siRNA抑制Ku80表达后对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响

背景与目的:Ku80为细胞受辐射后DNA双链断裂(DNA doublestrand break,DSB)的主要修复蛋白。现阶段关于Ku80的研究主要集中在DSB修复方面,其他方面研究较少。本研究建立利用siRNA抑制Ku80表达的宫颈癌HeLa细胞模型,以此探讨Ku80在细胞增殖方面的作用。方法:构建靶向抑制Ku80的siRNA表达载体,转染HeLa细胞,筛选稳定表达siRNA的转化克隆;Western blot检测Ku80表达变化;克隆形成实验、MTT法和裸鼠皮下瘤形成实验分别检测细胞克隆形成率及细胞在体外和体内的增殖情况。结果:构建表达质粒pKu80-siRNA与pNeg-siRNA转染HeLa细胞,G418筛选后获得稳定转染克隆,Western blot分析表明转染pKu80-siRNA后的细胞Ku80蛋白表达受到明显抑制,将其命名为HeLa/Ku80-siRNA;转染pNeg-siRNA的HeLa细胞克隆形成率为0.62±0.02,而HeLa/Ku80-siRNA细胞的克隆形成率为0.46±0.05,明显低于对照细胞(t=5.11,P<0.01);MTT显示细胞培养48h和72h时,HeLa/Ku80-siRNA细胞的增殖率均显著低于对照细胞(P<0.05);裸鼠皮下瘤生长实验示种植25天时,HeLa/Ku80-siRNA细胞种植瘤的平均体积为(18.92±3.60)mm3,明显低于对照细胞种植瘤体积(194.88±30.61)mm3,(t=12.69,P<0.01)。结论:稳定转染及siRNA技术建立的Ku80表达抑制克隆可以成为简单实用的细胞模型;Ku80-siRNA抑制Ku80的表达后可以在体内外抑制HeLa细胞的增殖。

反义Ku80在人肺癌细胞的表达及对放射线的敏感性研究

目的 :研究反义Ku80在人肺癌细胞的表达及对放射线的超敏效应。方法 :采用Western blotting法证明 ,Ku80 LCA中Ku80蛋白的表达情况 ,采用体外放射线敏感实验证明 ,反义Ku80在人肺癌细胞的表达及对放射线的超敏效应 ,用细胞存活克隆率和剂量效应曲线表示。结果 :(1)对照组和导入正义Ku80的LCA细胞可见Ku80蛋白表达印迹 ,导入反义Ku80的LCA细胞未见Ku80蛋白表达印迹。 (2 )导入反义Ku80的LCA细胞对放射线的敏感性明显增强 (P <0 0 1) ,并呈剂量依赖性。结论 :反义Ku80封闭了肿瘤细胞的Ku80蛋白表达后 ,对放射线呈超敏效应 ,为提高肿瘤放疗的特异性和靶向基因治疗奠定了基础。

RNAi抑制Ku80表达后促进宫颈癌SiHa细胞的放射敏感性

背景与目的:Ku80为细胞受辐射致DNA双链断裂(DNA double-strand break,DSB)后的主要修复蛋白之一,Ku80的高表达预示着宫颈癌组织对放射线的抵抗,本研究运用RNAi技术抑制Ku80表达,观察宫颈癌Si-Ha细胞对X线敏感性的变化。方法:构建1个靶向抑制Ku80的siRNA表达载体和1个阴性对照质粒,稳定转染入SiHa细胞后Western blot和RT-PCR检测Ku80表达变化;6 MV X线照射10 Gy后20 h、28 h和48 h收集细胞,流式细胞术检测细胞凋亡率;克隆形成实验检测细胞D0、SF2和α等值。结果:构建表达质粒转染SiHa细胞经筛选后获得2个稳定转染细胞株,Western blot和RT-PCR分析表明转染pKu80-siRNA的阳性克隆Ku80在mRNA和蛋白质水平均受到明显抑制;X线照射28 h及48 h后,Ku80表达受抑细胞其凋亡率均显著高于转染阴性质粒组和空白对照组(P<0.05);Ku80受抑细胞的D0和SF2值分别为1.330和0.425,低于转染阴性质粒细胞(1.748和0.580)和空白对照细胞(1.835和0.597),α值为0.295,高于转染阴性质粒细胞(0.176)和空白对照细胞(0.188)。结论:运用RNAi技术可以有效抑制Ku80的表达从而促进SiHa细胞对X线的敏感性,Ku80可能是一个较理想的肿瘤分子治疗靶点。

Ku80蛋白在乳腺癌组织中的表达及其临床意义

研究Ku80蛋白在乳腺癌的表达及与临床病理特征的关系。方法:采用免疫组化法检测65例乳腺癌组织Ku80、ER、PR、HER-2和突变型p53表达水平。结果:65例乳腺癌标本中Ku80、ER、PR、HER-2、p53阳性率分别为78.5%、40.0%、53.8%、44.6%和32.3%。Ku80表达水平与肿瘤大小、ER、PR、HER-2和p53的表达水平有关(P<0.05),其中Ku80与HER-2密切相关(rs=0.319,P=0.010)。结论:Ku80表达水平与影响乳腺癌患者预后的生物学特征相关,特别是与HER-2关系密切;Ku80与HER-2之间可能存在调控通路。

端粒长度、MRE11和Ku80在再生障碍性贫血中的表达及其与发病相关性研究

目的:检测再生障碍性贫血(aplastic anemia,AA)患者骨髓单个核细胞的端粒长度、端粒相关蛋白MRE11和Ku80基因表达水平,探讨它们与AA发病的关系。方法:采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测40例AA患者和20例正常对照者骨髓单个核细胞中端粒长度、MRE11和Ku80 mRNA表达情况,并进行相关性比较。结果:AA患者端粒长度、MRE11 mRNA和Ku80 mRNA表达水平均较正常对照组明显降低(P<0.05);年龄≥45岁的AA患者及正常对照组分别较年龄<45岁的端粒长度明显缩短(P<0.05);年龄<45岁及年龄≥45岁的AA患者分别与同年龄段的对照组相比,端粒长度均明显缩短(P<0.05);端粒长度与MRE11 mRNA表达水平(r=0.054,P>0.05)和Ku80 mRNA表达水平之间无相关性(r=0.235,P>0.05)。MRE11 mRNA表达水平与Ku80mRNA表达水平之间呈正相关(r=0.863,P<0.05)。结论:端粒长度的改变在AA的发病及疾病进展中可能发挥着重要作用,MRE11和Ku80表达的降低可能参与了AA的发病过程。

靶向沉默Ku80增强顺铂诱导的人肺腺癌细胞凋亡

目的:观察沉默Ku80能否增强顺铂诱导的人肺腺癌耐药细胞的细胞凋亡。方法:首先采用RT-PCR、Westernblot方法比较Ku80在人肺腺癌亲代(A549)与耐药细胞系(A549/DDP)的表达水平;将Ku80siRNA及si-Scramble转染至A549/DDP细胞后,加药组转染后48小时加顺铂作用24小时;应用MTT法检测顺铂对各组细胞的抑制率,采用流式细胞仪检测凋亡率,Caspase-3活性检测试剂盒检测Caspase-3活化程度。结果:Ku80 mRNA、蛋白在A549/DDP表达水平显著高于其亲代A549;si-Ku80组A549/DDP细胞的Ku80的mRNA、蛋白表达水平下调;顺铂对si-Ku80组细胞的抑制率明显高于si-Scram-ble组与Control组;在6μg/ml顺铂作用24小时后,si-Ku80组细胞凋亡率及Caspase-3活化程度高于si-Scramble组和Control组(P<0.05)。结论:靶向Ku80siRNA导入人肺腺癌耐药细胞特异性下调Ku80的表达,增强顺铂诱导的人肺腺癌耐药细胞凋亡作用。

用Ku80 siRNA抑制Ku80基因表达以提高肺癌细胞放射敏感性的实验研究

目的探讨用小RNA干扰抑制Ku80基因表达以提高A549肺癌细胞的放射敏感性。方法设计并化学合成Ku80siRNA,转染体外培养的A549肺癌细胞。利用RT-PCR和Western blot分别从mRNA和蛋白质水平对转染后的细胞Ku80基因表达情况进行测定,同时上述转染的细胞分别照射2、4、6、8及10Gy,利用克隆形成实验测定放射敏感性的变化。结果 RT-PCR检测显示在A549肺癌细胞转染Ku80siRNA后24、48和72h三个时间点Ku80mRNA含量减少,Western blot分析显示在转染48和72h两个时间点Ku80蛋白含量减少,与对照组比较有统计学差异(P<0.05)。克隆形成实验提示A549肺癌细胞转染Ku80siRNA后放射敏感性增强。结论 Ku80siRNA转染A549肺癌细胞后能够有效抑制Ku80基因表达,提高其放射敏感性。

Ku80在鼻咽癌中的表达及其临床意义

目的:探讨Ku80在鼻咽癌中的表达及其临床意义。方法:采用免疫组化SP法检测223例鼻咽癌石蜡标本中DNA-PK的三个亚基Ku80的表达情况,并结合患者的临床及预后资料分析其相关性。结果:Ku80在鼻咽癌组织中的过表达率为44%。Ku80表达强弱与患者的性别、年龄、病理分型无显著相关(P>0.05),与TNM分期、N分期、M分期有关(P<0.05)。单因素Kaplan-Meier生存分析显示,Ku80过表达组总生存率低于低表达组,Ku80对总生存率的影响有趋势,但尚未达到统计意义(P=0.141)。结论:Ku80在大部分鼻咽癌组织中的均有表达;Ku80与鼻咽癌的转移行为有关;初步研究未发现Ku80表达与鼻咽癌预后存在显著相关性,但有必要扩大样本进一步深入研究。

Ku70和Ku80基因在系统性红斑狼疮患者皮肤上的表达

目的 :研究Ku70和Ku80基因在系统性红斑狼疮 (systemiclupuserythematosus,SLE)患者皮肤表达的变化及其与SLE发病的关系。方法 :利用Ku70、Ku80地高辛标记的cDNAs探针对皮损区、非皮损区及正常对照皮肤进行原位杂交。结果 :Ku70、Ku80mRNAs的表达量从高到低依次为SLE皮损区、SLE非皮损区、正常皮肤。另外还发现在皮肤的层次上真皮浅层单一核细胞Ku70、Ku80mRNAs表达量高于表皮基底层细胞、表皮棘细胞层和颗粒层细胞。结论 :Ku70、Ku80mRNAs的表达在SLE患者皮肤上发病区高于非发病区 ,更大于正常皮肤。Ku70、Ku80mRNAs表达的变化与SLE的发病有关 。

Ku80分子克隆在人肺癌细胞的表达及生物学意义

目的：研究Ku80基因分子克隆在人肺癌细胞的表达及生物学意义。方法；用分子克隆的方法构建重组的正义、反义Ku80基因表达质粒，导入人肺癌细胞后，用Northem－blotting法和Western－blotting法证明Ku80正义、反义基因在mRNA和蛋白水平的表达情况。结果：（l）正义或反义Ku80克隆阳性的LCA细胞在mRNA水平均有正义或反义Ku80的表达印迹。（2）仅在正义Ku80克隆阳性的LCA细胞有正义Ku80蛋白表达印迹；而反义Ku80克隆阳性的LCA细胞无Ku80蛋白表达印迹。结论：正义或反义Ku80基因的分子克隆可在人肺癌细胞的mRNA得到表达，正义Ku80克隆阳性的LCA细胞有正义Ku80蛋白表达，反义Ku80基因可封闭肿瘤细胞的正义Ku80蛋白的表达。此结论为将Ku基因作为肿瘤靶向基因治疗提供了实验依据。

DNA-PK亚单位Ku70、Ku80在不同分期乳腺癌中的表达情况

目的探讨不同期别乳腺癌组织中DNA依赖蛋白激酶(DNA dependent protein kinase,DNA-PK)的两个调节亚单位Ku70、Ku80的表达变化情况.方法采用免疫组化SP法检测Ⅰ～Ⅳ期乳腺癌组织各30例中的Ku70、Ku80的表达情况.结果Ku70、Ku80在Ⅰ期乳腺癌组织中呈高表达,在Ⅱ期中的表达有降低趋势(与Ⅰ期比较P<0.01,与Ⅲ期比较P>0.05,与Ⅳ期比较P<0.01),在Ⅲ、Ⅳ期乳腺癌组织中的表达明显低于Ⅰ期乳腺癌(P<0.01;P<0.01).结论Ku70、Ku80在不同阶段乳腺癌中的表达情况是随着乳腺癌的分期变化而变化,从早期、中期到晚期呈逐渐降低趋势,可能与乳腺癌的分期及预后有一定相关性.

Ku80 表达抑制联合热疗对前列腺癌细胞放射敏感性影响的研究

目的探讨抑制PC3细胞中Ku80表达水平并结合热疗对前列腺癌细胞的辐射敏感性的影响。方法构建调节Ku80表达的siRNA载体,筛选转染后的PC3-Ku80(Ku80组)、PC3-β-actin(Vector组)、PC3-Ku80-siRNA(RNAi组)、PC3-β-actin-siRNA(Scramble组)等4种稳定细胞株。在不同的条件下分别用γ射线照射后行Annexin V-FIC双染色及DAPI、TUNNEL染色检测细胞周期与凋亡情况,另取一组PC3-Ku80-siRNA细胞经42℃水浴30min,转37℃细胞培养12h再行射线照射,通过细胞周期与凋亡检测等了解不同组间放射效果的差异。结果 Western blot和RT-PCR分析表明转染后可明显调节PC3细胞中Ku80的表达,稳定转染的对数生长期细胞经γ射线照射,细胞周期与凋亡检测结果显示随着Ku80表达的降低,细胞对放射治疗更趋敏感,5组细胞随γ射线照射剂量的增加,细胞存活率下降,其中RNAi组的细胞存活率均低于对照组和Ku80组,5组比较差异有统计学意义(F=0.953,P<0.001)。PC3-Ku80-siRNA细胞经热休克处理后再行射线照射,其存活率明显低于未经热休克处理的细胞株。结论抑制前列腺癌细胞中Ku80蛋白表达水平,结合热休克,可明显提高肿瘤组织对放射治疗的敏感性,这可能是一个较为理想的综合治疗前列腺癌的方法。

短干扰RNA抑制人宫颈癌HeLa细胞Ku80基因表达

目的针对内源性Ku80基因序列体外构建短干扰RNA(siRNA)线性DNA转录载体,观察其在细胞内产生的siRNA对该基因表达的影响。方法构建的线性DNA转录载体经脂质体导入宫颈癌HeLa细胞内,转录产生21 bp的短双链siRNA,并用免疫印迹法分析Ku80基因在蛋白水平表达的情况。结果体外成功构建出siRNA线性DNA转录载体LS1/LAS1和LS2/LAS2;载体分别导入HeLa细胞内生成相应siRNA;与空白对照组比较,实验组均能特异性抑制Ku80基因的表达;其抑制效果和时间点与所选基因靶位相关。结论由线性DNA载体转录生成的siRNA在细胞内特异性抑制内源性基因表达,为Ku80用于肿瘤靶向基因治疗提供了一个新的实验依据。

Ku80在甲状腺乳头状癌组织中的表达及其临床意义

目的:探讨甲状腺乳头状癌组织中Ku80的表达水平及其与临床病理特征的关系。方法:收集22例甲状腺乳头状癌患者的组织蜡块,应用免疫组化检测甲状腺乳头状癌、癌旁组织中Ku80的表达,并分析Ku80表达与甲状腺乳头状癌临床病理特征的关系。结果:甲状腺乳头状癌组织中Ku80阳性表达率为63. 6%,癌旁组织阳性表达率为22. 7%,差异有统计学意义(P <0. 05); Ku80表达与患者的肿瘤TNM分期中T分期有关(P=0. 005),与患者年龄、性别、是否有淋巴结转移、肿瘤大小、发病部位及是否有其他合并症无显著相关性(P> 0. 05)。结论:Ku80在甲状腺乳头状癌中高表达,并与肿瘤T分期显著相关。

KU80蛋白在非小细胞肺癌中表达的临床意义

目的探讨KU80蛋白在非小细胞肺癌预后及其治疗效果中表达的临床意义。方法采用MaxvisionTM免疫组化法检测88例非小细胞肺癌的KU80阳性表达率的情况。结果 88例非小细胞肺癌KU80蛋白阳性表达率为54.5%,其阳性表达率与肿瘤的大小、淋巴结转移和治疗效果密切相关,其中肿瘤直径大于2cm组与小于2cm组的KU80阳性表达率结果差别具有非常显著性意义,有淋巴结转移组与无转移组KU80阳性表达率结果差别具有非常显著性意义,进展组、缓解组与稳定组KU80阳性表达率结果差别具有显著性意义;与病理分型和TNM分期无关。结论 KU80蛋白水平能预测非小细胞肺癌预后及其治疗效果,可临床指导个体化治疗。

Ku80基因在人A549肺腺癌细胞照射前后表达的对比研究

目的 探讨Ku80基因在人A549肺腺癌细胞中的表达水平.将A549肺腺癌细胞接种裸鼠,以不同强度的射线照射,探求Ku80蛋白和Ku80 mRNA在放射治疗前后水平变化.方法 利用免疫组化、荧光定量PCR方法检测经过不同强度的射线照射前后的A549肺腺癌细胞的Ku80蛋白含量和Ku80 mRNA的表达.结果 接种在裸鼠的A549肺腺癌细胞经过射线照射后同等时间（24、48h）,Ku80蛋白和Ku80 mRNA随着照射强度1、4、8Gy的增强而增加（P＜0.05）;经过4、8Gy射线照射后48h,测得A549肺腺癌细胞中的Ku80蛋白和Ku80 mRNA较同样强度射线照射后24h而增加（P＜0.05）.结论 人A549肺腺癌细胞的Ku80蛋白和Ku80 mRNA在一定的照射强度范围内随着照射强度的增强而增加,并在一定的时间范围内随着照射后时间的延长而表达增多,推测Ku80基因可能与肺腺癌细胞放射损伤修复有密切关系.

miR-577靶向Ku80调控小细胞肺癌细胞中PD-L1表面表达的机制研究

目的探讨DNA损伤引起小细胞肺癌细胞NCI-H1688中PD-L1表面表达的潜在分子机制。方法使用DNA损伤诱导剂ETP、CPT、APH处理小细胞肺癌细胞NCI-H1688后,检测细胞中PD-L1的蛋白水平和mRNA水平。通过高通量测序检测ETP、CPT、APH处理小细胞肺癌细胞NCI-H1688前后miRNA表达差异。过表达差异miRNA,检测细胞中PD-L1的mRNA水平。通过miRDB在线分析和荧光素酶报告实验寻找miRNA的靶标。结果ETP、CPT、APH诱导小细胞肺癌细胞NCI-H1688DNA损伤后,PD-L1的表达在mRNA水平和蛋白水平上均上升(P<0.05)。将ETP、CPT、APH处理小细胞肺癌细胞NCI-H1688后的高通量测序结果取交集后,共有11种基因的表达受到调控。敲低上述基因后发现,敲低Ku80时,PD-L1的表达上升(P<0.05)。过表达Ku80后,PD-L1的表达下降(P<0.05)。ETP、CPT、APH处理小细胞肺癌细胞NCI-H1688后,Ku80的mRNA水平下降(P<0.05),但是Ku80的启动子活性没有显著变化(P<0.05)。miRNA mimics过表达miRDB在线分析Ku80的潜在miRNA后,发现10种miRNA能够显著降低Ku80的表达(P<0.05)。ETP、CPT、APH处理小细胞肺癌细胞NCI-H1688后,miR-577的表达水平显著上升(P<0.05)。过表达miR-577后,Ku80的m RNA和蛋白水平均上升(P<0.05);敲低miR-577后,Ku80的mRNA和蛋白水平均下降(P<0.05)。过表达miR-577后,PD-L1的mRNA和蛋白水平均下降(P<0.05);敲低miR-577后,PD-L1的mRNA和蛋白水平均上升(P<0.05)。结论miR-577通过靶向DNA损伤应答蛋白Ku80 mRNA的3端非编码区以影响其翻译水平,最终提高了PD-L1在小细胞肺癌细胞NCI-H1688中的表达水平。

Ku80在人肺癌中的表达水平与放疗前后表达变化的实验研究

目的基于Ku80在辐射诱导的DNA修复中的作用,研究不同病理类型肺癌中Ku80的表达水平,并以人肺癌A549细胞接种裸鼠模型评估放疗对Ku80表达的影响。方法使用免疫组化及荧光定量PCR分别检测不同病理类型肺癌Ku80蛋白和mRNA的表达水平。将A549细胞接种到裸鼠上再以不同剂量的射线照射,并分别在24、48h后处死,用免疫组化及荧光定量PCR检测Ku80蛋白和mRNA的表达水平。结果肺癌组织表达的Ku80蛋白、mRNA水平高于正常肺组织(均P<0.01)。在肺癌亚组中,肺腺癌和鳞癌比小细胞肺癌表达更高的Ku80蛋白、mRNA水平(均P<0.01)。接种在裸鼠的人肺癌A549细胞经过不同剂量射线照射后Ku80 mRNA的表达增加,并具有剂量和时间依赖性。结论 Ku80在放疗引起的DNA破坏过程中起到重要的作用。肺鳞癌和腺癌的Ku80表达高于小细胞肺癌,这可能是肺鳞癌和腺癌放射敏感性逊于小细胞肺癌的原因之一。Ku80表达水平可能在预测肺癌的放射敏感性方面具有重要价值,可以成为肺癌放射增敏治疗的一个新靶点。

人非小细胞肺癌组织中Ku80 mRNA表达评价化学治疗敏感性的研究

目的:通过观察Ku80mRNA在人正常肺组织、未经化疗和多次化疗的非小细胞肺癌组织的定量表达情况,探讨Ku80是否可以预测和评价肺癌化学治疗的敏感性。方法:采用RT-PCR方法,以β-actin为内参照,检测、比较25例正常肺组织和51例肺癌患者肺组织中Ku80mRNA的半定量表达,以SPSS统计软件进行分析。结果:比较人正常肺组织组与未经化疗肺癌组和多次化疗肺癌组Ku80mRNA表达量的差别具有统计学意义,分别为P<0·05和P<0·01。未经化疗肺癌组与多次化疗肺癌组(n≥2)的Ku80mRNA的表达量相比具有统计学意义(P<0·05)。结论:正常肺组织和肺癌组织在Ku80mRNA表达量上具有统计学差异,并且Ku80mRNA表达量在肺癌组织中随化疗次数增加明显上升,提示Ku80mRNA定量表达可能成为对肺癌化疗的敏感性的预测和评价提供新的依据。

辐射敏感细胞ku80基因突变及其DNA结合活性研究

RT PCR克隆辐射敏感细胞及其亲本细胞的ku80基因cDNA ,发现辐射敏感细胞的ku80基因与双链断裂DNA末端相互作用的位置存在基因突变 ,用凝胶阻滞和DNA 蛋白质印迹进一步证实突变ku基因编码蛋白结合双链断裂末端DNA的能力下降 。