correct reading frame, and then the DNA fragment containing hsp70 promoter and Sj26GST gene were subcloned together into E. coli Mycobacteria shuttle plasmid pBCG 2000 to construct the expression shuttle plasmid pBCG Sj26. The recombinant BCG and M. smegmatis mc 2 155, which were electroplated with pBCG Sj26, could express Sj26GST and the recombinant Schistosoma Japonicum vaccine BCG Sj26GST was made. The recombinant Sj26GST (rSj26GST) were soluble and could be observed on SDS PAGE at molecular weight of 26 ku. The content of rSj26GST accounted for 15 % and 10 % of total bacterial protein in BCG and M. smegmatis respectively. The results of Western blot showed the combination of rSj26GST with antibody of GST.

Increase of sulphur-containing amino acids in transgenic potato with 10 ku zein gene from maize

The 10 ku zein gene of maize was under control of patatin class I promoter of potato and transferred into potato genome by the leaf-disc method. The expression of 10 ku zein was determined in the tuber of transgenic plants by RT-PCR. Furthermore, the sulphur-containing amino acids in transgenic tuber increase remarkably.

Ku蛋白表达与鼻咽癌细胞放射敏感性关系初探

目的探讨不同放射敏感性鼻咽癌细胞株CNE-1（鼻咽高分化鳞癌细胞株）、CNE-2（鼻咽低分化鳞癌细胞株）中DNA依赖蛋白激酶（DNA—PK）的调节亚基Ku70、Ku80基因的表达与鼻咽癌细胞放射敏感性的关系。方法通过克隆形成实验测定CNE-1、CNE-2不同剂量的存活分数，并用线性二次模型拟合剂量存活曲线求出放射生物学参数α、β、SF2、MID值，以及四氮唑蓝比色分析法（MTT法）检测^60Co γ射线4Gy照射后的细胞群体生长情况，以评价两株细胞的放射敏感性。逆转录实时荧光定量PCR技术（RT-FQ-PCR）检测照射前、后不同时间及不同剂量CNE-1、CNE-2细胞mRNA水平Ku70、Ku80基因的定量表达。结果CNE-1在各个剂量点的存活分数均比CNE-2高，MID值分别为2．78、1．61，SF2值分别为0．627、0．341；4Gy照射后的存活率分别为88．2％、72．3％；RT-FQ-PCR显示两株细胞中均有Ku70、Ku80基因的表达，其相对表达量之比分别为1．76±0．54（P=0．07）、13．82±3．78（P=0．004），Ku80基因在CNE-2细胞中存在剂量依赖关系。结论实验验证了CNE-2比CNE-1对射线更敏感，Ku80基因的表达与鼻咽癌细胞的放射敏感性有关。

小鼠乳腺癌辐射敏感细胞SX-9的ku基因突变与辐射敏感性研究

目的 研究辐射敏感小鼠乳腺癌细胞SX 9的ku70、ku80基因型 ,初步探讨ku基因突变对其辐射敏感性的影响。方法 RT PCR克隆并鉴定ku70 /ku80全长基因 ,并对其全长进行全自动测序。脂质体转染正常人全长ku80cDNA至SX 9细胞 ,克隆形成比较转染了正常ku80基因的SX 9与SX 9以及SR 1细胞存活率。结果 SX 9细胞ku70基因正常 ,而其ku80存在基因突变 ,转染了正常人全长ku80cDNA的SX 9细胞能部分重建其对γ射线的存活率。结论 SX 9细胞ku基因发生突变 。